大容量(20L)过滤沿海海水样品

Biology

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Summary

此视频文件体积大(≥20 L)的过滤,微生物生物量,0.22μm的直径2.7μm之间不等,从水柱。

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Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large Volume (20L+) Filtration of Coastal Seawater Samples. J. Vis. Exp. (28), e1161, doi:10.3791/1161 (2009).

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Abstract

工作流程开始与下游微生物群落的沿海海域,养分和微量气体分析的集合。对于这种方法,样品均采自HMS施德Saanich入口经营甲板。此视频文件体积大(≥20 L)的过滤,微生物生物量,0.22μm的直径2.7μm之间不等,从水柱。使用单泵机组配有4个旋转磁头,两个20L样品可同时进行过滤。过滤是在延长旅行领域,或后立即一日游的回报。穿过每一个sterivex过滤装置,重要的是要记录的水量。为了防止生物膜之间的采样人次的形成,所有的过滤设备,必须用稀盐酸和去离子水冲洗,高压灭菌后立即使用。此过程将需要大约5个小时,加上清理的额外小时。

Protocol

  1. 设置过滤装置
    1. 要设置过滤装置,使用镊子放入一个档次的GF / D转换过滤器的预过滤器的公屋单位。松散地用手拧紧的住房。作为一个经验法则,不要过分拧紧或单位将泄漏一旦开始抽水。
    2. 请小心插入carboy没有接触它的内部管蒸压帽和连接管的carboy第。如果必要,请使用镊子引导carboy管。
    3. 通过蠕动泵外部的油管。
    4. 将预过滤器的公屋单位都管(即2%carboy单位)外部年底。用钳子拧紧连接。
  2. 海水过滤
    1. 要开始过滤海水,打开泵和流动速度设置为1。观察,以确保水是被抽在正确的方向。
    2. 允许加水500毫升,通过预过滤单元和成1升烧杯中自由流动。
    3. 关闭泵,和自由端的预过滤器安装在一个附加Sterivex的过滤器,男性露儿装修。用手拧紧的预过滤住房紧贴。
    4. 观看的预过滤器的外壳和连接之间的预过滤器住房和油管,导致该carboy。如果发生泄漏,打开泵和放松,并相应地重新拧紧预过滤住房。转动泵回。
    5. 4升烧瓶收集滤液。一旦他们都满了,空到一个干净carboy的烧瓶。一定要注意通过每一个过滤器的体积。收集滤液,可进一步处理,如病毒过滤,。
    6. 继续筛选,直到没有水留在carboys。通常的过滤时间4-5小时/ 20升carboy的范围,但是,这取决于生物质内水适量显着。
    7. 过滤完成后,切换泵的关闭和断开Sterivex过滤器。
  3. 储存过滤器
    1. 要存储的过滤器,首先驱逐任何剩余的水30-60毫升注射器。
    2. 使用吸液管,添加1.8毫升裂解液过滤器,保持在后来试剂的过滤器〜200 UL空间。
    3. 小块的封口膜密封的顶部和底部的Sterivex过滤器和标签的日期和样品标识的过滤器。
    4. 商店预先标记50毫升猎鹰管过滤器在-80 ° C
    5. 从房屋单位中删除的​​过滤器和它们放入标记含有裂解液2毫升50毫升猎鹰管。存放于-80 ° C。
  4. 净化
    1. 最后的清理,放入含有0.1 M盐酸烧瓶内carboy管
    2. 直接管,导致到原始carboy的4L瓶。
    3. 开关上的泵和3运行,通过运行在原有carboy收集流。
    4. 最后,灭菌水冲洗管。

代表性的成果:由两个Sterivix每个过滤器在0.22μm的和2.7μm的尺寸范围从大约10大号海水中含有微生物生物量的最终结果。这是存储在DNA提取裂解液和准备。此外,此过程中收集和生物量超过2.7微米的,专注于GF / D转换预过滤器。这也是存储在DNA提取裂解液和准备。如果采取额外的处理步骤,流过的0.22微米可以集中收集病毒分数以及。

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Discussion

当务之急是盐水中删除任何挥之不去的痕迹,否则将腐蚀设备后,使用湿毛巾擦拭长椅和泵。虽然过程很简单,时间要求,可广泛取决于生物质的浓度或在被筛选的样本碎片。

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Acknowledgments

我们要感谢支持沿海和公海水域低氧气地区正在进行的研究创新,不列颠哥伦比亚省知识发展基金和国家科学和工程研究理事会(NSERC),加拿大的加拿大基金会。提高妇女地位司的支持由NSERC,Killam和图拉基金会资助的微生物多样性和进化中心奖学金。

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Peristaltic pump Masterflex (Cole Palmer) 77913-20, 77200-62, 77200-04
Tygon LFL tubing Masterflex (Cole Palmer) 06429-24 For filtration apparatus
Hose clamps Cole-Parmer 0683204 For filtration apparatus
1/4” x 3/16” pipe adaptors Cole-Parmer 31702-20 For filtration apparatus
Polypropylene prefilter housing ADVANTEC 501200 For filtration apparatus
Metal luer fitting (Hose end to Male luer lock) Cole-Parmer 31507-27 For filtration apparatus
2“ Magnets For filtration apparatus
3 port carboy caps For filtration apparatus
GV 0.22 μm STERIVIX filters EMD Millipore SVGV01R5
47 mm diameter 2.7 μm GF/D filters Whatman, GE Healthcare 1823047
Lysis buffer Reagent 0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)
0.1 % HCl Reagent For post-filtration rinse
Autoclaved water Reagent For post-filtration rinse

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Comments

4 Comments

  1. Cool way to show off filtration protocols! Do your pre-filters ever clog?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 19, 2009 - 12:56 AM
  2. Hi Ian, We never have problems with pre-filter clogs but if microbial biomass is high, we do need to switch up the filters often.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 19, 2009 - 2:39 PM
  3. How much dŒs the filtration apparatus cost?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 1, 2009 - 4:46 AM
  4. For you is for free

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 18, 2011 - 4:45 PM

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