Zebrafish में लेंस प्रत्यारोपण और आँखों म्यूटेंट के विश्लेषण में इसके अनुप्रयोग

Biology

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Summary

लेंस विकास के अन्य ऊतकों के साथ बातचीत शामिल है. कई zebrafish आँख म्यूटेंट एक असामान्य रूप से छोटे लेंस के आकार के द्वारा विशेषता है. यहाँ हम एक लेंस प्रत्यारोपण के प्रयोग के लिए निर्धारित करें कि क्या इस phenotype आंतरिक कारण बनता है या ऊतकों है कि लेंस के चारों ओर के साथ बातचीत दोषपूर्ण कारण है प्रदर्शित करता है.

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Zhang, Y., McCulloch, K., Malicki, J. Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants. J. Vis. Exp. (28), e1258, doi:10.3791/1258 (2009).

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Abstract

लेंस ऑप्टिक [1,2] कप के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. एक मॉडल जीव के रूप में zebrafish का उपयोग, लेंस के विकास के बारे में सवालों को संबोधित किया जा सकता है. zebrafish आनुवंशिक अध्ययन के लिए छोटे आकार, उच्च उपजाऊपन, लघु जीवन चक्र, और देखभाल की आसानी सहित कई लाभप्रद विशेषताओं, की वजह से उपयोगी है. लेंस zebrafish में तेजी से विकास होता है. 72 HPF, zebrafish लेंस कार्यात्मक परिपक्व है [3] आनुवंशिक और आणविक प्रचुर मात्रा में संसाधनों zebrafish में अनुसंधान का समर्थन करने के लिए उपलब्ध हैं. इसके अलावा, zebrafish आँख की अन्य रीढ़ के उन लोगों के लिए समानता मानव दोषों के एक उत्कृष्ट पशु मॉडल [4-7] के रूप में इसके उपयोग के लिए आधार प्रदान करता है. कई zebrafish म्यूटेंट लेंस असामान्यताएं प्रदर्शन सहित कोशिका मृत्यु का उच्च स्तर, [8] जो कुछ मामलों में लेंस के ऊतकों की एक पूरी अध: पतन की ओर जाता है,

निर्धारित करें कि क्या लेंस असामान्यताएं आंतरिक कारणों के लिए या आसपास के ऊतकों के साथ दोषपूर्ण बातचीत के लिए कारण हैं, एक आँख जंगली प्रकार में एक उत्परिवर्ती लेंस का प्रत्यारोपण किया जाता है. का उपयोग आग पॉलिश धातु सुई, उत्परिवर्ती या जंगली प्रकार के लेंस ध्यान दाता जानवर से dissected हैं, और मेजबान में स्थानांतरित. जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती ऊतकों को भेद करने के लिए, एक ट्रांसजेनिक लाइन दाता के रूप में प्रयोग किया जाता है. यह पंक्ति लेंस सहित, सभी ऊतकों में झिल्ली बाध्य GFP व्यक्त. यह प्रत्यारोपण तकनीक zebrafish लेंस म्यूटेंट के अध्ययन में एक अनिवार्य उपकरण है.

Protocol

भाग 1: भ्रूण की तैयारी

इस प्रोटोकॉल में, हम जे जे xy प्रतीक का उपयोग करने के लिए एक काल्पनिक zebrafish लेंस उत्परिवर्ती निरूपित जाएगा.

  1. Zebrafish उपभेदों मानक मछली सुविधा की स्थिति में 14h light/10h अंधेरे चक्र पर 28.5 सी में रखा जाता है.
  2. शाम में, zebrafish तनाव जे जे xy की जगह पुरुषों और महिलाओं: अटल बिहारी / TU, उन्हें एक दूसरे से अलग विभक्त के साथ एक टैंक में tg (mGFP) . इस पार की संतान सभी ऊतकों में GFP transgene व्यक्त होगा, और दाताओं के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा. समानांतर में, एक ही प्रक्रिया का उपयोग करने के लिए गैर ट्रांसजेनिक जंगली प्रकार के पशुओं के बीच पार सेट. इस प्रयोग के उद्देश्य पर निर्भर करता है, एक पालतू जानवर दाताओं या मेजबान के रूप में जे जे xy ठिकाना जंगली प्रकार पार कर सकते हैं.
  3. एक घंटे के बाद सुबह में प्रकाश पर मुड़ता के भीतर, डिवाइडर को हटाने के लिए दोस्त के लिए मछली की अनुमति.
  4. 15-30 मिनट के बाद 100 x 15 मिमी पेट्री डिश में भ्रूण को इकट्ठा करने के लिए, उन्हें साफ है, और मध्यम (अंडे पानी) बदलने.
  5. एक 28.5 सी इनक्यूबेटर में वांछित समय तक भ्रूण रखें.
  6. जब प्रत्यारोपण के लिए तैयार है, chorion मैन्युअल तेज संदंश के दो जोड़े के साथ, हटाने और 0.2% EDTA में 30 मिनट के लिए कैल्शियम मुक्त ZFR में भ्रूण सेते हैं.

भाग 2: विच्छेदन सुइयों की तैयारी

  1. : प्रत्यारोपण प्रक्रिया सुइयों के दो प्रकार की आवश्यकता है, और एक मुँहफट सुई दाता लेंस कदम है और यह मेजबान में सम्मिलित करने के लिए प्रयोग किया जाता एक तेज एक, जो लेंस आसपास के ऊतकों में कटौती, chorion हटायें, और agarose से भ्रूण रिलीज के लिए प्रयोग किया जाता है. यहाँ हम आपको बताएंगे कि कैसे इन सुइयों बनाने के लिए होगा.
  2. सबसे पहले, एक पाश्चर विंदुक की नोक काट किया जाना चाहिए एक हीरे की चाकू का उपयोग कर. फिर एक गिलास पाश्चर विंदुक टिप है ताकि इसकी लंबाई के बारे में आधे के अंदर है में केशिका सम्मिलित करें. यह यह आसान गिलास में यह अगले चरण में पिघलने से तार टंगस्टन स्थिर करने के लिए कर देगा.
  3. फिर केशिका के खुले अंत में एक पतली तार टंगस्टन सम्मिलित करें. तार पर एक Bunsen बर्नर के साथ कांच पिगलो. संदंश का प्रयोग, धातु के तार के साथ स्थिर कांच छोर पकड़ जबकि अपने हाथ से सुई के दूसरे छोर घुमा. नरम कांच धातु के आसपास सर्पिल जगह में उत्साहित करना चाहिए.
  4. यदि आप एक कुंद टिप सुई बना रहे हैं, तो इस प्रक्रिया के अंत है. एक तेज सुई बनाने के लिए, एक Bunsen बर्नर पर 1-1.5 मिनट के लिए तार टंगस्टन, पकड़ बंद धातु जल है तो एक बहुत अच्छी टिप बनाया है. Microscropy.It द्वारा टिप की गुणवत्ता की जाँच एक अच्छा विचार के प्रत्यारोपण से पहले कुछ सेकंड के लिए लौ में दोनों सुइयों तुरंत बाँझ है है.

भाग 3: अभिकर्मकों की तैयारी

  1. कैल्शियम मुक्त Zebrafish है घंटी समाधान (ZFR) (116 मिमी NaCl, 2.9 मिमी KCl, 5 मिमी HEPES, 7.2 पीएच)
  2. EDTA कैल्शियम मुक्त Zebrafish घंटी समाधान (7.2 पीएच) में 0.2%
  3. कैल्शियम मुक्त ZFR में 1.2% agarose (कम गलनांक)
  4. कैल्शियम मुक्त ZFR में 0.2% agarose (कम गलनांक)
  5. प्रति लीटर भ्रूण माध्यम (7.0 पीएच, शामिल हैं: 10 मिलीलीटर हैंक्स समाधान # 1, 1ml हैंक्स समाधान # 2, 10ml हैंक्स समाधान # 4, 10ml हैंक्स समाधान # 5, 0.35 ग्राम सोडियम बिकारबोनिट, 2M के 300 उल एचसीएल, 500.000 पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन यू) Zebrafish बुक (ओरेगन प्रेस की विश्वविद्यालय, 2000) के रूप में.
  6. टंगस्टन तार, सोना मढ़वाया, 0.1mm व्यास, अल्फा Aesar
  7. केशिका ट्यूब, 1.0mm व्यास, विश्व प्रेसिजन उपकरण

भाग 4: ट्रांसप्लांटेशन प्रक्रिया

  1. एक प्लास्टिक अपकेंद्रित्र ट्यूब में, कैल्शियम मुक्त ZFR में 1.2% कम गलनांक agarose तैयार एक पानी के स्नान में 40 सी preheated.
  2. वांछित मंच (30 HPF, उदाहरण के लिए), एक पाश्चर पिपेट में भ्रूण लेने के लिए, धीरे धीरे उन्हें अपकेंद्रित्र ट्यूब में निष्कासित, और धीरे धीरे उन्हें अपकेंद्रित्र ट्यूब में निष्कासित और के बारे में 5 सेकंड के लिए सेते हैं. दाताओं और मेजबान अलग incubated होना चाहिए.
  3. एक विंदुक के साथ 1.2% agarose में अपकेंद्रित्र ट्यूब से भ्रूण और उन्हें एक 100mm polystyrene पेट्री डिश में दो समानांतर पंक्तियों में व्यवस्था, मेजबान और दाताओं को अलग रखने. उन्हें pipetting बाहर धीरे से और ध्यान से, अधिकांश भ्रूण agarose में अपने पक्ष पर झूठ होगा. तुम उन है कि इस स्थिति में झूठ नहीं बोल कुंद सुई का उपयोग इतना है कि आँख का सामना करना पड़ रहा है इससे पहले agarose solidifies नई दिशा की आवश्यकता होगी.
  4. Agarose 1.2% के लिए रुको करने के लिए जमना, और तब यह 0.2% कम पिघलने बिंदु agarose समाधान के साथ उपरिशायी.
  5. तेज सुई का प्रयोग, आंखों के आसपास किसी भी agarose निकालने के लिए, और बहुत सावधानी से मेजबान और दाता भ्रूण छोटे स्ट्रोक का उपयोग कर से लेंस बाहर कटौती. लेंस करने के लिए बस के पास पर्याप्त कटौती इतनी के रूप में इसे फाड़ करने के लिए नहीं सुनिश्चित करें, लेकिन यह भी तो आप मेजबान आँख के बाकी हिस्सों से बहुत अधिक ऊतक हटा नहीं है.
  6. मुक्त एक बार, लेंस माध्यम में तैरने लगते हैं. कुंद सुई का प्रयोग, ध्यान दाता धक्कालेंस के स्थान जहां मेजबान लेंस सामान्य रूप से होगा बस के ऊपर, और फिर इसे नीचे धक्का मुँहफट सुई के साथ आंख में. मेजबान लेंस खारिज हो सकता है.
  7. 1.2% agarose में 30-60 मिनट के लिए दाता और मेजबान भ्रूण छोड़ दें, तो उन्हें agarose से रिहाई तेज सुई का उपयोग, और उन्हें भ्रूण मध्यम के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली में स्थानांतरित. प्रत्येक भ्रूण एक अलग अच्छी तरह से कब्जा करना चाहिए. कुओं लेबल ठीक से इतना है कि यह स्पष्ट है जो मेजबान दाता जो मेल खाती है सुनिश्चित करें.
  8. 28.5 सी. सेते दाता व्युत्पन्न लेंस ही GFP प्रतिदीप्ति पर आधारित जानवर की unoperated ओर मेजबान लेंस से प्रतिष्ठित किया जा सकता है. धारा भी लेंस के आकार को मापने के लिए और तय है कि यह ठीक से अलग किया जा सकता है.

1 आंकड़ा
चित्र 1 एक तेज लेंस प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया सुई की कम बढ़ाई छवि. एक केशिका गिलास (बी) पाश्चर विंदुक (ए) में डाला जाता है, और एक पतली टंगस्टन तार (सी) केशिका के खुले अंत में डाला जाता है. तार पर गिलास एक Bunsen बर्नर के साथ नरम है. संदंश का प्रयोग, धातु के तार के साथ स्थिर कांच छोर पकड़ जबकि पाश्चर विंदुक के दूसरे छोर अपने हाथ से घुमा. नरम कांच धातु के आसपास सर्पिल, यह जगह में उत्साहित होना चाहिए.



चित्र 2 सुइयों के दो प्रकार के लेंस प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल के टिप्स.


चित्रा 3
चित्र 3 भ्रूण 30hpf पर लेंस प्रत्यारोपण कराना पड़ा. दिखाया गया है एक दाता (ए, बी) भ्रूण प्रत्यारोपित लेंस (सी, डी) के साथ एक मेजबान आँख, और मेजबान भ्रूण (ई, एफ) के नियंत्रण की ओर हैं. प्रत्येक आँख दोनों प्रेषित प्रकाश और यूवी रोशनी में दिखाया गया है के रूप में संकेत दिया. फोटो 48 HPF पर ले जाया गया. Q01 [9] ट्रांसजेनिक लाइन इस प्रयोग में इस्तेमाल किया गया था.

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Discussion

कई चरणों लेंस प्रत्यारोपण के दौरान विशेष ध्यान की आवश्यकता होती है.

  1. सुई बढ़ाई: यह लेंस प्रत्यारोपण ले जाने से पहले कई सुई तैयार करने के लिए बेहतर है, और सुई की नोक के रूप में संभव के रूप में पतली होना चाहिए. एक मोटा सुई अपने व्यापक व्यास की वजह से अधिक ऊतक आंसू, आँखों में एक विफलता के लिए चंगा हो सकता है.
  2. भ्रूण व्यवस्था: प्रत्यारोपण से पहले आप अधिकार भ्रूण स्थिति चाहिए ताकि वे अपने पक्ष पर झूठ बोल रहे हैं. जब स्थिति, 1.2% agarose कठोर बहुत जल्दी कर सकते हैं. Agarose का सख्त धीमी करने के लिए, पेट्री डिश दे यह एक 40 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में नाव द्वारा preheated किया जा सकता है.
  3. दाता लेंस मेजबान आँख में डालने से पहले, संभव के रूप में मेजबान सिर के चारों ओर के रूप में ज्यादा agarose हटाने की कोशिश करो. यह दाता लेंस रास्ता है कि सम्मिलित करने के लिए आसान है.
  4. बस लेंस प्रत्यारोपण के बाद भ्रूण को छोड़ा जा 1.2% agarose परत एक 0.2% agarose परत के द्वारा कवर में एम्बेडेड होना चाहिए. एंटीबायोटिक दवाओं के साथ भ्रूण मध्यम जोड़ना दोनों दाता और मेजबान भ्रूण में घाव भरने को बढ़ावा देंगे. Agarose से भ्रूण जारी करने से पहले 30-60 मिनट प्रतीक्षा करें, और तब 24 अच्छी तरह से एक थाली में उन्हें भ्रूण के माध्यम से स्थानांतरण.

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Acknowledgements

यह प्रक्रिया एक बड़ी हद तक प्रत्यारोपण तकनीक गुफा मछली के लिए बिल जेफरी की प्रयोगशाला द्वारा विकसित करने के लिए निम्नानुसार है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1mm diameter tungsten wire A Johnson Matthey 45086
Agarose(low melting point) Sigma-Aldrich 39346
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments, Inc. TW 100-4
Forceps Dumont 11252-30
Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-20C
Pipette pump Fisher Scientific 13-683C
Petri Dish Cardinal Health D1906
Penicillin-streptomycin GIBCO, by Life Technologies 15140-122

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References

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  8. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Zebrafish mutagenesis yields eye morphological mutants with retinal and lens defects. Vision Res. 42, 535-540 (2002).
  9. Godinho, L., Mumm, J. S., Williams, P. R., Schroeter, E. H., Koerber, A., Park, S. W., Leach, S. D., Wong, R. O. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. Nov 132, 5069-5079 (2005).

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