الإنسان عزل جزيرة البنكرياس : الجزء الثاني : تنقية الثقافة والإنسان من الفشوت

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

تحقيق الجودة العالية وكمية مناسبة من الجزر الإنسان هي واحدة من أبرز الشروط لنجاح زرع جزيرة. في هذا الفيديو ، ونحن تصف خطوة بخطوة لإجراءات العزل جزيرة البنكرياس الإنسان (الجزء الثاني : تنقية الثقافة والجزر البشرية) باستخدام أسلوب تعديل الآلي.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets. J. Vis. Exp. (27), e1343, doi:10.3791/1343 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

إدارة مرض السكري نوع 1 هو مرهقة ، سواء على الفرد والمجتمع ، وتكلف أكثر من 100 مليار دولار سنويا. على الرغم من الاستخدام الواسع النطاق للرصد الغلوكوز والانسولين صياغات جديدة ، وتطوير العديد من الأفراد لا تزال مضاعفات ثانوية مدمرة. ويمكن زرع البنكرياس جزيرة بالقرب من استعادة السيطرة على مستويات الجلوكوز الطبيعي في مرضى السكري

Protocol

1. تنقية الجزر

  1. لبدء إجراءات تنقية جزيرة ، تحميل الحقيبة كوبي ، المشبك جميع الأنابيب عدا أنبوب الخضراء ، وضبط السرعة إلى 1500 والسوبر خارج إلى 0.
  2. هود في إعداد الأكواب المضخة والانحدار وتوصيل أنابيب جمع في أنبوب الخضراء.
  3. الآن يمكن التحميل من ficoll 1،100 تبدأ : دفع "تدور" ثم يضاف 110 مل من Ficoll 1،100 إلى الدورق الجبهة ، وبدء ضخ لتحميل الحقيبة كوبي. كما يتم تحميل Ficoll ، اضغط عظمى خارج ، ووقف ضخ ، unclamp رئيس المضخة وضبط السرعة من السوبر إلى 100.
  4. عندما يصل ficoll الدورق ويطرد كل الهواء من الأنابيب ، المشبك في إعادة رأس المضخة. تعيين سرعة الدوران إلى 3000 ، وسرعة فائقة إلى 0.
  5. الآن التحضير لتحميل التدرجات بصب التدرج الثقيلة في دورق الجبهة. الافراج قليلا المشبك بين الأكواب اثنين إلى إزالة أي الهواء. ثم يسكب الضوء التدرج في الدورق الى الوراء.
  6. بدوره على النمام المغناطيسي ، واضغط على "تدور" على الجهاز كوبي ، إزالة المشبك من الأنبوب الذي يربط بين الأكواب اثنين ، والتحقق بصريا أن التدرجات الثقيلة والخفيفة والاختلاط.
  7. بمجرد أن بدأ خلط التدرجات ، بدوره على جهاز الطرد المركزي. الانتظار دقيقة واحدة ، ثم تشغيل المضخة لتحميل التدرجات الاختلاط.
  8. لتحميل الأنسجة اسمحوا التدرج تشغيل منخفضة في الدورق الجبهة ، لكنه ليس ضعيفا بما يكفي للسماح بدخول الهواء في أنبوب التحميل ، ثم reclamp الأنبوب الذي يربط بين الأكواب وتحميل الأنسجة.
  9. واضاف ان يستمر بقية الأنسجة. ثم يغسل الأنبوب الذي عقد في النسيج مع 50 مل من محلول الغسيل ، واستخدامه لغسل الدورق الجبهة.
  10. وكان آخر من يدخل نسيج كيس ، في وقت واحد وقف ضخ ، unclamp على رأس المضخة ، وأنابيب المشبك فوق الحقيبة. تواصل أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق.
  11. في حين لا يزال الطرد المركزي ، ليصبح أنابيب جمع 12 إلى غطاء محرك السيارة وتخفيف قبعاتهم. إرفاق أنابيب جمع إلى أنبوب الصفراء ، ومكان غيض جمع العقيمة في أنبوب مخروطي الشكل 1. unclamp ثم الأنبوب الأصفر ، والمشبك أنبوب الخضراء.
  12. عندما تدور تنتهي ، ورفع ببطء Superout إلى 100. جمع 150 مل في أنبوب 1. ثم جمع 30 مل في أنابيب 12/02 (200-230 مل).
  13. بمجرد اكتمال جمع ، ودفع "إيقاف" في كوبي. الآن بعد أن انتهت تنقية ، يمكن تقييم الجزر والمثقفين.

2. أخذ العينات والثقافة

  1. بعد جمع الكسور الجزر منقى ، أخذ عينة من كل من أنابيب جمع 12 وصمة عار مع Dithizone. سوف تظهر البقع التي تحتوي على طبقات عالية النقاء الجزر مقابل طبقات مع نقاء الجزر المنخفضة.
  2. جمع الأنسجة النقاوة العالية والمنخفضة وتجمع كل معا.
  3. تدور ويغسل مرتين. بعد غسل الثاني ، جعل حجم كل منها 250 مل مع وسائل الاعلام اغسل النهائي.
  4. لتقييم الكسور المجمعة تبدأ أخذ اثنين من عينات 1 مل من المستوى العالي من الكسور المجمعة وعينة واحدة 1 مل من منخفضة. نقل كل عينة 1ml في أنبوب مخروطي يحتوي على 9 مل من محلول الغسيل.
  5. ثم نقل 1 مل من كل أنبوب 15 مل إلى طبق العد. فحص وفرز الخلايا تحت المجهر.
  6. بعد عد الخلايا حساب عدد القوارير اللازمة لثقافة الجزر باستخدام الصيغة التالية : (EIN الكل / نقاء من الجزر في العشرية) / (30000 EIN في قارورة). على سبيل المثال ، يتم تربيتها 100000 الجزر مع نقاء 90 ٪ في 4 القوارير.
  7. نقل إلى الجزر T175 القوارير والثقافة في 37 ˚ C و 5 ​​٪ CO 2 الحاضنة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

على الرغم من التقدم الكبير في تقنيات العزل جزيرة الإنسان ، جزيرة الغلة يبقى متغير بدرجة كبيرة وغير متوقعة. تنقية نسيج البنكرياس هضمها أمر حاسم لاستعادة جزيرة كتلة كافية بعد الهضم الأنزيمي ناجحة لزرع الأعضاء. ويوصى الأسلوب لأن تنقية UIC وقد تجلى انتعاش متفوقة من الجزر الإنسان نقية للغاية باستخدام هذا الأسلوب. وعلاوة على ذلك ، يمكن تحميل ما يصل الى 50 مل من الأنسجة هضمها في كوب واحد الترشح للتنقية ، والتقليل بالتالي نقص تروية المرتبطة إصابة الجزر الإنسان عن طريق اختصار الوقت الإجمالي المستخدمة في العزل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

بدعم من المؤسسين من جامعة إلينوي في شيكاغو ، وكذلك جزيرة خلية منح مركز الموارد المعاهد الوطنية للصحة (RFA - RR 05-003) ، ومؤسسة كريستوفر ، ومؤسسة Efroymson ، ومؤسسة Tellabs.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Centrifuge equipment Beckman Coulter Inc. 424803
Cobe 2991 Cell Processor equipment Gambro. BCT 2556 islet purification
MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 equipment Leica Microsystems 4103
Cell Culture Dish with 2 mm Grid equipment Nalge Nunc international 174926 islet counting
Digital Sight DS L1 equipment Nikon Instruments 217267
COBE bag disposable equipment O.R. Solution 66707003
T175 culture flask disposable equipment Sarstedt Ltd 83.1812.500
University of Wisconcin (UW) solution reagent DURAMED 1000-46-06
Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) reagent Mediatech, Inc. 99-597-CM
Ficoll 1.100 reagent Bichrom AG L6155
M199 media (wash solution) reagent Mediatech, Inc. 99-784-CM
Final wash/Culture Medium reagent Mediatech, Inc. 99-785-CV
Dithizone reagent Sigma-Aldrich D5130

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shapiro, A. M. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
  2. Nano, R. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
  3. Barbaro, B. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
  4. Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
  5. Fridell, J. A. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
  6. Potdar, S. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
  7. Salehi, P. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
  8. Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38 Suppl 1, 140-142 (1989).
  9. Ricordi, C. Islet isolation assessment in man and large animals. Acta Diabetol Lat. 27, 185-195 (1990).

Comments

1 Comment

  1. dear jove:
    how can I calculat the density of ficoll solution when I dillute ficoll powder in water with different percentages?forexample ficol ²3%

    Reply
    Posted by: mahvash h.
    June 22, 2009 - 4:44 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics