Inserte grandes Ambiental Genómica Producción Biblioteca

Biology

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Summary

Construcción de una biblioteca fosmid con el ADN genómico aislado del medio ambiente de la continuidad de profundidad vertical de un fiordo de la temporada hipóxica se describe. La biblioteca clon resultante se recoge en placas de 384 pocillos y se archivan para la secuenciación de aguas abajo y la detección funcional mediante la aplicación de un sistema de recogida automatizada de la colonia.

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Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. Large Insert Environmental Genomic Library Production. J. Vis. Exp. (31), e1387, doi:10.3791/1387 (2009).

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Abstract

La gran mayoría de los microbios en la naturaleza en la actualidad siguen siendo inaccesibles para los métodos de cultivo tradicionales. Durante la última década, la cultura independiente de la genómica ambiental (

Protocol

Construcción Fosmid biblioteca se ha dividido en cuatro pasos principales y sub-dividido en varias partes (ver Fig. 1 para un resumen).

Paso I (véase el protocolo "de extracción de ADN de 0,22 M filtros Sterivex" [3])

Parte 1: catalizadas por enzimas lisis celular

Parte 2: Purificación de ADN del medio ambiente mediante centrifugación en gradiente de densidad de CsCl y la recuperación de ADN

Parte 3: Control de calidad del ADN extraído por electroforesis en gel

Paso II

Parte 1: etapas enzimáticas modificación del ADN recuperado del medio ambiente

Todos los reactivos necesarios para el paso final de la reparación del ADN del medio ambiente se incluyen en el kit de PCC1 Fosmid producción Biblioteca de EPICENTRO. Idealmente, su ADN genómico se debe ajustar a 0,5 mg / l.

  1. Descongele todos los reactivos en hielo, combine las siguientes opciones y una breve centrifugar el tubo para obtener todo el líquido a la parte inferior:
    • x agua estéril l
    • 8 l 10 veces al final de reparación de buffer
    • 8 l 2,5 mM dNTP mix
    • 8 l 10 mM ATP
    • hasta 20 mg cortado inserción de ADN (~ 0,5 g / l)
    • 4 l final de la enzima de reparación de la mezcla
    • 80 l de volumen total de reacción
  2. Incubar a temperatura ambiente durante un tiempo mínimo de 45 minutos hasta 60 minutos y el calor inactiva la mezcla de enzimas a 70 ° C durante 10 minutos (en la media hora, preparar un gel de agarosa de bajo punto de fusión para su posterior selección de tamaño final reparado ADN, ver más abajo).

Parte 2: Tamaño de selección de ADN genómico por electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE)

  1. Vuelva a suspender 1,5 g de agarosa de baja fusión en 150 ml de 1,0 TAE funcionamiento de amortiguación y añadir una pequeña barra de agitación magnética. Cubra el recipiente con papel plástico para microondas y hervir rápidamente en el microondas hasta que agarosa se disuelva por completo. Agitar hasta que esté lo suficientemente frío como para verter en la bandeja del gel (~ 60 ° C).
    Nota: no incluir el bromuro de etidio o SYBR Gold, ya sea en gel o en el funcionamiento de amortiguación.
  2. Montar la bandeja de gel para emitir su gel y elegir un peine que le dará espacio suficiente para cargar la reparación completa de extremo mezcla en uno o dos pozos (80 l más cantidad adecuada de tampón de carga).
  3. Verter 2,2 l de 1,0 TAE en la cámara de electroforesis y encender la máquina para hacer circular el funcionamiento de amortiguación y configurar el dispositivo de refrigeración a 14 ° C. La bomba debe funcionar a 70 rpm para garantizar la circulación suficiente del funcionamiento de amortiguación y mantener el buffer a 14 ° C.
  4. Verter la agarosa derretida en la bandeja de gel en una superficie bien nivelada, una vez que se enfría y asegúrese de que no queden burbujas. Asegúrese de que la agarosa derretida siquiera está en la cresta de gel, de lo contrario retirar el peine y la volvió a meter en la agarosa derretida. Una vez que el gel se ha solidificado, retire el peine y la carga de una gama media que PFG marcador en el cuarto pozo del gel. Extrusión de agarosa de la jeringa de gel y cortar un pequeño tapón de la final con un bisturí. Coloque el conector en la parte delantera del bien y del sello con agarosa fundida. Colocar el gel en la cámara de electroforesis.
    Nota: manejar su gel de agarosa con mucho cuidado ya baja temperatura de fusión de freno geles con facilidad. Compruebe si el tampón de la temperatura descienda a 14 ° C antes de comenzar a cargar el gel. Si su mirada pozos bloqueado por agarosa, intentar la próxima vez lo siguiente: antes de quitar el peine del gel, agregar 2.1 mL de TAE-de amortiguamiento alrededor de los panales, lo que se traducirá en mejores pozos.
  5. En la primera carga y 5 l de λ HindIII digerir seguido por una l del marcador de controlar el tamaño de fosmid (Epicentro, 100 ng / l). Añadir 10 l de agua estéril para el marcador de tamaño de un tubo de microcentrífuga, así como una cantidad adecuada de tampón de carga. El mayor volumen hace que sea más fácil de cargar el gel. Justo al lado del marcador fosmid cargar su final reparado y inactivado por calor, se mezclan con una cantidad adecuada de tampón de carga. Cierre la tapa y el programa de configuración.
    Nota: realmente recomendamos cargar diferentes cantidades de ADN de otras escalas para cuantificar aproximadamente la cantidad de ADN o de visualizar la extensión de la esquila de su ADN genómico. Marcadores de tamaño ideal son λ ADN HindIII Compendio de rango medio y me PFG Marker (tanto de NEB).
  6. Programa de las opciones: utilizar el algoritmo automático si el sistema está equipado con PFGE esto. El programa calcula automáticamente el valor que necesita para separar el ADN de un rango de tamaño determinado. Parámetros utilizados son: rango de tamaño de ADN 2-250 Kb; factor de calibración: 1; gradiente: [6 V / cm], tiempo de ejecución: hasta las 12:00 horas, ángulo incluido: 120 º, tiempo de conexión inicial: 0,1 seg; cambio de última hora : 21,79 segundos; factor de rampa lineal =.
  7. Para visualizar el ADN, vierta 250 ml de tampón TAE 1,0 X en un recipiente y añadir 25 l de 10.000X SYBR Gold, mezclar suavemente antes de colocar el gel en la solución. Mancha el gel durante 1 hora en la oscuridad como SYBR Gold es la luz sensive.
    Nota: manejar su gel de agarosa con mucho cuidado ya baja temperatura de fusión de freno geles con facilidad.

Parte 3: ADN de recuperación por la extracción de gel y la ligadura de ADN recuperado para el vector de clonación fosmid

Todos los reactivos para esta parte se incluyen en el kit de producción EPICENTRO fosmid-biblioteca.

  1. Mientras tanto preparar un baño de agua a 70 ° C y un ángulo de 45 ° C para el paso de la digestión en gel.
  2. Lleve a su gel teñido con un tubo de microcentrífuga vacío tarado y un bisturí estéril en el transiluminador de luz azul. Visualice su final reparación del ADN genómico y el marcador de control de tamaño fosmid. Los impuestos especiales un gel corte con un bisturí que migraron con y ligeramente por encima de la posición del marcador de controlar el tamaño de fosmid (una rebanada de gel especial que es de 5-7 mm de ancho) y la transferencia de la división para el tubo de microcentrífuga de tarado. Ejecutar una gama media que PFG marcador en el gel, ya que le ayuda a no cortar el gel demasiado alto.
    Nota: poner una envoltura de plástico en el transiluminador de luz azul antes de poner el gel en él para evitar la contaminación cruzada y el desgaste de las gafas de visión antes de encender la luz azul. No rodajas de gel especial en el ADN genómico es menor que el marcador de control de tamaño fosmid ya que esto dará como resultado no deseado clones quiméricos.
    Usted puede cortar y almacenar rodajas de gel que contiene el ADN menor o mayor peso molecular para la construcción de la escopeta del genoma completo o bibliotecas BAC, respectivamente.
    Me detengo: la rebanada de gel de recuperación (s) pueden ser almacenadas a -20 ° C hasta por un año
  3. Pesar los tubos de tarado y calcular el peso de la rodaja de gel (s). 1 mg de agarosa se producen aproximadamente 1 l de agarosa fundida.
  4. Derretir el bajo punto de fusión de agarosa que contiene el ADN genómico en un baño de agua a 70 ° C durante 10-15 minutos (no añadir búfer gelase). Después de su rebanada de gel se derrita por completo, el tubo de transferencia rápidamente a 45 ° C.
    Nota: no vórtice su ejemplo para ayudar a disolver ya que esto podría corte de su ADN.
  5. Añadir 1 U (1μl) de la preparación enzimática GELase por 100 l de agarosa derretida. Se incuba a 45 ° C durante 1 hora y luego añadir más GELase (2-4 l) e incubar durante una hora adicional. El calor inactiva la preparación enzimática GELase a 70 ° C durante 10 minutos.
    Coloque el tubo en hielo durante 10 minutos y centrifugar el tubo a la máxima velocidad (13.000 rpm) durante 15 minutos para que sedimenten las partículas insolubles. Retire con cuidado el sobrenadante superior y transferirlo a un tubo Falcon de 15 ml y añadir 3 ml de agua estéril en el tubo.
    Nota: evitar pipetear cualquier pellets de agarosa. A medida que agregamos más GELase que incluye en el kit, que para la preparación enzimática GELase adicional por separado.
  6. Transferir la solución a un Amicon Ultra-4 Unidad de centrífuga de filtro con membrana Ultracel-10 y girar el tubo a 4.000 g durante 6-8 minutos y descartar el flujo a través. Centrífuga hasta que la cantidad de solución en el filtro se reduce a aproximadamente 100 a 500 l. Añadir otro 3 ml de agua estéril para el vacío del tubo Falcon de arriba y la transferencia de la solución en el tubo de Amicon y repetir el paso de centrifugación. Lave por tercera vez con 3 ml de agua y desechar el flujo a través de nuevo. Reducir el volumen final de 50 a 100 microlitros.
    Nota: se utiliza un rotor basculante para el paso de centrifugación, basta con colocar el filtro Amicon unidad centrífuga en un tubo Falcon de 50 ml para mantenerlo en su lugar durante el centrifugado. Amicon filtro retiene 50 l de solución en el filtro, incluso después de la centrifugación prolongada.
  7. La transferencia de la solución de ADN restante del tubo Amicon en un pre-lavado Microcon YM-50 Unidad de filtro centrífugo y enjuagar el tubo Amicon con un adicional de 50 l de agua estéril para recuperar todo el ADN. Se centrifuga la Microcon YM-50 Unidad de centrífugas filtro en una microcentrífuga a 10.000 g hasta que el filtro es todavía ligeramente cubierto con líquido. Comprobar cada minuto si sólo una pequeña cantidad de líquido que queda en el filtro. Dé vuelta el filtro hacia abajo y recuperar su solución de ADN por un segundo paso de centrifugación a 1.000 g durante 3 minutos en un tubo de microcentrífuga nuevo. El volumen resultante no debe exceder de 10-15 l en total, de lo contrario su ADN podría ser demasiado diluida en el paso de la ligadura.
    Nota: tenga cuidado de no girar el dispositivo de filtro hasta desecación completa. Si la membrana se seca, a continuación, añadir 10-15 l de agua en la membrana, se agita suavemente durante 30 segundos y recuperar su ADN como se describió anteriormente.
  8. Cuantificar la solución de ADN resultante NanoDrop o ensayo PicoGreen.
  9. Se recuperó al final reparado ADN está listo para ser ligado al vector de clonación PCC1-fosmid. Descongele la siguiente solución en el hielo y asegurarse de que el vector para insertar proporción molar de 10:1.
    Nota: 0,5 mg PCC1-fosmid vector vector ~ 0,09 pmoles.
    0,25 mg de ~ 40 Kb de ADN insertar ~ 0.009 pmoles inserto de ADN
    Aumentar la cantidad de ADN utilizado en el paso ligadura podría ser útil si usted debe obtener sólo un fosmi pocosd clones después de la siembra infectados E. células de E. coli en las placas de selección.

    Añadir los reactivos en el orden siguiente y breve centrifugar el tubo para obtener todo el líquido en el fondo, toque el tubo y girar de nuevo:

    • x agua estéril l
    • 1 l 10 veces más rápido-Link ligadura de amortiguación
    • 1 l 10 mM ATP
    • 1 l-PCC1 fosmid vector (0,5 mg / l)
    • x l insertar ADN concentrado (0,25 mg)
    • 1 l Rápido-Link ADN ligasa
    • Un volumen de 10 l de reacción total
  10. Incube a temperatura ambiente durante 2 horas y el calor inactiva la enzima durante 10 minutos a 70 ° C.
    Stop II: mezcla de tienda de ligadura a -20 ° C o pasar a la etapa de envasado del fago.
    Nota: La reacción de ligación solo se producen 10 3 -10 6 clones en función de la calidad del ADN del medio ambiente. Con base en el número estimado de clones que se requiere para la cobertura en particular, puede ampliar la reacción de ligación. Si la ligadura se amplía, entonces la cantidad de extracto de fago envases deben ampliarse en consecuencia, como se describe a continuación.

Paso III

Parte 1: Fago-empaquetado de producto de ligación vector-inserto

  1. Dos o tres días antes de la racha de envases destinados a fagos siempre EPI300-T1 cepa R placas en una placa de LB simple e incubar durante la noche a 37 ° C para obtener colonias aisladas. Esta placa puede ser sellados y almacenados a 4 ° C para su uso futuro.
  2. El día antes de la inoculación de envasado de reacción de 50 ml de caldo LB + 10 mM MgSO 4 (añadir 500 l 1M MgSO 4), con una sola colonia de la placa generado en el paso 1. Agite a 225 rpm y 37 ° C durante la noche.
  3. El día de las reacciones de embalaje inocular 50 ml de caldo fresco LB + 10 mM MgSO 4 con 5 ml de la cultura durante la noche preparados en el paso 2. Crecer a 37 ° C a una OD 600 de 0,8 a 1,0 y no superior a 600 OD de 1,0! Diluir la muestra antes de medir en el espectrofotómetro para que usted obtenga un resultado preciso. Almacenan las células en hielo oa 4 ° C hasta más utilizados.
    Nota: Detener III: la cultura se puede almacenar a 4 ° C durante un máximo de 72 horas si es necesario, sin embargo con un cultivo fresco crecido es muy recomendable.
  4. Deshielo, el hielo, los extractos MaxPlax Lambda de envases, un tubo para cada reacción de ligación realizados con anterioridad. Descongelación se llevará a 10-15 minutos. Mientras tanto, coloque el tubo 1,5 ml en hielo para ser pre-enfriado.
    Nota: no deje de fagos descongelado en el hielo demasiado tiempo. De lo contrario la infección por fagos eficiencia se reducirá.
  5. Una vez descongelado inmediatamente la transferencia de 25 l de cada extracto de embalaje para un segundo pre-refrigerados 1,5 ml tubo de microcentrífuga y el lugar en el hielo. Volver extracto de envasado que a - 80 ° C.
    Nota: no guardar el extracto de embalaje con hielo seco o cualquier fuente de CO 2 otros.
  6. Añadir 10 l de la reacción de ligación entre l 25 de los extractos de descongelar el hielo. Mezclar con la pipeta la solución en varias ocasiones, evitar la introducción de burbujas de aire. En pocas palabras centrífuga de los tubos para obtener todo el líquido a la parte inferior del tubo e incubar las reacciones de envasado a 30 ° C durante 90 min. Después de 80 min de incubación de deshielo restantes extracto de embalaje en el hielo.
    Nota: utilice un baño de agua en lugar de un calentador para el paso de 30 ° C de incubación.
  7. Después de 90 minutos la reacción de embalaje se completa añadir el restante 25 l de extracto de embalaje para cada tubo de reacción. Reacciones incubar durante otros 90 minutos a 30 ° C. Después de 90 minutos de incubación añadir 100 ml del tampón de dilución de fagos preparado en cada tubo de embalaje y mezclar suavemente.
    Nota: si su eficiencia debe ser baja, al final, sus extractos fago podría ser demasiado viejos o han estado expuestos a hielo seco o cualquier fuente de CO 2 otros. En nuestra experiencia, el embalaje del fago a temperatura ambiente (2 veces 90 minutos) en lugar de 30 ° C seguido de una incubación final adicional durante 2 horas a 30 ° C el aumento de la cantidad de clones resultantes.
  8. Añadir 5 l de cloroformo a cada tubo y mezclar suavemente dando como resultado un volumen total de 165 l en el tubo. Un precipitado viscoso se puede formar después de la adición cloroformo, esto no interfiere con la producción de la biblioteca. Sin embargo evitar este precipitado, así como la fase de cloroformo orgánica al pipetear las partículas de fago.
    Detener IV: en este punto las partículas de fago empaquetado se puede conservar durante varios días a 4 ° C.
    Nota: para la eficiencia del fago mejor la infección, el uso de fagos recién envasados.

Parte 2: La infección de la E. de la biblioteca de acogida coli

  1. Añadir fago empaquetado de EPI300-T1 células huésped R (OD 600 = 0,8 a 1,0) en una proporción de 400 l de EPI300-T1 células R para cada l 10 de las partículas de fago. Para evitar cualquier pipeteo cloroformo usamos 125 l de las partículas de fago empaquetado y 5 ml de prepaed EPI300-T1 R células huésped. Mezclar suavemente y luego se incuba a 37 ° C durante 30 min.
    Nota: tenga cuidado de no transferencia de cloroformo a las células huésped cuando se quita la partícula del fago del tubo de embalaje fago. Si no está seguro, tener menos de las partículas de fago empaquetado.

Parte 3: Revestimiento y titulación

  1. Añadir 5-7 perlas de vidrio esterilizado en cuatro pequeñas LB + 12.5 mg / ml de cloranfenicol platos de Petri.
  2. Extendió dos veces 50 l y dos veces 10 l de los fagos infectados EPI300-T1 células R en cuatro platos por separado. Para asegurar una difusión, añadir un poco de caldo LB (~ 50 l) para las placas con el l 10 de fagos las células infectadas. Agitar la placa horizontal para repartir uniformemente a las células en la placa. Deje que la placa seca durante 15 minutos y luego retire las cuentas invirtiendo la placa.
    Nota: estas placas se utilizan para determinar el número de transformantes y para el cálculo de las diluciones apropiadas que sean necesarias en la etapa de selección de colonias para evitar la densidad de las colonias demasiado alto.
  3. Coloque las placas boca abajo en una incubadora a 37 ° C durante 16 a 24 horas hasta 48 horas hasta que se formen colonias. Verifique las placas después de 24 horas para prevenir el rápido crecimiento de los clones de crecimiento en colonias vecino.
  4. Mientras tanto, la cosecha de las células residuales sobrantes de la infección de 5 ml por centrifugación a 3.500 g durante 10 minutos a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante. Añadir 1 ml de LB / 20% de glicerol en el tubo. Vuelva a suspender l el sedimento celular y alícuota a 100 por cada uno de 2 tubos criovial ml. Congelar inmediatamente y almacenar a -80 ° C para su posterior utilización en la colonia recogiendo paso.
  5. Al día siguiente, cuente el número de clones en las placas y determinar el título. Asegúrese de incluir el factor de dilución correcta para calcular la cantidad total de fosmid-clones.
    Nota: este procedimiento genera entre 10.000 y 50.000 fosmid-clones en total, sin embargo dependiendo de la calidad y la pureza del ADN extraído del medio ambiente, un rango de entre 3.000 hasta 80.000 clones fosmid se observa.

Paso IV

Parte 1: El agar-y también la preparación de platos

  1. Vierta los medios de comunicación en las placas de la siguiente manera; incluyen cloranfenicol 12,5 microgramos por ml de LB:
    • 100X15mm una caja de petri: 25 ml de agar LB
    • 150X15mm una caja de petri: 50 ml de agar LB
    • 245X245mm cuadrados placa bioensayo: agar LB 250 ml
    Nota: es importante para verter los medios de comunicación sobre una superficie bien nivelada para que la profundidad del agar uniformemente a través de la placa. Recomendamos el uso de placas de 245X245 mm para las bibliotecas fosmid por lo que no tiene que manejar muchos platos.
  2. Descongele su stock de glicerol que contiene los clones fosmid preparado en el hielo. Corre la cantidad apropiada de la placa que desea utilizar en función de su título de cálculo (la preparación de las acciones de glicerol, además, concentra sus células ~ 5 veces). El tiempo de incubación para el crecimiento celular es de 24 horas a 37 ° C.
    Detener V: cuando las colonias formadas, almacenar las placas de agar sellado a 4 ° C durante un máximo de un mes hasta que se utilizan en la etapa de la colonia de recolección.
    Nota: las colonias deben distribuirse de manera uniforme, lo suficientemente distantes entre sí y deben crecer aproximadamente 1 mm de diámetro. Revestimiento de las células mediante el uso de cuentas de vidrio puede generar una buena separación entre las colonias. En una placa de Petri 100X15mm, normalmente de 150 ~ 250 colonias son una buena densidad de más alto rendimiento en el picking de robots y de 22 x 22 cm, no más de 2.000 colonias debe ser obtenida.
  3. En los días de recolección de colonias, preparar 96 o 384 pocillos llenos de caldo LB suplementado con cloranfenicol mg 12,5 por ml de caldo, así como el 20% de glicerol para la biblioteca de almacenamiento a -80 ° C. Placas se llenan con el sistema de placas automático QFill3 relleno como se describe a continuación.
  4. Autoclave 2 juegos de botellas de vidrio (500 ml), tapas y tubos de silicona. No múltiple de autoclave, incluyendo montaje de la aguja y la brida de montaje. Ensamble QFill3 cerca de una llama de un mechero Bunsen o dentro de una campana para crear y mantener un ambiente estéril.
    Nota: asegúrese de que el tubo de silicona se inserta en la válvula de pinza presionando la válvula de manguito deslizante y activador de la tubería de lleno en la válvula. (Esto funciona como un freno para la dispensación de mediano a la siguiente columna).
  5. Esterilizar las agujas de dispensación pasando a través de aproximadamente 50 ml de 1% de lejía, autoclave dH 2 O y el 80% de etanol, una en un tiempo y un lugar tapa de la caja punta en la plataforma para recoger las soluciones residuales. Después de la esterilización, el cambio a otro conjunto formado por tubos de botella, la tapa y el silicio.
  6. Llene la botella con el medio de ~ 300 ml. Ejecutar suficiente medio a través de deshacerse de cualquier resto de etanol a partir de la limpieza. Una vez que el tubo se limpia, se carga una placa y 96/384 de la plataforma. Pulse el botón "start" para llenar su plato, cada bien debe ser llenado con 200 l de caldo de LB preparado. Para limpiar las agujas de distribución, ejecute ~ 50 ml de etanol al 80% a través de.
    Nota:. Asegúrese de que su placa y se etiqueta antes de llenar </ Li>

Parte 2: recoger colonia configuración robot

  1. Estamos usando el clon robot recogiendo QPix2 de acuerdo con el manual del usuario s. Los usuarios deben conocer el manejo de sus robots y cómo configurar todo lo posible para garantizar la más alta eficiencia de recolección.
  2. Para crear un ambiente estéril alrededor de la zona de recogida clon, encender la luz UV durante 30 minutos. Mientras que la luz UV está encendida, preparar 500 ml de 1% de cloro, 500 ml de agua estéril dH 2 O y 500 ml de etanol al 80%. Cuando la luz UV se apaga llenar las bandejas según lo indicado. Siempre vierta las soluciones en las bandejas de solución que esté debidamente etiquetado. De atrás hacia delante llenar en el 1% de lejía, y luego en autoclave dH 2 O y el 80% de etanol en la bandeja frontal. Asegúrese de que están llenos. Recogiendo las agujas no se pueden lavar correctamente sin solución de lavado suficiente.
    Nota: controlar el 80% de etanol en el tiempo. Se evaporará y necesita ser recargado.
  3. Después de configurar los parámetros para la recolección óptima, coloque las placas de agar preparado con clones fosmid y placas entre los postes en el área de Q-Pix trabajo. Asegúrese de que usted ha tomado todas las cubiertas de la placa!
  4. Las placas deben ser firmes en contra esquina frontal derecha, por lo que no se pueden mover durante la recolección. A continuación, cierre el panel frontal.
    Nota: Esto es muy importante!
  5. Una vez que todos los parámetros se establecen el procedimiento de selección puede comenzar. Cuando se haya completado todos los recogiendo enjuagar los cepillos y las bandejas con agua destilada y en el banco de que se seque. Limpiar cualquier derrame que pueda haber ocurrido, y limpiar el interior de la Q-Pix con etanol al 80%.

Parte 3: incubación durante la noche y el almacenamiento de la biblioteca

  1. Asegúrese de que todas las placas de valores glicerol están etiquetados, y colocarlos en la incubadora a 37 ° C durante 24 horas. Deje una nota en la incubadora que contiene la fecha, el número de placas se incuban, el tiempo de incubación, el tiempo para el retiro y sus iniciales.
  2. Para el almacenamiento de largo tiempo, coloque la incubación durante la noche convertido en un congelador -80 ° C.

Los resultados representativos:

El protocolo presentado se describe el procedimiento de cómo generar una biblioteca ambiental fosmid para capturar el contenido genético de una comunidad microbiana en un hábitat determinado. Este protocolo debe crear una biblioteca fosmid que es representante en el contenido genético de la muestra y el medio ambiente debe permitir al lector para modificar y optimizar los pasos críticos si la cantidad de clones fosmid obtenidos al final de todo el procedimiento es demasiado bajo.

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Discussion

El procedimiento se describe cómo generar más eficiente una biblioteca fosmid gran inserción con el ADN genómico derivado de una muestra de las aguas costeras. Aguas arriba de extracción de ADN genómico se describe en un protocolo separado [3].

A medida que la producción fosmid-biblioteca es un proceso de varios pasos, el plan de al menos dos a tres semanas de tiempo para el procedimiento completo, incluyendo todos los pasos cuatro que se presentan. La extracción de ADN genómico es el paso más crucial y todos los pasos corriente abajo se basan en la calidad y cantidad de ADN extraído genómica, así que considerar el gasto de tiempo suficiente para que este paso y trabajar con cuidado. Calidad y control de la cantidad de ADN extraído es muy importante. Puede ocurrir que el número de clones fosmid es baja, especialmente si se trata de la primera biblioteca que se va a hacer. A medida que la construcción de la biblioteca fosmid por sí mismo es muy sencillo, el fracaso se debe principalmente a la insuficiente calidad y / o cantidad de su ADN genómico extraído y purificado. Considere la posibilidad de volver a extraer el ADN genómico y prestar especial atención a los pasos a seguir en la purificación del ADN y la recuperación-si la construcción de la biblioteca no se ha realizado correctamente.

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Disclosures

No tengo nada que revelar.

Acknowledgments

Nos gustaría agradecer a la Fundación Canadiense para la Innovación, el British Columbia Fondo de Desarrollo de conocimientos y el Nacional de Ciencias e Ingeniería de Investigación (NSERC) de Canadá para apoyar los estudios en curso en las regiones de bajo nivel de oxígeno de las aguas oceánicas costeras y abiertas. MT SL y con el apoyo de becas del Centro de TULA financiado por la Fundación para la Diversidad Microbiana y Evolución (CMDE). MT también recibió el apoyo de becas de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Step II
CopyControl™ Fosmid Library Production Kit Epicentre Biotechnologies CCFOS110 sufficient to generate 9-10 fosmid libraries
SeaPlaque Agarose Cambrex 50100
stirring hot plate Corning PC-420D
1.0X TAE running buffer
CHEF Mapper XA pulsed field electrophoresis system including cooling module and variable speed pump Bio-Rad
λ DNA-HindIII Digest New England Biolabs N3012S
MidRange I PFG Marker New England Biolabs N3551S
10,000X SYBR Gold Invitrogen S11494
microwavable plastic wrap Saran premium wrap
Safe Imager transilluminator Invitrogen S37102
GELase Agarose Gel-Digesting Preparation Epicentre Biotechnologies G09100
scalpel Fisher Scientific 08-927-5D
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane EMD Millipore UFC801024
Microcon YM-30 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore 42410
nuclease free water Ambion AM9932
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 assays*# Invitrogen P7589
digital dry block heater VWR international 12621-088
water bath VWR international 14231-854
centrifuge Beckman Coulter Inc. Avanti J-E
centrifuge rotor Beckman Coulter Inc. JA 5.3
table top centrifuge Eppendorf 5415D
microcentrifuge tubes, 1.7 mL, clear Axygen Scientific MCT-175-C
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 430052
Step III
LB broth Fisher Scientific BP 1426-2
MgSO4 Sigma-Aldrich M2643
phage dilution buffer 10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2
cryogenic vials Fisher Scientific 430488
Step IV
96 well plate with lid Fisher Scientific CS003370(3370)
384 well plate with lid Fisher Scientific 07201157(3680)
Petri dishes 100 O.D. x 15mm H Fisher Scientific 08-757-12
Petri dishes 150 Dia. x 15mmH Fisher Scientific 08-757-14
BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm VWR international CABD351040
glycerol Sigma-Aldrich G5516
chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
LB broth Fisher Scientific BP 1426-2
Difco Agar BD Biosciences 214530
glass beads Fisher Scientific 10-310-1
QFill3 Genetix X3050
Bleach Javex
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 430052
QPix colony picker Genetix QPix2
picking head (E. coli) Genetix X4006

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. (2009).
  2. Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
  3. Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation. J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).
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Comments

3 Comments

  1. Awesome and very detailed protocol. I like it!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 26, 2009 - 8:04 PM
  2. Dear Dr. Hallan,
    I am a researcher working at the Environmental Microbiology Laboratory in the National Patagonian Research Center, Argentina. We are just about to start with the preparation of a metagenomic fosmid library from marine sediments, using Epicentre Copy Control kit. We tried the protocol exactly as the manufacturer suggests, performing only ligation and packaging controls before we start with our DNA. Our packaging efficiency was about 10 e 8, but no colonies appeared in the ligation control reaction. I read your JoVE paper, and as your protocol dŒs not involve so much dilution as Epicentre dŒs (they recommend diluting the lambda packages to 1 ml and then the plating dilution again 1:1000), we suspected some kind of problem.
    Have you performed the titering of a ligation control in your conditions? we would like to know the titer and efficiency if you have got this data, as it would greatly help us in our next steps (we want to try the control ligation in your conditions).
    thanks in advance for your time,
    sincerely
    Mariana Lozada

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 9, 2010 - 10:05 PM
  3. I enjoyed your protocol, as it was good to see a demonstration of Epicentre's long fosmid cloning protocol. However, the video says that for colony picking you fill the plate with LB + chloramphenicol + 10% glycerol, but the text says ²0%. Having printed out the protocol and generating our own pCC1FOS, we proceeded to pick ~1000 colonies by hand and transferred them to 96 well plates containing LB + 1².5 µg/ml chloramphenicol + ²0% glycerol. You can imagine the level of disappointment when we pulled the plates out of the 37 degree C room after ²4 hours with absolutely no growth in any of the wells. I just hope that this dŒs not happen to anybody else.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2011 - 12:25 AM

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