הארכת לכידת פריימר: אחזור רצף ממוקד ממקורות DNA מושפל בכבדות

Biology
 

Summary

אנו מציגים שיטה ממוקדת אחזור רצף ה-DNA העתיק, שבו השתמשנו לשחזר את הגנום המיטוכונדריאלי המלא של חמישה אנשים Neandertal. השוואה בין הרצפים עם בני האדם של ימינו מציע כי הניאנדרטלים היה ארוך טווח אפקטיבי נמוך גודל האוכלוסייה.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Briggs, A. W., Good, J. M., Green, R. E., Krause, J., Maricic, T., Stenzel, U., Pääbo, S. Primer Extension Capture: Targeted Sequence Retrieval from Heavily Degraded DNA Sources. J. Vis. Exp. (31), e1573, doi:10.3791/1573 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

אנו מציגים שיטה אחזור ממוקד רצף ה-DNA ממקורות DNA אשר מפורקים בכבדות מזוהמים עם ה-DNA של חיידקים, כמו אופייני עצמות עתיקות. השיטה מקטינה באופן משמעותי הרס מדגם ודרישות רצף ביחס ישיר PCR או רצף גישות רובה ציד. השתמשנו בשיטה זו כדי לשחזר את ה-DNA המיטוכונדרי מלא (mtDNA) הגנום של חמישה הניאנדרטלים מכל רחבי טווח הגיאוגרפי שלהם. המגוון הגנטי של mtDNA הניאנדרטלים המנוח היה כ שלוש פעמים נמוכה מזו של האדם המודרני העכשווי. יחד עם ניתוח של התפתחות חלבון mtDNA, נתונים אלה מראים כי גודל האוכלוסייה לטווח ארוך יעיל של הניאנדרטלים היה קטן יותר מזה של האדם המודרני ואת קופי הקיימים.

Protocol

בשיטה זו נעשה שימוש במחקר דיווחו בריגס et al. Science 325 (5938). 318-321 (2009) .

ריאגנטים הנדרש:

  • AmpliTaq זהב פולימראז ה-DNA
  • 10x GeneAmp PCR הצפת II
  • MgCl 2 25mm
  • dNTP לערבב, 25 מ"מ כל
  • ארגון ה-BSA, 10 מ"ג-1 מ"ל מים
  • מים מולקולרית ביולוגיה כיתה
  • EB חיץ (המסופק עם ערכת טיהור MinElute PCR); 10 mM טריס HCl, pH 8.5
  • MinElute PCR ערכת טיהור
  • M-270 streptavidin Dynabeads
  • 2x מחייב לכבס (BW) חוצץ (2 M NaCl, 10 mM טריס-Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0, 0.2% Tween 20)
  • 1x מחייב לכבס (BW) חוצץ (חיץ 2x BindWash 2X מדולל במים)
  • חם לשטוף (HW) חוצץ (2.5mm MgCl, 1X תקי זהב חיץ, 0.1% Tween 20)

לפרטים היצרן לגבי שאינם סטנדרטיים ריאגנטים וציוד בהמשך הטבלה.

1) ספריית הגברה

  1. תבנית ה-DNA כאן היא ספריית 454 שהוכן מקור ה-DNA נמוכה מספר עותק כמתואר (Rohland ו Hofreiter, 2007a, 2007b) ו (Maricic ו Pääbo, 2009). כדי להגביר את הספרייה כולה, להכין את תערובת ה-PCR הבאים:
    מגיב μl לכל תגובה
    מים 45
    10X ג'ין Amp PCR חיץ II 10
    MgCl 2 (25mm) 10
    ארגון ה-BSA (10 מ"ג / מ"ל) 2
    dNTPs (25 מ"מ כל אחד) 1
    454 emPCR FWD primer/10uM 3
    454 emPCR primer/10uM RVs 3
    AmpliTaq זהב פולימראז ה-DNA (5 U / μl) 1
    454 הספרייה תבנית ה-DNA 25
    סך הכל 100
  2. השתמש בתוכנית הבאה PCR ב Cycler Thermo עבור הגברה מחזורים 14
    1. 95 ° C 12min
    2. 95 ° C ה -30
    3. 60 ° C (או זמני חישול הרצוי) 1 דקות
    4. 72 ° C 1 דקות
    5. עבור 2 (x 13)
    6. 72 ° C 5min
    7. 10 ° C ∞
  3. לטהר את התגובה על עמודה Qiagen ספין MinElute על פי הוראות היצרן. Elute ב EB 50 μl חיץ.
  4. לכמת את המוצר מוגבר מטוהרים וכן aliquot הספרייה unamplified עם qPCR (Meyer et al. 2007). אם המוצר מוגבר יש יותר מ 1 X 10 12 עותקים ul, להפחית את כמות תבנית הצעד הבא תחל הרחבה על מנת להבטיח כי לא יותר מ 2 X 10 12 עותקים מתווספים התגובה הרחבה פריימר.

2) Primer Extension

  1. הכינו תערובת אב נדרש מספר של תגובות.
    מגיב μl לכל תגובה
    מים 45
    10X ג'ין Amp PCR חיץ II 10
    MgCl 2 (25mm) 10
    ארגון ה-BSA (10 מ"ג / מ"ל) 2
    dNTPs (25 מ"מ כל אחד) 1
    454 emPCR FWD primer/10uM 3
    454 emPCR primer/10uM RVs 3
    AmpliTaq זהב פולימראז ה-DNA (5 U / μl) 1
    454 הספרייה תבנית ה-DNA 25
    סך הכל 100
  2. הפעל את התוכנית הבאה Thermocycler עבור התגובה פריימר יחיד סיומת:
    1. 95 ° C 12min
    2. 60 ° C (או פריימר PEC שלך חישול זמני אם שונה) 1 דקות
    3. 72 ° C 5 דקות
    4. 72 ° C לנצח!

      שלב קריטי לשמור על התגובה לאחר הארכה על 72 ° C. ואז ישירות פיפטה 150ul PBI או PB חיץ לטיהור MinElute QIAGEN לתוך הצינורות לפני הסרת מהגוש החום. זה חשוב כדי למנוע הלא ספציפית פריימר חישול ללכוד כתערובת מתקררת.
  3. לטהר את התגובה על עמודה ספין Qiagen MinElute, על פי הוראות היצרן. Elute ב EB 50 μl.

3) מוצר הרחבה לכידת

  1. Resuspend פתרון המניות של M-270 חרוזים ידי vortexing. קח את 25 ההשעיה חרוז μl לדגימה. שטפו את החרוזים פעמיים עם 500ul 2x BW חיץ resuspend במאגר 2xBW 25 μl לדגימה.
  2. הוסף 25 μl eluate משלב 2.3 להשעיית 25 חרוז μl משלב 3.1. מערבבים ולאחר מכן סובב עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר.

    מומלץ: לשמור הנותרים 5 ul של eluate מן הצעד 2.3 עבור כימות qPCR.

  3. מעבירים את התערובת כולה צינור 1.5ml טרי (זה עוזר להפחית שריד של יעד שאינם שברי ספריה). גלולה supernatant באמצעות אספן חלקיקים מגנטיים (MPC) וכן לבטל את supernatant.
  4. לשטוף 5 פעמים עם חיץ 1xBW 500 μl (שוטף רבים לעזור להסיר את הרקע כמה שיותר). לאחר שלב הכביסה האחרונה, התפנית כלפי מטה בקצרה ולהסיר את שאריות supernatant.
  5. הוסף 500μl 1x חם לשטוף (HW) חיץ. Shake דקות 2 ב 65 ° C (או 5C מעל פריימר PEC TM) על בלוק תרמי. הסר את supernatant מהר אחרי זה, כדי למזער להתקרר. (שלב זה היא להסיר קטעים הקשורים ברקע עדיין עם primers PEC אך לא הוארכה למעשה על שלב במהלך ההארכה). הסר את שאריות supernatant.
  6. Resuspend גלולה חרוז במאגר 30 EB μl. מעבירים את התערובת כולה צינור 1.5ml טרי (זה עוזר להפחית שריד של יעד שאינם שברי ספריה). לדגור על 95 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות Cycler תרמית עבור elution. המקום של MPC ולהסיר את supernatant, מקפיד להשאיר את החרוזים מאחור.

4) לכידת הגברה מוצר

  1. הכינו תערובת מאסטר PCR עבור מספר דגימות הנדרש.
    מגיב μl לכל תגובה
    מים 45
    10X ג'ין Amp PCR חיץ II 10
    MgCl 2 (25mm) 10
    ארגון ה-BSA (10 מ"ג / מ"ל) 2
    dNTPs (25 מ"מ כל אחד) 1
    454 emPCR FWD primer/10uM 3
    454 emPCR primer/10uM RVs 3
    AmpliTaq זהב פולימראז ה-DNA (5 U / μl) 1
    ללכוד eluted המוצר 25
    סך הכל 100
  2. השתמש בתוכנית הבאה PCR ב Cycler Thermo עבור הגברה 14 מחזורים:
    1. 95 ° C 12min
    2. 95 ° C ה -30
    3. 60 ° C (או זמני חישול הרצוי) 1 דקות
    4. 72 ° C 1 דקות
    5. עבור 2 (x 13)
    6. 72 ° C 5min
    7. 10 ° C ∞
  3. לטהר את התגובה על טור MinElute Qiagen ספין סיליקה על פי הוראות היצרן. Elute במאגר 50 EB μl. המוצר יכול לשמש גם עכשיו לסיבוב השני של ללכוד, החל שלב 2.1, או נכנס ישירות לתוך 454 תחליב PCR פרוטוקול, עבור סידור.

נציג תוצאות:

מומלץ מאוד כאשר מתחיל עם פרוטוקול PEC לבצע התגובה הראשונה ללכוד בו כמות קטנה של "רצף מטרה חיובית שליטה" (לדוגמה ~ 100bp מוצר PCR - 1 picogram די בקלות) מעורבב עם הרגיל מומלץ כמות מוגברת 454 תבנית הספרייה (ראה שלב 2.1), ו ללכוד מתבצע עם פריימר PEC אחת שנועדה ללכוד את המוצר בקרה חיובית. אם זו התגובה השליטה מתבצעת, qPCR עם שני חיובית שליטה ספציפיים ספציפי מתאם 454 זוגות פריימר ניתן לכמת את כמות "המטרה לשלוט" לעומת רקע התגובה מטוהרים פריימר הארכה (1.3), הרחבה המוצר פריימר (2.3 ) וללכוד eluted מוצר חרוז (3.6). בדרך זו, הן האפקטיביות של הסרת רקע ("סגוליות") וכן את היעילות של התאוששות היעד ("רגישות") בתנאי הניסוי שלך ניתן למדוד ישירות.

מוצלח PEC פרוטוקול בדרך כלל יש את המאפיינים הבאים -

רגישות (נמדד על ידי כמות היעד השליטה נשמרת באמצעות פרוטוקול):
סך מטרה לשלוט במוצר eluted ללכוד חרוז (3.6) = ~ 10-20% מהסכום הכולל מטוהרים הארכת תחל תגובה (2.3).

רקע (נמדד על ידי זוג 454 תחל emPCR):
סך רקע במוצר eluted ללכוד חרוז (3.6) <0.01% מהסכום הכולל בתגובה מטוהרים פריימר הארכה (2.3).

אם יש פחות מ -1% של יעד שנותרו המוצר הסופי, הצעד הרחבה פריימר יכול להיות מוצלח וצריכים להיחקר.

אם יש הרבה יותר מאשר 0.01% על רקע שנותרו המוצרים הסופיים, צעדים הכביסה יכול להיות מבוצע בצורה לא נכונה ויש לחקור.

Discussion

השיטה PEC היא פשוטה, מהירה, רגיש וספציפי. לכן אנו חוזים כותבי יישומים מרובים מחוץ DNA עתיק, כמו לכידת קטן שברי RNA מספריית RNA, חקירה של וריאציה מבניים מדגם ונקווה או לכידתו של 16S (לוקוסים או אחרים) גיוון ממדגם metagenomic. נקודה אחת להזכיר כי הרגישות של ללכוד הופך להיות נמוך יותר ככל שמספר PEC primers ב ללכוד מגדילה זמנית התגובה. PEC ולכן הוא לא אידיאלי עבור לכידת האזורים ללכוד גדול מאוד (למשל megabase או יותר), אך הוא מתאים מאוד גם עבור לכידת האזורים היעד קטן או אפילו עמדות SNP מאנשים רבים באופן מהיר.

Acknowledgments

אנו מודים M. Meyer לקבלת ייעוץ; האקדמיה הקרואטית למדעים ולאומנויות והאקדמיה ברלין ברנדנבורג למדעים עבור תמיכה לוגיסטית ומדעית; וקרן חדשנות הנשיאותי של מקס פלאנק החברה עבור תמיכה כספית. JMG נתמך על ידי מענק NSF הבינלאומי דוקטורט (Oise-0754461). רצפים מופקדים על מסד הנתונים EBI נוקלאוטיד עם מספרים הצטרפות: Neandertal 1 (Feldhofer 1) FM865407, Neandertal 2 (Feldhofer 2) FM865408, Sidron 1253 FM865409, Vindija 33.25 FM865410, Mezmaiskaya 1 FM865411

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AmpliTaq Gold polymerase with GeneAmp PCR buffer II and MgCl2 Applied Biosystems N8080241
QIAGEN MinElute PCR purification kit Qiagen 28004
M-270 streptavidin beads Invitrogen 653.05
Tween-20 Sigma-Aldrich P2287
DynaMag-2 magnetic particle separator Invitrogen 120.02D

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Briggs, A. W., Good, J. M., Green, R. E., Krause, J., Maricic, T., Stenzel, U., Lalueza-Fox, C., Rudan, P., Brajkovic, D., Kucan, Z. Targeted retrieval and analysis of five Neandertal mtDNA genomes. Science. 325, (5938), 318-321 (2009).
  2. Rohland, N., Hofreiter, M. Comparison and optimization of ancient DNA extraction. Biotechniques. 42, (3), 343-352 (2007).
  3. Rohland, N., Hofreiter, M. Ancient DNA extraction from bones and teeth. Nat Protoc. 2, (7), 1756-1762 (2007).
  4. Maricic, T., Pääbo, S. Optimization of 454 sequencing library preparation from small amounts of DNA permits sequence determination of both DNA strands. Biotechniques. 46, (1), 51-57 (2009).
  5. Meyer, M., AW, B. riggs, Maricic, T., Hober, B., Hoffner, B., Krause, J., Weihmann, A., Paabo, S., Hofreiter, M. From micrograms to picograms: quantitative PCR reduces the material demands of high-throughput sequencing. Nucleic Acids Res. 36, (1), e5-e5 (2007).

Comments

9 Comments

  1. thank you for sharing ! PEC ,it`s still confused in my mind ,can you explain it more commonly ?

    Reply
    Posted by: Qiu Q.
    March 28, 2010 - 10:55 AM
  2. Do you have any recommendation in designing biotinylated primers?
    And, how many independent target biotin-primers could be pooled in a reaction?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 15, 2010 - 2:08 AM
  3. Primer optimal Tm = 60C (the target-specific part of the primer). Avoid similarity to repetitive DNA elements.

    Up to 150 primers can be used in a single reaction, more are not recommended although it has not been not extensively tested

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 15, 2010 - 9:47 AM
  4. I read in the sup data from your original paper describing PEC that when designing primers you had also avoided complementarity to adaptors A and B. However it looks pretty much like these sequences are somewhat embargŒd by Roche. Of course, it is still possible to clone the adaptors but I guess you already did so (or managed getting the info from Roche?). Could you provide these seqs? Further, in your experience, are many primers discarded because of that kind of complementarity (guess that Roche designed the adaptors to only fit martian DNA:-)? Finally do you also check autocomplementarity of the spacer+specific primer sequences?
    Many thanks in advance!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 6, 2010 - 8:28 AM
  5. Hi
    We used the Roche 454-FLX adaptor sequences, which are published (e.g. Margulies et al, Nature ²005). The 454-Titanium adaptor sequences may be embargŒd, I don't know. If you really can't get the sequences you wish to use you can try it without the filtering step in primer design - not many primers get discarded in the process I used (maybe 1% of designs). Illumina sequences are known if you can use that platform.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 6, 2010 - 10:23 AM
  6. We haven't ever checked autocomplementarity of the primer and spacer sequence.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 6, 2010 - 10:25 AM
  7. Were your oligos biotinylated with simple biotin or biotin TEG? What purification method did you choose (DSL, HPLC...)?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 6, 2010 - 9:53 AM
  8. Many thanks in advance of course!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 6, 2010 - 9:57 AM
  9. I used simple biotin and HPLC purification for the oligos.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 6, 2010 - 10:04 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics