프라이머 확장 캡처 : 경비 저하 DNA 소스에서 타겟 시퀀스 불러오기

Biology
 

Summary

우리는 우리가 5 Neandertal 개인의 전체 mitochondrial genomes을 재구성하는 데 사용되는 타겟으로 고대 DNA 시퀀스 검색의 방법을 제시한다. 현재 일 인간과 함께 이러한 시퀀스 비교 Neandertals가 장기 낮은 효과적인 인구의 크기 있다고 제안합니다.

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Briggs, A. W., Good, J. M., Green, R. E., Krause, J., Maricic, T., Stenzel, U., Pääbo, S. Primer Extension Capture: Targeted Sequence Retrieval from Heavily Degraded DNA Sources. J. Vis. Exp. (31), e1573, doi:10.3791/1573 (2009).

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Abstract

고대 유골의 전형이므로 우리는 크게 저하 및 미생물의 DNA로 오염되어 DNA 소스로부터 타겟 DNA 시퀀스 검색하는 방법을 제시. 방법은 크게 샘플 파괴 및 PCR이나 샷건 배열 접근 방식을 직접 상대 시퀀싱 요구 사항을 줄일 수 있습니다. 우리가 그들의 지리적인 범위에 걸쳐을 다섯 Neandertals의 전체 mitochondrial DNA (mtDNA) genomes를 재구성하기 위해이 메서드를 사용합니다. 후반 Neandertals의 mtDNA 유전 다양성은 현대 현대 인간의 그것보다 약 세 배 낮은되었다. 함께 mtDNA 단백질 진화의 분석과 함께, 이러한 데이터는 Neandertals의 장기적 효과적인 인구의 크기는 현대 인간과 무언가 큰 원숭이의보다 작은 것을 권장합니다.

Protocol

이 방법에 보고된 연구에 사용된 브릭스 외., 과학 325 (5938)가. 318-321 (2009) .

시약이 필요합니다 :

  • AmpliTaq 골드의 DNA 중합 효소
  • 10X GeneAmp PCR 버퍼 II
  • MgCl 2 25mM
  • dNTP 혼합물, 25 MM 각
  • 물에 BSA, 10 MG ML - 1
  • 분자 생물학 수준의 물
  • EB 버퍼 (MinElute PCR의 정제 키트와 함께 제공된), 10 MM 트리스 HCL, pH를 8.5
  • MinElute PCR의 정제 키트
  • M - 270 streptavidin Dynabeads
  • 2X 바인딩 및 씻으 (BW) 버퍼 (2 M NaCl, 10 MM 트리스 - CL, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0, 0.2 % 트윈 20)
  • 1X 바인딩 및 씻으 (BW) 버퍼 (2X BindWash 버퍼 물에 배 희석)
  • 핫 와시 (HW) 버퍼 (2.5mM MgCl, 1X DNA 형성 촉매 골드 버퍼, 0.1 % 트윈 20)

비표준 시약 및 장비에 대한 제조 업체 정보는 나중에 테이블을 참조하십시오.

1) 도서관 증폭

  1. 여기서 DNA 템플릿은 낮은 사본 번호의 DNA로 설명 소스 (Rohland 및 Hofreiter, 2007a, 2007b)와 (Maricic 및 Pääbo 2009)에서 준비 454 라이브러리이다. 전체 라이브러리를 증폭하려면 다음 PCR 믹스를 준비 :
    시약 반응 당 μl
    45
    10X 진 앰프 PCR 버퍼 II 10
    MgCl 2 (25mM) 10
    BSA (10 MG / ML) 2
    dNTPs (25 MM 각) 1
    454 emPCR fwd primer/10uM 3
    454 emPCR의 RVS의 primer/10uM 3
    AmpliTaq 골드의 DNA 중합 효소 (5 U / μl) 1
    454 DNA 라이브러리 템플릿 25
    합계 100
  2. 14주기의 증폭을위한 써모 자전거 타는 사람에 다음과 PCR 프로그램을 사용하여
    1. 95 ° C 12min
    2. 95 ° C 30
    3. 60 ° C (또는 원하는 어닐링 온도) 1 분
    4. 72 ° C 1 분
    5. 2 (X 13)로 이동
    6. 72 ° C 5 분
    7. 10 ° C ∞
  3. 제조 업체의 지시에 따라 Qiagen MinElute의 스핀 컬럼을 통해 반응을 정화. 50 μl 버퍼 EB에 Elute.
  4. 정화 증폭 제품뿐만 아니라 qPCR (메이어 외., 2007)와 unamplified 라이브러리의 나누어지는을 수량. 증폭 제품이 UL 당 이상의 1 X 10 12 사본이있는 경우가 아니라 2 개 이상 X 10 12 복사본 뇌관 확장 반응에 추가되는 것을 보장하기 위해 다음과 같은 프리머 확장 단계에서 템플릿의 양을 줄일 수 있습니다.

2) 프리머 확장

  1. 반응의 필요한 번호에 대한 마스터 믹스를 준비합니다.
    시약 반응 당 μl
    45
    10X 진 앰프 PCR 버퍼 II 10
    MgCl 2 (25mM) 10
    BSA (10 MG / ML) 2
    dNTPs (25 MM 각) 1
    454 emPCR fwd primer/10uM 3
    454 emPCR의 RVS의 primer/10uM 3
    AmpliTaq 골드의 DNA 중합 효소 (5 U / μl) 1
    454 DNA 라이브러리 템플릿 25
    합계 100
  2. 단일 뇌관 확장 반응에 대한 Thermocycler에서 다음 프로그램을 실행 :
    1. 95 ° C 12min
    2. 60 ° C (또는 다른 경우 PEC의 프라이머는 온도 어닐링) 1 분
    3. 72 ° C 5 분
    4. 72 ° C 영원히!

      임계 단계 72에서 연장 후 반응을 유지 ° C. 열 블록 제거하기 전에 튜브에 QIAGEN MinElute 정화를위한 다음 직접 피펫 150ul PBI 또는 PB 버퍼. 이것은 어닐링이 아닌 구체적인 프라이머를 방지하고 혼합물은 냉각으로 캡처하는 것이 중요합니다.
  3. 제조 업체의 지시에 따라, Qiagen MinElute의 스핀 컬럼을 통해 반응을 정화. 50 μl EB에 Elute.

3) 확장 제품 캡처

  1. vortexing하여 M - 270 구슬 Resuspend 주식 솔루션입니다. 샘플 당 25 μl 비드 정지를 가져가라. 샘플 당 25 μl 2xBW 버퍼에 500ul 배 BW 버퍼와 resuspend로 두 번 구슬을 씻으십시오.
  2. 단계 3.1 25 μl 구슬 중지 단계 2.3 25 μl eluate를 추가합니다. 1 회전 후 믹스상온에서 5 분.

    추천 : qPCR의 부량을위한 단계를 2.3에서 eluate 5 UL을 나머지 계속.

  3. 신선한 1.5ml 튜브에 전체 혼합물을 전송합니다 (이 아닌 대상 라이브러리 조각 carryover을 줄이기 위해 도움). 펠렛 마그네틱 입자 수집기 (MPC)를 사용 뜨는 및 뜨는 폐기하십시오.
  4. 500 μl 1xBW 버퍼 (많은 세척은 가능한 한 많은 배경으로 제거하는 데 도움이) 5 번 씻으십시오. 마지막 세척 단계 후, 잠시 스핀 다운 및 뜨는의 마지막 흔적을 제거합니다.
  5. 500μl 1X 핫 와시 (HW) 버퍼를 추가합니다. 65 2 분 흔들 ° C (또는 PEC 뇌관 TM 위 5C) 열 블록에. 아래로 냉각 최소화하기 위해,이 후 신속하게 뜨는을 제거합니다. (이 단계는 아직 PEC primers 아니라 실제로 확장 단계 동안에 확장과 관련된 배경 조각을 제거하는 것입니다.) 뜨는의 마지막 흔적을 제거합니다.
  6. 30 μl EB 버퍼에 비드 펠렛을 Resuspend. 신선한 1.5ml 튜브에 전체 혼합물을 전송합니다 (이 아닌 대상 라이브러리 조각 carryover을 줄이기 위해 도움). 용출을위한 열 자전거 타는 사람 3 분 95 ° C에서 알을 품다. MPC에서 개최하고 뒤에 구슬을 떠나 아끼 뜨는을 제거합니다.

4) 제품 증폭 캡처

  1. 샘플 필요한 번호에 대한 PCR 마스터 믹스를 준비합니다.
    시약 반응 당 μl
    45
    10X 진 앰프 PCR 버퍼 II 10
    MgCl 2 (25mM) 10
    BSA (10 MG / ML) 2
    dNTPs (25 MM 각) 1
    454 emPCR fwd primer/10uM 3
    454 emPCR의 RVS의 primer/10uM 3
    AmpliTaq 골드의 DNA 중합 효소 (5 U / μl) 1
    Eluted 캡처 제품 25
    합계 100
  2. 14주기의 증폭을위한 써모 자전거 타는 사람에 다음과 PCR 프로그램을 사용 :
    1. 95 ° C 12min
    2. 95 ° C 30
    3. 60 ° C (또는 원하는 어닐링 온도) 1 분
    4. 72 ° C 1 분
    5. 2 (X 13)로 이동
    6. 72 ° C 5 분
    7. 10 ° C ∞
  3. 제조 업체의 지시에 따라 Qiagen MinElute 실리카 스핀 컬럼을 통해 반응을 정화. 50 μl EB 버퍼에 Elute. 이 제품은 현재 2.1 단계에서 시작, 또는 시퀀싱을위한 454 유제 PCR 프로토콜에 직접 입력, 캡쳐의 두 번째 라운드 모두에 대해 사용할 수 있습니다.

대표 결과 :

권장 정상으로 혼합입니다 - '긍정적인 제어 대상 시퀀스'(1 picogram 쉽게 충분 예 ~ 100bp PCR 제품)의 소량 처음 캡처 반응을 수행할 수있는 PEC 프로토콜로 밖으로 시작할 때 그것은 강력하게 권장합니다 의 금액은 (단계 2.1 참조) 454 라이브러리 템플릿을 증폭하고, 캡처가 긍정적인 제어 제품을 캡처하기위한 하나의 PEC의 입문서로 수행됩니다. 모두 제어 특정 긍정적이고 454 어댑터 특정 프라이머 쌍이 제어 반응이 수행되는 경우, qPCR은 정화 뇌관 확장 반응 (1.3), 뇌관 확장 제품 (2.3의 배경 비해 '관리 대상'의 양을 계량하는 데 사용할 수 있습니다 )와 eluted 비드 캡처 제품 (3.6). 이러한 방법으로 귀하의 실험 조건에서 배경 제거 ( "특이성") 및 대상 복구 ( "감도")의 효율성의 두 효과를 직접 측정할 수 있습니다.

성공 PEC 프로토콜은 일반적으로 다음과 같은 속성을 가지고 -

감도 (프로토콜에 의해 유지 관리 대상의 금액으로 측정) :
eluted 비드 캡처 제품 제어 대상의 총 금액 (3.6) = ~ 뇌관 확장 반응 (2.3) 정화 총 금액의 10~20%.

배경 (454 emPCR의 프라이머 쌍에 의해 측정) :
eluted 비드 캡처 제품 (3.6)에서 배경 총 금액 <정화 뇌관 확장 반응 (2.3)에서 총 금액의 0.01 %.

최종 제품에 남아있는 대상의 1 % 미만이있다면, 뇌관 확장 단계가 실패되었을 수 있으며, 조사해야합니다.

최종 제품에 남아있는 배경의 0.01 %보다 훨씬 더있다면, 세탁 단계는 잘못 수행되었을 수 있으며, 조사해야합니다.

Discussion

PEC 방법은 간단하고 빠르고, 민감하고 구체적인 것입니다. 따라서 이러한 RNA 라이브러리의 작은 RNA 조각의 캡쳐, 풀링 샘플 또는 metagenomic 샘플에서 16 (또는 다른 loci) 다양성을 캡처에 구조적 변화의 심문으로 고대 DNA 이외 우리는 저자의 관찰하다 여러 응용 프로그램. 언급 한 지점은 캡처의 감도가 다중 캡처 반응 증가 PEC primers의 번호로 낮은 될 것입니다. PEC 따라서 이상 (예 : megabase 이상) 매우 큰 캡쳐 영역의 포착에 적합 아니지만 아주 잘 신속한 방식으로 많은 사람의 작은 대상 지역 또는 SNP 위치의 포착에 적합합니다.

Acknowledgments

과학 예술 아카데미 크로아티아와 물류 및 과학 지원을 위해 과학 베를린 - 브란 덴 부르크 아카데미, 및 ​​재정적 지원에 대한 최대 플랑크 협회의 대통령 혁신 기금 우리는 조언 M. 마이어 감사합니다. JMG는 NSF 국제 박사 교제 (우아즈 - 0754461)에 의해 지원되었다. Neandertal 1 (Feldhofer 1) FM865407, Neandertal 2 (Feldhofer 2) FM865408, Sidron 1253 FM865409, Vindija 33.25 FM865410, Mezmaiskaya 1 FM865411 : 시퀀스는 가입 번호와 에비 뉴클레오 티드 데이터베이스에 쌓인 거죠

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AmpliTaq Gold polymerase with GeneAmp PCR buffer II and MgCl2 Applied Biosystems N8080241
QIAGEN MinElute PCR purification kit Qiagen 28004
M-270 streptavidin beads Invitrogen 653.05
Tween-20 Sigma-Aldrich P2287
DynaMag-2 magnetic particle separator Invitrogen 120.02D

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References

  1. Briggs, A. W., Good, J. M., Green, R. E., Krause, J., Maricic, T., Stenzel, U., Lalueza-Fox, C., Rudan, P., Brajkovic, D., Kucan, Z. Targeted retrieval and analysis of five Neandertal mtDNA genomes. Science. 325, (5938), 318-321 (2009).
  2. Rohland, N., Hofreiter, M. Comparison and optimization of ancient DNA extraction. Biotechniques. 42, (3), 343-352 (2007).
  3. Rohland, N., Hofreiter, M. Ancient DNA extraction from bones and teeth. Nat Protoc. 2, (7), 1756-1762 (2007).
  4. Maricic, T., Pääbo, S. Optimization of 454 sequencing library preparation from small amounts of DNA permits sequence determination of both DNA strands. Biotechniques. 46, (1), 51-57 (2009).
  5. Meyer, M., AW, B. riggs, Maricic, T., Hober, B., Hoffner, B., Krause, J., Weihmann, A., Paabo, S., Hofreiter, M. From micrograms to picograms: quantitative PCR reduces the material demands of high-throughput sequencing. Nucleic Acids Res. 36, (1), e5-e5 (2007).

Comments

9 Comments

  1. thank you for sharing ! PEC ,it`s still confused in my mind ,can you explain it more commonly ?

    Reply
    Posted by: Qiu Q.
    March 28, 2010 - 10:55 AM
  2. Do you have any recommendation in designing biotinylated primers?
    And, how many independent target biotin-primers could be pooled in a reaction?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 15, 2010 - 2:08 AM
  3. Primer optimal Tm = 60C (the target-specific part of the primer). Avoid similarity to repetitive DNA elements.

    Up to 150 primers can be used in a single reaction, more are not recommended although it has not been not extensively tested

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 15, 2010 - 9:47 AM
  4. I read in the sup data from your original paper describing PEC that when designing primers you had also avoided complementarity to adaptors A and B. However it looks pretty much like these sequences are somewhat embargŒd by Roche. Of course, it is still possible to clone the adaptors but I guess you already did so (or managed getting the info from Roche?). Could you provide these seqs? Further, in your experience, are many primers discarded because of that kind of complementarity (guess that Roche designed the adaptors to only fit martian DNA:-)? Finally do you also check autocomplementarity of the spacer+specific primer sequences?
    Many thanks in advance!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 6, 2010 - 8:28 AM
  5. Hi
    We used the Roche 454-FLX adaptor sequences, which are published (e.g. Margulies et al, Nature ²005). The 454-Titanium adaptor sequences may be embargŒd, I don't know. If you really can't get the sequences you wish to use you can try it without the filtering step in primer design - not many primers get discarded in the process I used (maybe 1% of designs). Illumina sequences are known if you can use that platform.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 6, 2010 - 10:23 AM
  6. We haven't ever checked autocomplementarity of the primer and spacer sequence.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 6, 2010 - 10:25 AM
  7. Were your oligos biotinylated with simple biotin or biotin TEG? What purification method did you choose (DSL, HPLC...)?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 6, 2010 - 9:53 AM
  8. Many thanks in advance of course!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 6, 2010 - 9:57 AM
  9. I used simple biotin and HPLC purification for the oligos.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 6, 2010 - 10:04 AM

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