Captura Primer Extensão: Recuperação Sequence alvejado a partir de Fontes de DNA altamente degradadas

Biology
 

Summary

Nós apresentamos um método de recuperação de seqüência de DNA alvo antigo, que usamos para reconstruir o genoma mitocondrial completo de cinco indivíduos Neandertal. Comparação dessas seqüências com os seres humanos hoje sugere que os neandertais tinham um longo prazo o tamanho da população de baixa eficácia.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Briggs, A. W., Good, J. M., Green, R. E., Krause, J., Maricic, T., Stenzel, U., Pääbo, S. Primer Extension Capture: Targeted Sequence Retrieval from Heavily Degraded DNA Sources. J. Vis. Exp. (31), e1573, doi:10.3791/1573 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Nós apresentamos um método de recuperação de DNA alvo seqüência a partir de fontes de DNA que são altamente degradadas e contaminadas com DNA microbial, como é típico de ossos antigos. O método reduz destruição da amostra e as exigências em relação ao sequenciamento direto PCR ou abordagens seqüenciamento shotgun. Usamos este método para reconstruir a completa DNA mitocondrial (DNAmt) genomas de cinco neandertais de toda a sua abrangência geográfica. A diversidade genética do mtDNA neandertais final foi de aproximadamente três vezes menor do que o de humanos modernos contemporâneos. Juntamente com análises de mtDNA evolução de proteínas, estes dados sugerem que a longo prazo tamanho efetivo da população de neandertais era menor do que o de humanos modernos e os grandes símios existentes.

Protocol

Este método foi utilizado na pesquisa relatada em Briggs et al. Ciência 325 (5938). 318-321 (2009) .

Reagentes necessários:

  • AmpliTaq Polimerase DNA de Ouro
  • 10x GeneAmp PCR buffer II
  • MgCl 2 25mM
  • dNTP mix, 25 mM de cada
  • BSA, 10 mg ml-1 em água
  • Água de biologia molecular grau
  • EB buffer (fornecido com MinElute kit de purificação PCR), 10 mM Tris HCl, pH 8,5
  • MinElute Kit de Purificação PCR
  • M-270 estreptavidina Dynabeads
  • 2x Encadernação e Wash (BW) tampão (2 M NaCl, 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8,0, 0,2% Tween 20)
  • 1x Encadernação e Tampão de lavagem (BW) (2x tampão 2X BindWash diluída em água)
  • Hot Wash (HW) buffer (2.5mm MgCl, 1X tampão Taq ouro, 0,1% Tween 20)

Para informações sobre o fabricante quanto fora do padrão de reagentes e equipamentos mais tarde tabela.

1) ampliação da Biblioteca

  1. O modelo de DNA aqui é uma biblioteca de 454 preparados a partir de uma baixa fonte de DNA no número de cópias conforme descrito em (Rohland e Hofreiter, 2007a, 2007b) e (Maricic e Pääbo, 2009). Para amplificar toda a biblioteca, prepare a mistura PCR seguinte:
    Reagente mL por reação
    Água 45
    10X Gene Amp PCR buffer II 10
    MgCl 2 (25mM) 10
    BSA (10 mg / ml) 2
    dNTPs (25 mM cada) 1
    454 emPCR fwd primer/10uM 3
    454 emPCR primer/10uM rvs 3
    AmpliTaq DNA polimerase Gold (5 U / mL) 1
    454 modelo de biblioteca de DNA 25
    Total 100
  2. Use o programa de PCR a seguir em um cycler Thermo por 14 ciclos de amplificação
    1. 95 ° C 12min
    2. 95 ° C 30
    3. 60 ° C (temperatura de recozimento ou desejado) 1 min
    4. 72 ° C 1 min
    5. Ir para 2 (x 13)
    6. 72 ° C 5min
    7. 10 ° C ∞
  3. Purificar a reação sobre uma coluna de spin Qiagen MinElute acordo com as instruções do fabricante. Eluir em 50 mL tampão EB.
  4. Quantificar o produto purificado amplificado, bem como uma alíquota da biblioteca sem amplificação com qPCR (Meyer et al., 2007). Se o produto amplificado tem mais de 1 X 10 12 cópias por ul, reduzir a quantidade de modelo na etapa seguinte Primer Extension para garantir que não mais de 2 X 10 12 cópias são adicionados à reação de extensão Primer.

2) Extensão Primer

  1. Prepare uma mistura mestre para o número necessário de reações.
    Reagente mL por reação
    Água 45
    10X Gene Amp PCR buffer II 10
    MgCl 2 (25mM) 10
    BSA (10 mg / ml) 2
    dNTPs (25 mM cada) 1
    454 emPCR fwd primer/10uM 3
    454 emPCR primer/10uM rvs 3
    AmpliTaq DNA polimerase Gold (5 U / mL) 1
    454 modelo de biblioteca de DNA 25
    Total 100
  2. Executar o programa a seguir em um Termociclador para a reação única cartilha extensão:
    1. 95 ° C 12min
    2. 60 ° C (ou a sua cartilha PEC annealing temporário se for diferente) 1 min
    3. 72 ° C 5 min
    4. 72 ° C para sempre!

      Etapa crítica Mantenha reação após a extensão a 72 ° C. Em seguida, diretamente ou pipeta 150ul PBI PB buffer para QIAGEN purificação MinElute nos tubos antes de remover a partir do bloco de calor. Isto é importante para evitar a não-específicas de primer recozimento e captura como a mistura esfriar.
  3. Purificar a reação sobre uma coluna de spin Qiagen MinElute, de acordo com as instruções do fabricante. Eluir em 50 mL EB.

3) Captura de Produto Extensão

  1. Ressuspender solução estoque de M-270 contas em vortex. Retire 25 mL de suspensão talão por amostra. Lave as contas duas vezes com 500ul 2x BW buffer e ressuspender em 25 mL de buffer 2xBW por amostra.
  2. Adicionar 25 mL de eluato passo 2,3-25 mL suspensão talão do passo 3.1. Misture em seguida, gire para 15 min à temperatura ambiente.

    Recomendações: manter restantes 5 ul do eluato a partir do passo 2.3 para quantificação qPCR.

  3. Transfira a mistura toda para um novo tubo de 1,5 ml (o que ajuda a diminuir as transferências de fragmentos não-alvo da biblioteca). Pellet sobrenadante usando o coletor de partículas magnéticas (MPC) e desprezar o sobrenadante.
  4. Lavar 5 vezes com 500 mL de buffer 1xBW (muitas lavagens ajudar a remover como pano de fundo tanto quanto possível). Após a etapa de lavagem passado, girar rapidamente e remover os últimos vestígios do sobrenadante.
  5. Adicionar 500μl 1x Hot Tampão de lavagem (HW). Agitar durante 2 min a 65 ° C (ou 5C acima da cartilha PEC Tm) em um bloco térmico. Retire o sobrenadante rapidamente após isso, para minimizar a arrefecer. (Este passo é para remover fragmentos de fundo ainda associados com o PEC primers, mas não realmente estendido no durante a etapa de extensão). Remove os últimos vestígios do sobrenadante.
  6. Ressuspender o sedimento talão em 30 mL tampão EB. Transfira a mistura toda para um novo tubo de 1,5 ml (o que ajuda a diminuir as transferências de fragmentos não-alvo da biblioteca). Incubar a 95 ° C por 3 minutos em um termociclador para a eluição. Lugar no MPC e remover o sobrenadante, tomando cuidado para deixar as contas para trás.

4) Captura de amplificação Produto

  1. Prepare uma mistura mestre PCR para o número necessário de amostras.
    Reagente mL por reação
    Água 45
    10X Gene Amp PCR buffer II 10
    MgCl 2 (25mM) 10
    BSA (10 mg / ml) 2
    dNTPs (25 mM cada) 1
    454 emPCR fwd primer/10uM 3
    454 emPCR primer/10uM rvs 3
    AmpliTaq DNA polimerase Gold (5 U / mL) 1
    Produto de captura eluída 25
    Total 100
  2. Use o programa de PCR a seguir em um cycler Thermo por 14 ciclos de amplificação:
    1. 95 ° C 12min
    2. 95 ° C 30
    3. 60 ° C (temperatura de recozimento ou desejado) 1 min
    4. 72 ° C 1 min
    5. Ir para 2 (x 13)
    6. 72 ° C 5min
    7. 10 ° C ∞
  3. Purificar a reação sobre uma coluna de spin Qiagen MinElute sílica de acordo com as instruções do fabricante. Eluir em 50 mL tampão EB. O produto pode ser usado agora, quer para uma segunda rodada de captação, começando no passo 2.1, ou entrou directamente para o 454 emulsão PCR protocolo, para o seqüenciamento.

Resultados representativos:

É altamente recomendável quando se inicia com o protocolo PEC para realizar uma reação de captura de primeira, onde uma pequena quantidade de uma "seqüência alvo de controlo positivo" (por exemplo, um produto da PCR ~ 100bp - 1 picograma é facilmente suficiente) é misturado com o normal recomendado quantidade de amplificado 454 modelo de biblioteca (veja o passo 2.1), e captura é feita com um primer PEC único projetado para capturar o produto controle positivo. Se essa reação controle é realizado qPCR, com tanto positivos específicos de controle e 454 adaptador específico pares de primers podem ser usados ​​para quantificar a quantidade de 'target controle' versus fundo na reação purificada cartilha de extensão (1,3), produto de extensão de primer (2,3 ) e produto de captura eluída talão (3.6). Desta forma, tanto a eficácia da remoção de fundo ("especificidade") ea eficiência de recuperação de destino ("sensibilidade") em suas condições experimentais podem ser medidos diretamente.

A bem sucedida PEC protocolo normalmente tem as seguintes propriedades -

Sensibilidade (medido pela quantidade de alvo de controle mantidos através do protocolo):
Montante total da meta de controle em produto de captura eluída talão (3.6) = ~ 10-20% do valor total em purificada reação de extensão de primer (2.3).

Fundo (medido pelo par de primer emPCR 454):
Montante total do fundo em produto de captura eluída talão (3.6) <0,01% do montante total em reação purificada cartilha de extensão (2,3).

Se houver menos de 1% da meta remanescentes no produto final, a etapa de extensão de primer pode ter sido mal sucedido e deve ser investigada.

Se há muito mais do que 0,01% do fundo restantes nos produtos finais, os passos de lavagem pode ter sido incorrectamente realizada e deve ser investigada.

Discussion

O método PEC é simples, rápida, sensível e específico. Portanto, os autores prevêem múltiplas aplicações fora DNA antigo, como a captura de pequenos fragmentos de RNA de uma biblioteca de RNA, interrogatório de variação estrutural em uma amostra colectiva ou a captura de 16S (ou outros loci) a diversidade de uma amostra metagenomic. Um ponto a mencionar é que a sensibilidade da captura torna-se menor que o número de PEC primers em uma reação de multiplex aumenta captura. PEC não é, portanto, ideal para captura de regiões de captura muito grande (por exemplo megabase um ou mais), mas é extremamente adequado para a captura de regiões-alvo pequenas ou mesmo posições SNP de muitos indivíduos de uma forma rápida.

Acknowledgments

Agradecemos a M. Meyer para o conselho; A Academia Croata de Ciências e Artes e da Academia de Berlim-Brandenburgo de Ciências para o apoio logístico e científico, e do Fundo de Inovação Presidencial da Sociedade Max Planck para apoio financeiro. JMG foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado internacional NSF (OISE-0754461). Seqüências depositadas no banco de dados EBI de nucleotídeos com os números da adesão: Neandertal 1 (Feldhofer 1) FM865407, Neandertal 2 (Feldhofer 2) FM865408, Sidron 1253 FM865409, Vindija 33,25 FM865410, Mezmaiskaya um FM865411

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AmpliTaq Gold polymerase with GeneAmp PCR buffer II and MgCl2 Applied Biosystems N8080241
QIAGEN MinElute PCR purification kit Qiagen 28004
M-270 streptavidin beads Invitrogen 653.05
Tween-20 Sigma-Aldrich P2287
DynaMag-2 magnetic particle separator Invitrogen 120.02D

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Briggs, A. W., Good, J. M., Green, R. E., Krause, J., Maricic, T., Stenzel, U., Lalueza-Fox, C., Rudan, P., Brajkovic, D., Kucan, Z. Targeted retrieval and analysis of five Neandertal mtDNA genomes. Science. 325, (5938), 318-321 (2009).
  2. Rohland, N., Hofreiter, M. Comparison and optimization of ancient DNA extraction. Biotechniques. 42, (3), 343-352 (2007).
  3. Rohland, N., Hofreiter, M. Ancient DNA extraction from bones and teeth. Nat Protoc. 2, (7), 1756-1762 (2007).
  4. Maricic, T., Pääbo, S. Optimization of 454 sequencing library preparation from small amounts of DNA permits sequence determination of both DNA strands. Biotechniques. 46, (1), 51-57 (2009).
  5. Meyer, M., AW, B. riggs, Maricic, T., Hober, B., Hoffner, B., Krause, J., Weihmann, A., Paabo, S., Hofreiter, M. From micrograms to picograms: quantitative PCR reduces the material demands of high-throughput sequencing. Nucleic Acids Res. 36, (1), e5-e5 (2007).

Comments

9 Comments

  1. thank you for sharing ! PEC ,it`s still confused in my mind ,can you explain it more commonly ?

    Reply
    Posted by: Qiu Q.
    March 28, 2010 - 10:55 AM
  2. Do you have any recommendation in designing biotinylated primers?
    And, how many independent target biotin-primers could be pooled in a reaction?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 15, 2010 - 2:08 AM
  3. Primer optimal Tm = 60C (the target-specific part of the primer). Avoid similarity to repetitive DNA elements.

    Up to 150 primers can be used in a single reaction, more are not recommended although it has not been not extensively tested

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 15, 2010 - 9:47 AM
  4. I read in the sup data from your original paper describing PEC that when designing primers you had also avoided complementarity to adaptors A and B. However it looks pretty much like these sequences are somewhat embargŒd by Roche. Of course, it is still possible to clone the adaptors but I guess you already did so (or managed getting the info from Roche?). Could you provide these seqs? Further, in your experience, are many primers discarded because of that kind of complementarity (guess that Roche designed the adaptors to only fit martian DNA:-)? Finally do you also check autocomplementarity of the spacer+specific primer sequences?
    Many thanks in advance!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 6, 2010 - 8:28 AM
  5. Hi
    We used the Roche 454-FLX adaptor sequences, which are published (e.g. Margulies et al, Nature ²005). The 454-Titanium adaptor sequences may be embargŒd, I don't know. If you really can't get the sequences you wish to use you can try it without the filtering step in primer design - not many primers get discarded in the process I used (maybe 1% of designs). Illumina sequences are known if you can use that platform.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 6, 2010 - 10:23 AM
  6. We haven't ever checked autocomplementarity of the primer and spacer sequence.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 6, 2010 - 10:25 AM
  7. Were your oligos biotinylated with simple biotin or biotin TEG? What purification method did you choose (DSL, HPLC...)?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 6, 2010 - 9:53 AM
  8. Many thanks in advance of course!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 6, 2010 - 9:57 AM
  9. I used simple biotin and HPLC purification for the oligos.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 6, 2010 - 10:04 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics