Härledning av hematopoetiska stamceller från Murine embryonala stamceller

Published 2/25/2007
8 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Detta protokoll detaljer härledning av transplanterbara hematopoetiska stamceller från mus embryonala stamceller (ESC) och den efterföljande injektion i dödligt bestrålade mottagaren möss. Kortfattat är ESC differentierade som embryoid organ, som sedan är infekterade med retrovirus HoxB4 och co-odlade med OP9 stromaceller och hematopoetisk cytokiner.

Cite this Article

Copy Citation

McKinney-Freeman, S., Daley, G. Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (2), e162, doi:10.3791/162 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

En stamcell definieras som en cell med förmåga att både själv förnya och generera flera differentierade avkomma. Embryonala stamceller (ESC) kommer från blastocysten av de tidiga embryot och är pluripotenta i differentiative förmåga. Deras enorma differentiative potential har gjort dem i fokus för mycket forskning inriktade på att kunna utläsa hur man lirka dem att generera kliniskt användbara celltyper. Den framgångsrika härledning av hematopoetiska stamceller (HSC) från mus ESK har nyligen gjorts och kan visualiseras i denna video protokoll. HSC, utan tvekan den mest kliniskt exploaterade cellpopulation, används för att behandla en myriad av hematopoetisk maligniteter och störningar. Men många patienter som kan dra nytta av HSC terapi saknar tillgång till lämpliga givare. ESK skulle kunna utgöra en alternativ källa av HSC för dessa patienter. Följande protokoll upprättas en baslinje från vilken ESC-HSC kan studeras och informera ansträngningar att isolera HSC från mänsklig ESC. I detta protokoll är ESC differentierade som embryoid organ (EBS) i 6 dagar i kommersiellt tillgängliga serum förhandsgranskas för optimal hematopoetisk differentiering. EB är sedan dissocierade och infekterade med retrovirus HoxB4. Infekterade EB-härledda celler är pläterade på OP9 glatta en benmärg stromaceller cellinje härstammar från calvaria av M-CSF-/ - möss, och co-odlade i närvaro av blodbildningen främja cytokiner i tio dagar. Under denna co-kultur, de infekterade cellerna expanderar kraftigt, vilket resulterar i generationen en heterogen grupp av 100s miljontals celler. Dessa celler kan sedan användas för att rädda och återupprätta dödligt bestrålade möss.

Protocol

Differentiering av embryonala stamceller

  1. Samla ett nära konfluenta kolv av embryonala stamceller (ESC) via behandling med ESC trypsin
  2. Resuspendera cellerna i 5 ml Differentiering medier och överför till en icke-gelatin belagda T25 Inkubera vid 37 ° C i 45 minuter. Hämta supernatanten och samla in celler via centrifugering.

    Anm: Musen embryonala fibroblaster (MEFs) från ESK kulturer fäster lätt på de icke-gelatin belagda T25 och därmed är utarmat från kulturen under denna plätering steg. Om du inte är odling dina ESC på MEFs kan du hoppa över pre-plattan.

  3. Resuspendera MEF-utarmat ESC i Differentiering medier vid 333.333 cells/50 ml. Denna koncentration ger 100 ESC/15 ml.
  4. Använda flerkanals pipett, tallrik ESC vid 100 cells/15 mL droppe på 15 cm 2 Petri plattor. Med ett 8-kanals pipett, bör du kunna få in ca 18-22 rader av droppar per platta (ca 5 ml per platta).

    Anm: För detta protokoll kommer 2-5 15 cm 2 rätter av droppar vara mer än tillräckligt och bör ge 2-5 x 10 6 dag sex EB-härledda celler.

  5. Försiktigt vända plattor för att invertera droppar. Inkubera vid 37 ° C 5% CO 2 i 48 timmar.
  6. Pool droppar genom att försiktigt snurra tallrikar och transfer till 15 ml koniska rör. Skölj plattor med 4-6 mL PBS och lägga till samma 15 ml konisk.

    Notera: Du kan pool upp till fem droppe plattor. EBS kommer att växa som de fortsätter att differentiera och om de är för koncentrerade de tenderar att bilda stora klumpar.

  7. Låt poolade EB att lösa genom självtryck (ca 10 minuter). Aspirera supernatanten utan att störa EBS. Försiktigt resuspendera i 10 medier ml Differentiering och överföring till 10 cm icke-häftande Petri platta.
  8. Placera petri plattan på tallriken skak vid 50 rpm och inkubera vid 37 ° C 5% CO 2.
  9. 24 timmar senare (dag fyra av differentiering), att snurra tallrikar koncentrera strandsandaler centrum petriskål. Noggrant utbyte 50% av media (5 ml) med 5 ml färsk Differentiering Media. Återgå plattan inkubator för ytterligare två dagar.

EB dissociation och infektion med MSCV-HoxB4-IRES-GFP

  1. På dag sex av differentiering, överföring EBS 15 ml koniska rör. Låt sedimentera av tyngdkraften.
  2. Aspirera medier och återsuspendera i 10 ml PBS. Låt EBS bosätta av tyngdkraften. Aspirera PBS.
  3. Tillsätt 250 ml dissociation enzym mix och 1 mL PBS. Inkubera i 37 ° C vattenbad under 20 minuter, ibland virvlande tub att blanda enzymer och EBS.
  4. Lägg till 8 ml enzym-fria dissociation buffert.
  5. Mal sönder blandning med 5 ml pipett tills EB är helt dissocierade (ca 10 gånger, överdriven pipettering kommer att öka dödsfall inom EB-härledda cellberedningen).
    1. Blandning blir grumlig med celler som EB dissociera.
    2. Placera pipettspetsen mot botten av koniska röret under trituration kommer att skapa en skjuvkraft som kommer att väsentligt underlätta dissociation.
  6. Samla cellerna via centrifugering.
  7. Resuspendera EB-härledda celler i 5 ml 10% IMDM och räkna med trypan blå utanförskap

    Notera: Mellan dag fyra och dag sex av differentiering, EBS kaviterade vilket resulterar i en stor mängd av apoptos och death.Thus cell, på dagen sex, uppåt 30% av EB-härledda celler kan fläcken med trypan blå.

  8. Resuspendera EB-härledda celler vid 100.000 celler / 2 ml 10% IMDM + virus supernatanten så att en MOI på 5-10 är achieved.Add protaminsulfat till en slutlig koncentration av 8 mg / ml.

    OBS: Förbered nog EB / virus supernatanten mix till tallrik fyra 6-brunnars plattor (förutsatt 2 ml / brunn).

  9. Plate 2 ml EB / viralt supernatanten mix per brunn av fyra 6 brunnar före pläterade med OP9 stroma celler (se nedan).
  10. Centrifugera plattorna vid 2500 rpm i rumstemperatur i 90 minuter. Överföring plattorna inkubator vid 37 ° C 5% CO 2.
  11. 4-6 timmar senare skörd supernatanten från tallrikar och samla in eventuella celler kvar i suspension genom centrifugering.
  12. Resuspendera pellet (kan vara små) i 48 ml 10% IMDM + cytokiner. Fördela 2 ml / brunn av resuspension till ursprungliga fyra 6-brunnars plattor där infektion utfördes och supernatanten samlades in.

    Obs: Alltid förbereda 10% IMDM + cytokiner färska vid användningstillfället.

  13. Inkubera plattorna vid 37 ° C 5% CO 2 i sju dagar. Kolonier bör vara uppenbart för dag fyra efter infektion och stora och välformade per dag sju. En robust expansion bör ge 40-60 kolonier / brunn på dag sju.
  14. På dag sju post-infektion, samla in och pool alla celler (inklusive OP9 stroma) från alla brunnar genom behandling med trypsin.

    OBS: INTE kassera supernatanten eller PBS tvättar anställd under trypsin treatment.At denna punkt i kulturen kan vissa kolonier bara löst vidhäftande och det finns många celler floating i suspension.Collect och poolen alla tvättar och supernatanten att säkerställa att inga potentiellt värdefulla celler kasseras.

  15. Resuspendera cellerna i 8 ml färsk 10% IMDM + cytokiner. Fördela 2 mls / kolv i fyra T75 kolvar. Lägg till ytterligare 13 mls 10% cytokiner IMDM + till varje kolv. Inkubera vid 37 ° C 5% CO 2 i tre dagar (totalt tio dagar efter infektion).

Kultur och plätering av OP9 stroma

  1. Behåll OP9 glatta enligt standardprotokoll i 20% a-MEM. OP9 celler kommer att ändra egenskaper när vuxit till confluency Alltid dela på 80% confluency på högst 1:03 split.
  2. 24 timmar före infektion i dag sex EB-härledda celler med MSCV-HoxB4-IRES-GFP, plåt 25.000 OP9 celler / brunn av fyra 6-brunnars plattor i 20% a-MEM.

Insamling, fraktionering och transplantation

  1. Samla celler expanderat på OP9 stroma i tio dagar genom behandling med trypsin. Räkna celler.

    OBS: INTE kassera supernatanten eller PBS tvättar anställd under trypsin behandling. Vid denna punkt i kulturen kan vissa kolonier bara löst vidhäftande och det finns många celler flytande i suspension.Collect och poolen alla tvättar och supernatanten att säkerställa att inga potentiellt värdefulla celler kasseras.

    OBS: En bra expansion bör ge mellan 40-50 x 10 6 celler / original 6-brunnar infekterade, för totalt 160-200 x 10 6 celler.

  2. Celler kan fraktioneras via magnetisk pärla val eller FACS enligt standardmetoder vid denna punkt i protokollet.
  3. För transplantation, levererar cellerna via retro-orbital eller svansvenen injektion till Rag-2/gc bristfällig mottagare (som väger mellan 15-22 gram) utsätts för en delad dos av 9,25 Gy av bestrålning 2,5 timmar. isär.

    OBS: Det är viktigt att djurens vikt ligger mellan 15-22 gram vid tiden för bestrålning. Om de är större än 22 g kommer 9,25 Gy är inte en tillräcklig dos av strålning för att säkerställa lämplig ablation och cellerna får inte medla räddning från dödliga strålning och / eller ympas på hematopoetisk facket. Om transplantation större djur, måste lämpliga strålningsdos bestämmas experimentellt.

  4. En minsta dos på 2-5 x 10 6 celler / djur är skyldig att garantera rädda från dödliga strålning. Om fraktionering celler, injicera 2-5 x 10 6 celler medel (t ex om befolkningen i ränta motsvarar 10% av ofraktionerat pool av celler, injicera 2-5 x 10 5 celler / djur).

    Obs: Om injicera> 2 x 10 6 celler, Injicera alltid via svansvenen att undvika teratom bildas i omloppsbana, vilket kan medföra när ett stort antal celler levereras retro-orbitally.

  5. Behåll Rag-2 - / - / GC - / - brist mottagare i autoklaveras burar. Beroende på "renhet" av djuret anläggningen, får efter transplantationen djur kräver tillförsel av försurade vatten eller Trimethiprim-Sulfasoxazole (Septra) för 5 veckor efter dödlig strålning.
  6. Räkna med> 90% GFP + ES-derived leukocyter i perifert blod efter 3 veckor efter transplantation. Engraftment bör flera härstamning, även lymfocyter är kända för att tysta retrovirus HoxB4-IRES-GFP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice Animal Taconic Farm
Plate shaker Tool VWR international 33998-360 Orbital Shaker by Ikaworks
Multi-channel pipettor Tool VWR international 15000-174 ePet by BioHit
ES trypsin Reagent Invitrogen 15090-046 0.25% Trypsin in PBS
Standard trypsin Reagent Invitrogen 25300-062 0.05% Trypsin-EDTA
PBS Buffer Invitrogen 20012-027
Enzyme-free dissociation buffer Buffer Invitrogen 13151-014
Dissociation enzyme mix Buffer Invitrogen 17104-019 500 mg Collagenase IV
Hyaluronidase Reagent Sigma-Aldrich H2126 freeze in 500 uL aliquots and avoid repeated freezing and thawing.
DNAse Reagent Sigma-Aldrich D4527
DMEM Invitrogen 10-017CV
Protamine sulfate Reagent Sigma-Aldrich P3369 8 ug/mL
EB differentiation media medium Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM medium Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM+cytokines medium Please view recipe on attached Protocol.doc
20% anti-MEM Please view recipe on attached Protocol.doc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Comments

8 Comments

  1. This protocol looks very helpful for me to study the hematopoietic differentiation from ES cells. I cannot find the attached Protocol.doc for the media recipe. Could I get the media recipe? If it is possible, I would be appreciated if you send me OP9 stroma cells. Thanks. Hee-Don

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 11, 2008 - 11:45 AM
  2. The best place to acquire the OP9 cells is from ATCC themselves - they have the earliest available passages of this cell line.   Please email me directly for media recipe:  shannon.mckinney@childrens.harvard.edu - I cannot see a way to upload the file with it on this post   Shannon

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 11, 2008 - 5:19 PM
  3. Thanks to Shannon for sharing her knowledge and experience with us. This is a ver detailed and amazing video. Y. Seval

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 6, 2008 - 5:18 AM
  4. Did this protocol work for EB formation from iPPS?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 22, 2009 - 4:18 PM
  5. Yes, it dŒs work for iPS cells.  Please see the following reference:  Science. ²007 Dec ²1;318(5858):19²0-3. Epub ²007 Dec 6.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 17, 2009 - 11:58 AM
  6. I was very interested in this approach. Could this be combined with other genes ie MLL fusions or signal transducers. Could you make available to me the vector as wellas the HOXB4 plasmid?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 27, 2009 - 1:33 PM
  7. Send an email to the Daley Lab website to request reagents, please

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 28, 2009 - 8:44 AM
  8. which is the media that do you use for EBs and co-culture on op9 cells?

    thanks very much

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 23, 2011 - 7:06 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats