Fabricação e operação de uma inserção de oxigênio para culturas de células aderentes

Biology
 

Summary

Fabricação e validação de uma plataforma de add-on que oferece maior controle sobre a oxigenação espacial e temporal em uma placa de 6 poços. O dispositivo é adaptável a uma série de sistemas de cultura e pode ser usado para investigar os efeitos do oxigênio na cicatrização de feridas.

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Oppegard, S., Sinkala, E., Eddington, D. Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures . J. Vis. Exp. (35), e1695, doi:10.3791/1695 (2010).

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Abstract

O oxigênio é um modulador-chave de muitos caminhos celulares, mas os dispositivos atuais permitindo

Protocol

1. Função do dispositivo

  1. O dispositivo de inserção hipóxico contém seis pilares que se aninham em uma placa de 6 bem-padrão. Gás passa para o pilar, através de uma rede de microfluídica na base do pilar, e flui de volta para fora do dispositivo. Na base do pilar formando a parede inferior do microcanais é de 100 mm de espessura gás-permeáveis ​​membrana PDMS que permite a difusão de oxigênio entre o gás de microcanais e os meios de cultura. Assim, o dispositivo funciona através da criação de um gradiente de concentração que leva a concentração de oxigênio de mídia para um valor desejado.
  2. O dispositivo oferece uma série de vantagens sobre a câmara de hipóxia e outros sistemas de oxigenação das células: 1) minimiza o caminho de difusão de oxigênio que permite controlar mais rápido temporal, 2) melhora o controle espacial sobre a oxigenação, como dependente do projeto pilar de microcanais, 3) possui um menor consumo de laboratório e um maior rendimento para aumentar a eficiência experimental, e 4) adapta-se às ferramentas de células comuns da cultura (por exemplo, com vários poços da placa) sem a exigência de conhecimento especializado e equipamentos.

2. Fabricação de dispositivos

  1. Primeiro pilar é a matriz réplica moldado com PDMS em um molde Delran previamente usinadas.
  2. Em seguida, o gás de microcanais na parte inferior de cada pilar é fabricado usando o padrão SU-8 fotolitografia e PDMS moldagem réplica.
  3. O gás-permeáveis ​​membrana é fabricada por fiação definido de PDMS em um wafer de silício para atingir a espessura desejada. Neste exemplo usamos uma membrana M 100 de espessura, que foi fabricado por fiação 500 rpm por 10 segundos e, em seguida, 900 rpm por 30 segundos.
  4. Todos os componentes são ligados entre si de oxigênio após o tratamento de plasma com um dispositivo de plasma portátil (modelo BD-20, Electro-Technic Produtos).

3. Configuração do dispositivo

  1. Insira cuidadosamente dispositivo na placa, certificando-se para evitar bolhas. Dobrar o dispositivo durante a inserção ajuda a expelir bolhas para fora um lado. Para reais baseados em células experimentos, esta etapa deve ser feito dentro de uma capa de fluxo laminar estéril. As chances de contaminação são muito reduzidas uma vez que o dispositivo é inserido, de modo que o conjunto pode ser transportados para a incubadora em um ambiente não-estéril.
  2. Conectar mangueira do tanque de gás de origem para as portas de entrada e saída do dispositivo. Para celular baseado em experimentos, a incubadora cultura deve ter um furo para permitir a entrada a tubulação e os tubos devem ser ligados, após o cumprimento do dispositivo e colocá-lo na incubadora. Ter cuidado para evitar uma pressão excessiva sobre o dispositivo, o que pode deformar o PDMS suficiente para esmagar as células subjacentes.
  3. Verifique se o regulador de fluxo de precisão está fechado antes de abrir o regulador de alças para evitar transbordamento do dispositivo. Iniciar o fluxo de gás. Suavemente regulador de fluxo de precisão para abrir vazão desejada (50-100 mL / min). Assista o valor de perto durante a hora seguinte e fazer os ajustes necessários, já que a queda de pressão vai mudar enquanto o sistema equilibra, alterando a taxa de fluxo. Para evitar a formação de bolhas na mídia, reduzir a taxa de fluxo para entre 10-20 mL / min, após uma duração inicial de equilíbrio de 15 minutos com a maior taxa de fluxo.
  4. Depois desejado duração experimental, fechar o gás, retire a placa, e as células processo de conformidade (por exemplo, lyse, mancha, contar, etc.)

4. Validação dispositivo

  1. Calibragem
    1. Selecione o número ea localização das posições sobre o oxigênio fluorescentes
      (FOXY) slides sensor (dependendo dos requisitos de validação) que será utilizado para a medição de oxigênio. O slide contém uma camada de corante fluorescente de rutênio que se apaga por oxigênio.
    2. Expor slides diretamente a 0, 10 e 21% de oxigênio do tanque de gás e capturar imagens depois de 5 minutos para equilíbrio adequado.
    3. Exportar a intensidade da imagem média para cada posição e concentração de oxigenação enredo como dependente da intensidade fluorescente.
    4. Gerar curva de calibração por ajuste de curvas linear para a linha de 00-10% e 10-21% de linha.
  2. Heterogeneidade
    1. Estabelecer vários pontos cobrindo a largura do canal em um intervalo definido (por exemplo, a cada 1 mm). Note-se que pode haver sobreposição de imagens, dependendo do espaçamento.
    2. Medir a concentração de oxigênio na superfície bem através do dispositivo
  3. Equilíbrio
    1. Escolha três pontos no slide FOXY em que para medir a concentração de oxigênio.
    2. Imediatamente após a captura de uma primeira imagem em níveis de oxigênio do ambiente, abra o regulador de fluxo de precisão para iniciar o fluxo de gás para o dispositivo. Capturar imagens em um intervalo adequado para avaliar a duração ea extensão da Concentr oxigênioequilíbrio ation (por exemplo, a cada 10 segundos por 30 min).

5. Aplicações

  1. Cicatrização de feridas
    1. Um dia antes do experimento, mergulhe a esterilizados inserir PDMS no soro meio livre para reduzir a inibir a formação de bolhas de gás no poço.
    2. Células de cultura a 100% confluência em uma placa de seis poços.
    3. Criar riscos em linha reta no monocamadas com uma ponteira p200 para simular ferimentos.
    4. Aspirar a mídia celular, lavar com 5 mL de mídia, e aspirar novamente. É importante para não perturbar a monocamada de células.
    5. Recarga dos poços com 4 meio isento de soro mL para reduzir a proliferação celular.
    6. Inserir local para os poços e conectar cada poço a uma concentração de oxigênio correspondente.
    7. Coloque placa de 6 poços com inserção no palco aquecida a 37 ° C.
    8. Capturar imagens lapso de tempo das células no intervalo desejado e duração total. T_Scratch MATLAB, um algoritmo de medição da ferida, pode ser usado para analisar a superfície não cicatrizadas.

6. Resultados representante

  1. Validação de dispositivos
    O dispositivo de inserção hipóxico apresenta grandes melhorias sobre a câmara hipóxica em termos de tempo de equilíbrio de oxigênio e extensão, necessitando de menos de 2 minutos para estabilizar a 0,5% de oxigênio. A membrana bem-dispositivo tamanho da abertura de fundo era o fator crítico na determinação da eficiência de equilíbrio, com tamanhos maiores lacuna que exigem mais tempo para atingir o estado estacionário valores de concentração de oxigênio. O dispositivo também permite que uma grande quantidade de controle sobre a oxigenação espacial em um único poço, permitindo a formação de várias condições, e até mesmo gerar um perfil cíclico de oxigênio através da superfície do poço.
  2. Cicatrização de feridas
    Monocamadas de células foram expostas a 10% ou 21% de oxigênio e da superfície da ferida foi analisada ao longo do tempo. Arranhões exposto ao oxigênio 21% fechada o mais lento e 10% mais rápido. A Figura 1 mostra imagens de um zero ao longo de 17 horas. Os gráficos na Figura 5 mostram o percentual de área da ferida aberta para ambas as concentrações de oxigênio para a duração do experimento.

Figura 1
Figura 1. Esquemática e diagramas ilustrando recursos do dispositivo. O dispositivo de inserção de oxigênio é fabricado por fotolitografia convencional (rede microfluídicos), moldagem réplica (rede microfluídicos e inserir scaffold), e definiu fiação de PDMS (gás-permeáveis ​​membrana). A) O dispositivo de oxigênio aninhados em uma placa de 6 poços. B) Os exemplos de 24 e 96-matrizes pilar. C) A esquemático transversal de um pilar. Oxigênio flui para o dispositivo através da entrada e viaja através de uma rede de microfluídica na parte inferior do pilar. Oxigênio pode livremente se difundem através da membrana PDMS gás-permeáveis ​​na parte inferior da coluna e se dissolvem em meio de cultura. D) A imagem do microscópio mostrando as várias características de um pilar de canal único de cima, com mensagens de vidro coladas para os estudos de equilíbrio.

Figura 2
Figura 2. Validação do dispositivo com sensores de oxigênio. Tensão de oxigênio dentro de cada poço foi caracterizada através de um sensor de oxigênio planar rutênio. Todas as misturas de oxigênio contendo nitrogênio equilibrada e 5% CO 2 para o buffer de mídia. A) Plot ilustrando o efeito da altura post, e distância de difusão de oxigênio, portanto, entre a membrana e células, no tempo de equilíbrio e eficácia. Alturas foram estabelecidas por pedaços de vidro de posts vinculado à parte inferior do dispositivo. Todos os três tamanhos pós rendimento vezes equilíbrio melhorou muito ao longo da câmara hipóxica. Note que o tempo está em uma escala log. B) Plot representando o rápido tempo de resposta de oxigênio equilíbrio do dispositivo gap 0,2 mm. C) A posição Multi-linescans também foram levados por todo o bem sob o microcanais para assegurar a homogeneidade da concentração de oxigênio introduzida pelo dispositivo. Gráfico mostra a concentração de oxigênio medido após a infusão de 0%, 10% e 21% de oxigênio por 10 min. D) Dispositivo efetivamente mantém 10% de oxigénio ao longo de 5 dias.

Figura 3
Figura 3. Experimentação com desenhos mais complexos de oxigênio de microcanais. A) instalação condição dupla de microcanais produz um 0% estável e perfil de oxigênio 21% mais de 14 dias. B) Um padrão interdigitados e sinuosa de 500 M microcanais largura se estende a toda ªresultados pilar e em um perfil de oxigênio cíclica. Observe que os dados só retrata um julgamento representante como o alinhamento de microcanais foi difícil.

Figura 4
Figura 4. Timelapse imagens de fechamento da ferida 0, 7 e 17 horas após o zero inicial. As células foram entregues 21% de oxigênio ao longo da duração do experimento.

Figura 5
Figura 5. Efeito da concentração de oxigênio na taxa de cicatrização de feridas em um ensaio de zero.

Discussion

O dispositivo é fabricado por fotolitografia SU-8 padrão, moldagem de réplica, e definiu fiação e feito inteiramente de polidimetilsiloxano. Gás é introduzido no dispositivo para estabelecer um gradiente de concentração entre o pilar de microcanais e os meios de cultura, conduzindo o sistema para uma concentração desejada de equilíbrio de oxigênio. O dispositivo tem sido demonstrado que efetivamente modulam a oxigenação temporal e espacial dentro de um poço, bem como modular o comportamento celular de forma adequada. O padrão espacial de oxigenação é definido pelos microcanais na base do pilar, assim que uma variedade de modelos pode ser implementado na elaboração da fotomáscara. Além disso, a infusão do gás desejado na fase gasosa do poço é esperado para melhorar o tempo de equilíbrio e extensão da hipóxia. Uma rede microfluídicos mistura poderia ser adaptado para o dispositivo para fornecer um meio para produzir misturas de gases a partir de apenas um romance tanques de gás poucas ações. Finalmente, um mecanismo para troca de mídia eliminaria a necessidade de remoção do dispositivo da placa com vários poços, dos quais as células podem responder.

O dispositivo tem aplicação em qualquer experimento in vitro ou ex vivo exigindo controle sobre a concentração de oxigênio. Como o oxigênio é uma importante variável fisiológica que afecta uma grande maioria das vias de sinalização, as áreas de pesquisa que se beneficiariam é limitada pela criatividade do pesquisador. Alguns campos que se beneficiaria do maior controle temporal da concentração de oxigênio incluem metástase de câncer, apnéia do sono e reperfusão cardíaca isquemia, entre muitos outros. Por exemplo, a hipóxia intermitente tem sido correlacionada com cânceres mais invasivos, upregulating uma série de metastastis genes associados em relação à hipóxia e normóxia contínua. Controle espacial também é importante, como gradientes de oxigênio são fundamentais para o desenvolvimento, zoneamento fígado, a toxicidade dos medicamentos, e os nichos de células-tronco. O dispositivo apresentado neste artigo beneficiará um número de áreas de pesquisa, fornecendo um sistema com um menor consumo de laboratório, relativamente simples requisitos operacionais e de controle muito maior sobre a exposição de oxigênio para as células.

Acknowledgments

Este projeto foi financiado pelo Departamento de Saúde Pública de Illinois eo National Science Foundation (DBI-0852416).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS-Sylgard 184 Dow Corning
Planar FOXY sensor Ocean Optics FOXY-SGS-M Coated microscope slide
Gas regulator Omega Engineering, Inc. FL-1472-G
Gas Airgas Custom mixes All have 5% CO2
SU-8 2150 MicroChem Corp.
MDCK Growth Medium w/ L-Glutamine SAFC Global M3803
Fetal Bovine Serum ATCC 30-2020
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T4049
L-Glutamine solution Sigma-Aldrich G7513

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