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संरचना lipídic Mesophases का उपयोग कर निर्धारण के लिए झिल्ली प्रोटीन crystallizing

Biology
 

Summary

इस के साथ साथ Caffrey झिल्ली स्ट्रक्चरल और कार्यात्मक जीवविज्ञान करने के लिए मैन्युअल रूप से lipídic mesophases में झिल्ली प्रोटीन के crystallization परीक्षण सेट समूह में कार्यान्वित की प्रक्रिया में वर्णित है.

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Caffrey, M., Porter, C. Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases. J. Vis. Exp. (45), e1712, doi:10.3791/1712 (2010).

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Abstract

Lipídic mesophases का उपयोग करके झिल्ली प्रोटीन crystallizing के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल में वर्णित है. इस विधि में विभिन्न lipídic घन चरण के रूप में या meso विधि में किया गया करने के लिए भेजा . विधि काफी बहुमुखी है कि यह prokaryotic और यूकेरियोटिक प्रोटीन की एक्स - रे crystallographic संरचनाओं, प्रोटीन है कि monomeric, होमोसेक्सुअल और hetero-multimeric, क्रोमोफोर युक्त और क्रोमोफोर मुक्त कर रहे हैं हल करने के लिए इस्तेमाल किया गया है दिखाया गया है, और अल्फा पेचदार और बीटा बैरल प्रोटीन. हाल ही में meso crystallization में उपयोग कर सफलताओं मानव इंजीनियर beta2 एड्रीनर्जिक और adenosine A2a जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स हैं. प्रोटोकॉल monoolein आधारित mesophase में झिल्ली प्रोटीन के पुनर्गठन के लिए, और मैनुअल मोड में crystallizations स्थापित करने के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं. ऐसे क्रिस्टल कटाई के रूप में, समग्र प्रक्रिया में अतिरिक्त कदम है, भविष्य वीडियो लेख में संबोधित किया जाना हैं. समय mesophase प्रोटीन - लोड तैयार है और एक crystallization की थाली करने के लिए सेट करने के लिए आवश्यक मैन्युअल रूप से के बारे में एक घंटे है.

Protocol

संरचनात्मक और कार्यात्मक जीव विज्ञान के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण ध्यान केंद्रित जैविक झिल्ली (चित्रा 1). झिल्ली, जो सेल और उप सेलुलर जब वर्तमान organelles के चारों ओर एक molecularly पतली संरचना सिर्फ दो लिपिड अणु भर में है और प्रोटीन के साथ जड़ी. संरचना और समारोह के रूप में दोनों लिपिड और प्रोटीन के लिए लागू ब्याज की हैं. हालांकि, इस लेख के ध्यान केंद्रित झिल्ली प्रोटीन के लिए प्रतिबंधित है.

दो कारणों के लिए कैसे झिल्ली प्रोटीन एक आण्विक स्तर पर समारोह के एक बेहतर समझ की मांग की है. सबसे पहले, वहाँ जानते हुए भी कि वे कैसे काम करते हैं में बौद्धिक संतुष्टि है. दूसरे, जानते हुए भी कैसे काम करता है एक प्रोटीन के द्वारा, वहाँ हमेशा ठीक यह खराबी चाहिए या में सुधार की या यहाँ तक कि यह विशेष अनुप्रयोगों के लिए संशोधित करने में सक्षम होने की संभावना है. ड्रग डिजाइन काम के इस प्रकार का एक स्पष्ट परिणाम है. एक लगाना कैसे एक झिल्ली प्रोटीन एक आण्विक स्तर पर काम करता है दृष्टिकोण इसकी संरचना निर्धारित करने के लिए है. यह सभी परमाणुओं के 3 आयामी अंतरिक्ष में स्थान, या कम से कम सभी गैर - हाइड्रोजन परमाणुओं, कि प्रोटीन बनाने की स्थापना शामिल है. हम इस उद्देश्य के लिए उपयोग विधि macromolecular क्रि एक्स - रे (एमएक्स) है. चित्रा 2 एक झिल्ली प्रोटीन संरचना जिसका था एमएक्स का उपयोग करके निर्धारित की एक उदाहरण दिखाता है. प्रोटीन का एक विवर्तन गुणवत्ता क्रिस्टल एमएक्स करने के लिए आवश्यक है.

जाहिर है, वहाँ कई कदम संरचना macromolecular क्रि का उपयोग कर निर्धारण में शामिल हैं. यह 3 चित्र में सचित्र है. आमतौर पर, इन एक झिल्ली प्रोटीन लक्ष्य की पहचान शामिल है, और फिर उत्पादन, शुद्ध और यह crystallizing. विवर्तन माप क्रिस्टल का उपयोग कर एक घर या एक सिंक्रोटॉन एक्स - रे स्रोत पर प्रदर्शन कर रहे हैं. विवर्तन डेटा है कि तब एक आणविक मॉडल के साथ फिट है एक इलेक्ट्रॉन घनत्व नक्शे उपज संसाधित कर रहे हैं. मॉडल, जब परिष्कृत, प्रोटीन की कार्रवाई के तंत्र का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और संरचना के आधार पर दवा डिजाइन के लिए.

इस लेख के ध्यान केंद्रित करने के लिए दिखाने के लिए हम कैसे meso विधि में तथाकथित विवर्तन lipídic mesophases का उपयोग झिल्ली प्रोटीन की गुणवत्ता क्रिस्टल द्वारा, का उत्पादन है. विधि और इसके दायरे के हाल के एक समीक्षा के संदर्भ 1 (Caffrey, 2009) में उपलब्ध है. प्रोटोकॉल कदम दर कदम हम यहाँ का पालन करेंगे संदर्भ 2 (Caffrey और Cherezov, 2009) में वर्णित है.

एक प्रवाह संचित्र और meso झिल्ली प्रोटीन crystallization परीक्षण में एक की स्थापना के लिए आवश्यक समय में शामिल कदम सारांश चित्रा 4 में दिखाया गया है. यह आलेख उन डैश्ड लाल लाइनों द्वारा संलग्न कदम शामिल हैं.

भाग 1: Crystallization प्लेट्स तैयारी

  1. काम बेंच पर एक silanized खुर्दबीन स्लाइड स्थिति.
  2. सुरक्षात्मक कागज कवर छेदा डबल छड़ी स्पेसर टेप की एक स्ट्रिप (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है, विशिष्ट अभिकर्मकों और नीचे उपकरण की तालिका देखें) की एक सतह से निकालें.
  3. टेप, चिपचिपा ओर नीचे स्लाइड की सतह के साथ संपर्क में रखें.
  4. दबाव सील एक brayer या रोलर का उपयोग कर स्लाइड के लिए टेप. एल्यूमिनियम पर्ण टेप और कुओं के आधार की रक्षा के लिए रोलर के बीच रखा जा सकता है.
  5. निकालें टेप से दूसरे अखबार को कवर करने के लिए अपने ऊपरी चिपचिपा सतह बेनकाब.
  6. प्लेस कुओं की तेज और कुशल सील के लिए के रूप में लोड हो रहा है के रूप में जल्द ही थाली के लिए करीब निकटता में व्यक्तिगत silanized coverslips पूरा हो गया है.

भाग 2: तैयारी लिपिड सिरिंज

  1. तापमान नियंत्रित एक ब्लॉक में 45 पर लिपिड (अक्सर monoolein) ° 3 मिनट के लिए सी यह पिघला हुआ रेंडर करने के लिए रखें.
  2. जबकि लिपिड पिघल रही है लिपिड प्रोटीन मिश्रण कदम में उपयोग करने के लिए दो 100 μL गैस तंग हैमिल्टन सीरिंज को तैयार है. कि प्रोटीन के समाधान में शामिल होंगे सिरिंज से Teflon सामी निकालें. सिरिंज कि ​​लिपिड यह अगले पकड़ जगह में अपने सामी छोड़ने रखें.
  3. युग्मक लिपिड सिरिंज (विशिष्ट अभिकर्मकों और उपकरण नीचे और संदर्भ 3 (चेंग एट अल की तालिका देखें. 1998)) कनेक्ट. सिरिंज के लिए युग्मक फिंगर कस लेकिन नहीं कस अधिक. लिपिड सिरिंज के बैरल से सवार निकालें.
  4. ध्यान दें कि आगे बढ़ने से पहले लिपिड पिघला हुआ होना चाहिए. 30 μL विंदुक सेट और धीरे से ऊपर पिघला हुआ लिपिड का लगभग 30 μL ले. धीरे धीरे के रूप में पिघला हुआ लिपिड की बहुत ख्याल रख रही हवा अंतराल परिचय नहीं सिरिंज के खुले अंत में के रूप में आप यह कर सकते उद्धार.
  5. बैरल में पिघला हुआ लिपिड के साथ संपर्क में सवार प्लेस और धीरे धीरे प्रति बैरल के ऊपर खड़ी रूप में वीडियो में प्रदर्शन आयोजित सिरिंज के साथ सवार अग्रिम. एयर बुलबुले है कि अनजाने में फंस हो सकता है इस प्रक्रिया में वृद्धि और जारी किया जाएगा चाहिए.
  6. ध्यान सिरिंज प्रति बैरल पर चिह्नों को पढ़ने के द्वारा सिरिंज में लिपिड की मात्रा का निर्धारण.
  7. Ferr स्लाइडयुग्मक से विस्तार सुई पर ule. सवार प्रति बैरल के ऊपर और धीरे धीरे और धीरे युग्मक के कोर पर सुई में पिघला हुआ लिपिड बल का प्रयोग करें.

भाग 3: तैयारी प्रोटीन सिरिंज

  1. प्रोटीन समाधान 14,000 जी पर 5 से 10 मिनट के लिए काता होना चाहिए 4 बजे ° सी crystallization परीक्षण की स्थापना से पहले बड़े समुच्चय को दूर करने के लिए. बर्फ से प्रोटीन समाधान निकालें और यह कमरे के तापमान पर संतुलित करने के लिए अनुमति देते हैं.
  2. प्रोटीन समाधान की मात्रा की गणना करने के लिए पर घन चरण के रूप में या पूर्ण जलयोजन के लिए बंद का उपयोग. Monoolein के लिए 20 डिग्री सेल्सियस, पानी के साथ पूर्ण जलयोजन चरण आरेख 5 (चित्रा 5) के रूप में करीब 40% पानी (मास) के द्वारा होता है.
  3. एक 25 या 50 μL हैमिल्टन सिरिंज के साथ प्रोटीन समाधान के लिए जरूरी मात्रा ले. प्रोटीन देखभाल लेने के लिए हवाई बुलबुले से बचने के सिरिंज के बैरल में सवार Teflon टिप पर समाधान स्थानांतरण.
  4. ध्यान सुई वापस लेने और सिरिंज में प्रोटीन समाधान की मात्रा को मापने. यह पिछले चरण में दिया गया मान से मेल खाना चाहिए.
  5. धीरे धीरे प्रति बैरल के ऊपर प्रोटीन के समाधान के लिए अपने खुले अंत के साथ फ्लश अंत इंच.
  6. लिपिड सिरिंज से जुड़ी युग्मक के खुले अंत में प्रोटीन सिरिंज भाड़ में. यह महत्वपूर्ण है कि युक्ति कड़ा नहीं हो जरूरत से ज्यादा है. अधिक इस स्तर पर इकट्ठे मिश्रण डिवाइस कस ferrules नुकसान और लीक कारण होगा. के तहत कस भी लीक करने के लिए नेतृत्व करेंगे.

भाग 4: मिश्रण प्रोटीन समाधान और लिपिड: Mesophase बनाना

  1. मिश्रण प्रभाव, अपनी सीमा के लिए इकट्ठे मिश्रण इकाई के प्रोटीन की ओर पर सवार अग्रिम, अंगूठे या तर्जनी प्रोटीन समाधान प्रोटीन सिरिंज से बाहर ड्राइविंग के साथ युग्मक के माध्यम से और लिपिड सिरिंज में.
  2. लिपिड पक्ष पर सवार अब लिपिड सिरिंज की सामग्री युग्मक के माध्यम से और प्रोटीन सिरिंज में वापस ड्राइव करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
  3. प्रक्रिया को कई बार दोहराया है, कभी कभी, एक सौ या अधिक मार्ग के लिए एक समरूप mesophase उत्पादन के लिए आवश्यक हैं. मिश्रण, युग्मक के माध्यम से आगे और पीछे सामग्री का आंदोलन असमान हो सकता है और समय पर कर सकते हैं, शुरू में, अतिरिक्त बल मिश्रण प्रभाव की जरूरत है. प्रारंभिक मिश्रण आमतौर पर नमूना में एक गैर वर्दी cloudiness के विकास के साथ है. Homogenization में प्रगति, बनावट और अधिक वर्दी और चिपचिपा घन चरण की विशेषता बन जाता है, के रूप में उभरते घन mesophase के दृश्य उपस्थिति करता है.
  4. यदि स्थिति उचित और घन चरण रूपों हैं, फैलाव ऑप्टिकली पारदर्शी सिरिंज बैरल में दिखाई देनी चाहिए. इस प्रकार, सिरिंज प्रति बैरल पर चिह्नों बैरल में mesophase के माध्यम से स्पष्ट रूप से सुपाठ्य होना चाहिए.
  5. मिश्रण के दौरान बहुत मामूली नमूना के एक कम समय के लिए बर्फ पर सिरिंज मिक्सर रखकर ठंडा homogenization और पारदर्शिता की उपलब्धि को तेज कर सकते हैं. हालांकि, यह महत्वपूर्ण है के लिए नमूना नहीं overcool.
  6. बहुत जोरदार से बचने के मिश्रण, से लिया जाना चाहिए के रूप में इस नमूना तापमान घर्षण 3 हीटिंग की वजह से वृद्धि करने के लिए पैदा कर सकता है .

भाग 5: औषधि लोड हो रहा है

  1. सवार और एक 10 μL हैमिल्टन सिरिंज से सुई निकालें. जगह में Teflon सामी छोड़ो.
  2. एक छोटे सिक्के के सहायता से निकालने की मशीन से बनाए रखना है अखरोट निकालें.
  3. शाफ़्ट हाथ पूरी तरह से वापस ले लिया, सिरिंज सम्मिलित - अपने सवार और सुई के बिना - मशीन की अंगूठी धारण के माध्यम से.
  4. बनाए रखना है अखरोट, गैसकेट सिरिंज का सामना करना पड़ की ओर बदलें, और यह पेंच में सिरिंज के खुले अंत पर कसकर.
    देखभाल करने के लिए सुनिश्चित करें सिरिंज ठीक से पकड़े अंगूठी में केंद्रित है और बैरल समानांतर शाफ़्ट हाथ करने के लिए गठबंधन किया है कि लिया जाना चाहिए. दोनों आंखों से आंका जा सकता है है. इन दो आवश्यकताओं के रिसाव से बचने के लिए महत्वपूर्ण हैं.
  5. मनोरंजक अंगूठी के माध्यम से सवार दर्रा के साथ ग्रिपर अखरोट unscrewed कुछ बदल जाता है और सिरिंज के खुले अंत में सवार गाइड. शाफ़्ट हाथ पूरी तरह से दबाना. प्रति बैरल में सवार ले जाएँ और जाँच करें कि यह बैरल में स्वतंत्र रूप से और सच्चे यात्रा. यह गाइड पट्टी पर पेंच ढीला करने के लिए स्वतंत्र रूप से चलती सवार की सुविधा के लिए मदद मिल सकती है. सुनिश्चित करें कि यह है. दबाना सवार जब तक उसके Teflon टिप बैरल पर शून्य μL स्नातक स्तर की पढ़ाई के निशान के साथ aligns. यदि पुस्तिका पट्टी पर पेंच ढीला था, यह retighten और पुनः जाँच करें कि गोताख़ोर आज़ादी चाल.
  6. इकट्ठे मिश्रण इकाई के एक तरफ शून्य μL स्नातक निशान सवार अन्य सिरिंज और युग्मक mesophase हस्तांतरण हटो.
  7. मिश्रण इकाई से खाली सिरिंज (जगह में अपनी सामी के साथ) डिस्कनेक्ट और तुरंत लोड सिरिंज कनेक्ट - युग्मक एक के साथ10 μL वितरण सिरिंज के लड़ी पिरोया समाप्ति - ttached. जकड़न की डिग्री है जिसके साथ युग्मन किया जाता है महत्वपूर्ण है, जैसा कि पहले ही उल्लेख किया है.
  8. 100 μL सिरिंज के निराशाजनक सवार इतना है कि वितरण सिरिंज लोड युग्मक के माध्यम से mesophase स्थानान्तरण.
  9. वितरण सिरिंज के इस्पात समाप्ति के लिए एक छोटी, फ्लैट इत्तला दे दी सुई को सुरक्षित और ध्यान से यह जगह में कस.
  10. शाफ़्ट हाथ मनोरंजक अंगूठी में अखरोट कस द्वारा सवार दबाना. देखभाल नहीं अखरोट से अधिक कस के रूप में इस स्कोर और यह बेकार प्रतिपादन सवार ख़राब कर सकते हैं लिया जाना चाहिए. यह महत्वपूर्ण है कि यात्रा clamped हालत में शाफ़्ट हाथ प्रदान की रेंज एक इंच है, के रूप में वीडियो में प्रदर्शन की तुलना में अधिक नहीं करने के लिए सीमित हो. इस के अलावा, सवार एक बकसुआ और वितरण विफल कर सकते हैं की प्रवृत्ति होगा.
  11. शाफ़्ट ड्रम कई बार दबाना बैरल में सवार अग्रिम, जिससे सुई के शून्य मात्रा को भरने और सुई लोड हो रहा है. इस कदम जब तक mesophase की एक सतत स्ट्रिंग सुई की नोक से उभर (दस गुना) दोहराया जाना चाहिए.
  12. Crystallization परीक्षण तुरंत शुरू, के रूप में कुछ प्रोटीन जोडी तेज़ बिना घन चरण में अस्थिर कर रहे हैं चाहिए.

भाग 6: Crystallization प्लेट्स की स्थापना

  1. प्लेस बहु अच्छी तरह से एक crystallization और सतह पर एक थाली coverslip लोडिंग के आराम के लिए काम बेंच के ऊपर कुछ इंच उठाया. इष्टतम विपरीत और बढ़ाया दृश्यता प्राप्त कर रहे हैं जब सतह थोड़ा अंधेरा है.
  2. तेज़ समाधान homogenize और शीशियों खुलना. तेज़ वितरण 1 μL के लिए pipet सेट.
  3. वितरण सिरिंज खड़ी एक हाथ में आयोजित के साथ मुक्त हाथ का उपयोग करने के लिए केंद्र में और सीधे ऊपर अच्छी तरह से एक नंबर के आधार सुई टिप स्थिति. दोहरा निकालने की मशीन पर बटन प्रेस करने के लिए सतह पर कांच mesophase की एक सांस में निष्कासित के लिए. सांस की मात्रा 200 nl है जब मानक दोहरा दवासाज़ 10 μL सिरिंज के साथ प्रयोग किया जाता है. सुई की नोक अच्छी तरह के आधार के ऊपर एक सौ कुछ micrometers से अधिक नहीं होना करने के लिए उचित वितरण सुनिश्चित करना चाहिए.
  4. बाद 4 आसन्न कुओं mesophase, जगह प्रत्येक mesophase एक 2-μL pipet और मानक प्रयोज्य सुझावों का उपयोग सांस के शीर्ष पर तेज़ समाधान की एक μL के साथ लोड कर रहे हैं.
  5. जल्दी के रूप में संभव के रूप में, एक coverslip squarely भरा कुओं पर उन्हें समान रूप से कवर की जगह. एक पानी तंग सील प्रभाव के लिए, एक रंग का उपयोग coverslip जहां यह उजागर स्पेसर टेप की चिपचिपा सतह के साथ संपर्क बनाता है के लिए दबाव लागू.
  6. जब तक थाली पर सभी कुओं लोड कर रहे हैं और सील mesophase और तेज़ वितरण प्रक्रिया दोहराया जा सकता है.
  7. ट्रैकिंग के प्रयोजनों के लिए थाली स्पष्ट रूप से लेबल. प्रकाश के प्रति संवेदनशील प्रोटीन आमतौर पर एल्यूमीनियम पन्नी में उन्हें ऊष्मायन कक्ष में रखने से पहले प्लेटें लपेटन द्वारा नियंत्रित किया जाता है.
  8. तापमान नियंत्रित एक कक्ष में प्लेटें प्लेस, 20 आमतौर पर डिग्री सेल्सियस
  9. एक नियमित समय पर, एक 10 या 20 गुना उद्देश्य के साथ एक polarized प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग क्रिस्टल विकास के लिए कुओं का निरीक्षण किया. अनुसूची के रूप में लेखक की प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया प्रकार है: 0 दिन, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30 और 60 के बाद सेटअप. ध्यान mesophase सांस 0.14 मिमी मोटी नमूना के भीतर ध्यान की गहराई समायोजन का निरीक्षण किया. परीक्षा दोनों सामान्य प्रकाश में और पार polarizers के बीच किया जाना चाहिए.

भाग 7: प्रतिनिधि परिणाम

परिणामस्वरूप क्रिस्टल की उपस्थिति झिल्ली प्रोटीन की निहित रंग के साथ अलग अलग होंगे, प्रकाश का ध्रुवीकरण (या अभाव क्या है) और निरीक्षण विधि और रोशनी की गुणवत्ता के लिए इस्तेमाल किया. चित्रा 6 कई संभव क्रिस्टल दिखावे से पता चलता है. स्वाभाविक रूप से रंगीन झिल्ली meso में बढ़ रहा है जब प्रकाश के साथ सामान्य देखा प्रोटीन चित्रा 6 पैनलों (ख और घ) में दिखाया गया है उन लोगों की तरह देख सकते हैं. बेरंग झिल्ली प्रोटीन घन चरण में बढ़ती जब सामान्य प्रकाश के साथ देखा क्रिस्टल चित्रा 6 (पैनल ई) में दिखाया गया है उन लोगों की तरह देख सकते हैं. अंत में, बेरंग झिल्ली प्रोटीन meso में बढ़ती जब polarized प्रकाश के साथ देखा क्रिस्टल चित्रा 6 (पैनलों एक और ग) की तरह देख सकते हैं.

फसल और क्रायो शांत क्रिस्टल संरचना निर्धारण की समग्र प्रक्रिया में अगले कदम हैं और रिकॉर्ड और उन लोगों से एक्स - रे विवर्तन का विश्लेषण. इन विषयों के लिए अलग जौव लेख में कवर किया जाता है.

चित्रा 1
चित्रा 1 में और जिस पर एक जैविक लिपिड bilayer दिखा झिल्ली के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व प्रोटीन की एक किस्म में स्थित हैं .

चित्रा 2
चित्रा 2 संरचना.विटामिन बी 12 परिवहन प्रोटीन BtuB, एमएक्स और meso 6 विधि इस जौव लेख में सचित्र में हो क्रिस्टल का उपयोग कर हल.

चित्रा 3
चित्रा 3. संरचना समारोह चक्र प्राप्त करने और एक प्रोटीन के बारे में पूरा संरचनात्मक जानकारी का उपयोग करने में शामिल कदम के कई दिखाता है.

चित्रा 4
चित्रा 4]. प्रवाह संचित्र meso विधि में झिल्ली प्रोटीन क्रिस्टल की उत्पादन में शामिल कदम को सारांशित. केवल उन डैश्ड लाल रेखा से घिरा हुआ कदम इस जौव लेख में कवर कर रहे हैं. 2 संदर्भ से.

चित्रा 5
5 चित्रा एक सरलीकृत तापमान रचना लिपिड (monoolein) / पानी की व्यवस्था के लिए चरण आरेख . Crystallization परीक्षण 20 पर सेट कर रहे हैं डिग्री सेल्सियस जहां लिपिड 40% जलयोजन पर पानी के साथ saturates. विस्तृत चरण आरेख 5 संदर्भ में उपलब्ध है.

चित्रा 6
चित्रा 6 lipídic mesophase में बढ़ती झिल्ली प्रोटीन के कण.
(क) विटामिन बी 12 परिवहन प्रोटीन, 6 BtuB, (ख) 7 द्वितीय जटिल प्रकाश कटाई, (ग) / adhesin invasin 8 OpcA, (घ) bacteriorhodopsin 9, स्यूडोमोनास से (ङ) एक कार्बोहाइड्रेट ट्रांसपोर्टर. छवियाँ सामान्य प्रकाश (बी, डी, ई) के साथ और पार कर polarizers (क, ग) के बीच दर्ज की गई.

Discussion

घन चरण एक नाजुक और गतिशील वातावरण है कि काफी चर के एक नंबर के परिवर्तन के साथ बदल सकते हैं. यह मैनुअल मोड में है कि सभी संभावित नुकसान का वर्णन meso crystallization परीक्षण में की स्थापना की एक विवरण देना संभव नहीं है. हालांकि, कई कठिनाइयों तकनीक अभ्यास के द्वारा यह महंगा प्रोटीन समाधान के लिए आवेदन करने से पहले और मिश्रण के दौरान सीरिंज के लिए लागू दबाव में मॉडरेशन का उपयोग करके बचा जा सकता है. सही ढंग से हो गया, meso विधि में प्रोटीन की एक विस्तृत विविधता के क्रिस्टल उपज कर सकते हैं, जो की संख्या लगातार बढ़ती जा रही है.

meso crystallization परीक्षण में की स्थापना के यहाँ दिए गए विवरण मैनुअल मोड पर ध्यान केंद्रित है . प्रक्रिया है, और अक्सर उन मामलों है कि बड़े पैमाने पर crystallization शर्तों की स्क्रीनिंग की आवश्यकता में crystallization प्लेटों के स्वचालित सेटअप की सुविधा के लिए संशोधित किया गया है.

Acknowledgments

वहाँ कई जो इस काम के लिए योगदान कर रहे हैं और सबसे Caffrey स्ट्रक्चरल और कार्यात्मक जीवविज्ञान समूह झिल्ली, दोनों अतीत और वर्तमान सदस्यों से कर रहे हैं. हम सभी के लिए हमारी हार्दिक धन्यवाद और प्रशंसा का विस्तार. इस काम के हिस्से में से विज्ञान फाउंडेशन आयरलैंड (07/IN.1/B1836), स्वास्थ्य (GM75915) के राष्ट्रीय संस्थानों, और लुम्नीच विश्वविद्यालय अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Protein solution Reagent Various Various
Lipid (monoolein) Reagent Sigma-Aldrich Various
Precipitant solutions Reagent Various Various
Purified water Reagent EMD Millipore
Pipetting devices Tool Pipetman Various
Disposable pipet tips Disposable Pipetman Various
Gas-tight syringes Tool Hamilton Co 80265 (25-µl)
Syringe tips Tool Hamilton Co 7770-020 (gauge 22)
Narrow bore coupler* Tool Hamilton Co various/EBS-LCP-2
Repeating dispenser Tool Hamilton Co 83700
Silanized glass microscope slides Disposable Gold Seal 3010
microscope coverslips Disposable Fisher Scientific 12-548C
Perforated double-stick spacer tape Disposable Saunders Corporation (hole-punched) NA
Tweezers Tool Various NA
Brayer (roller) Tool Fisher Scientific 50820937
Chipped ice Temperature Control N/A NA
Tissues Disposable N/A NA
Calculator Tool Various NA
Lab notebook Tool Various NA

* Full details for machining your own Narrow Bore Coupler are provided in Reference 3.

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References

  1. Caffrey, M. Crystallizing membrane proteins for structure determination. Use of lipidic mesophases. Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).
  2. Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallising membrane proteins in lipidic mesophases. Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).
  3. Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).
  4. Cherezov, V., Caffrey, M. Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins. J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).
  5. Qiu, H., Caffrey, M. The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects. Biomaterials. 21, 223-234 (2000).
  6. Cherezov, V. In meso structure of the cobalamin transporter, BtuB, at 1.95 A resolution. J. Mol. Biol. 364, 716-734 (2006).
  7. Cherezov, V., Clogston, J., Papiz, M. Z., Caffrey, M. Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases. J. Mol. Biol. 357, 1605-1618 (2006).
  8. Cherezov, V. In meso crystal structure and docking simulations suggest an alternative proteoglycan binding site in the OpcA outer membrane adhesin. Proteins. 71, 24-34 (2008).
  9. Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 1795-1807 (2004).

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