든 샘플 준비 : 울트라 씬 레이어 방법

Biology

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Summary

이 비디오는 매트릭스를 이용한 레이저 탈착 이온화 질량 분석법 (든 - MS)에 의해 펩티드와 단백질 분석을위한 울트라 얇은 매트릭스 / analyte 레이어의 준비를 보여줍니다.

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Fenyo, D., Wang, Q., DeGrasse, J. A., Padovan, J. C., Cadene, M., Chait, B. T. MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method. J. Vis. Exp. (3), e192, doi:10.3791/192 (2007).

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Abstract

이 비디오는 매트릭스를 이용한 레이저 탈착 이온화 질량 분석법 (든 - MS) 1, 2에 의해 펩티드와 단백질 분석을위한 울트라 얇은 매트릭스 / analyte 레이어의 준비를 보여줍니다. 울트라 씬 레이어 방법은 매트릭스 / analyte 혼합물의 후속 결정을위한 시딩 접지 역할을 샘플 접시에 매트릭스 결정의 기판 레이어의 생산 (알파 - cyano - 4 - hydroxycinnamic 산성)을 포함합니다. 다른 샘플 증착 방식 (예 : 말린 소적)을 통해 울트라 얇은 레이어 방식의 장점은 (I)과 같은 소금 및 세제, (2) 더 나은 해상도, 그리고 (iii) 이상의 공간적 균일 같은 불순물에 큰 관용을 제공하고 있습니다. 이 방법은 단백질의 정확한 질량 결정에 특히 유용합니다. 프로토콜은 초기 개발하고 막 단백질의 분석에 최적화된 성공적으로 이온 채널, 신진 대사 전송기 및 수용체를 분석하는 데 사용, 2, 12 transmembrane 도메인 2 사이 포함되었습니다. 원래 출판 이후, 그것은 또한 가용성 단백질의 분석을 위해 동등하게 유용하게 표시하고 있습니다. 사실, 우리는 380 KDA 3만큼 높은 분자 민중 포함 속성의 넓은 범위를 가지고 단백질의 다수를 위해 사용 해왔다. 그것은 현재 모든 단백질의 분자 질량 분석을 위해 선택의 방법입니다. 설명 절차는 지속적으로 고품질의 스펙트럼을 생산하고, 그것은 민감한 강력하고 쉽게 구현할 수 있습니다.

Protocol

그것은 얇은 레이어의 준비 기간 동안 가루없는 장갑을 착용하는 것은 매우 중요합니다.

샘플 판의 청소

  1. 스테인리스 스틸 또는 금색 든 샘플 판을 사용하십시오.
  2. MeOH로 세척하고 Kimwipe로 부드럽게 닦으십시오. 표면 긁힘 방지하기 위해, Kimwipe로 표면을 문질러거나 문지르지 마십시오.
  3. H 2 O로 씻고 Kimwipe로 부드럽게 닦으십시오.
  4. MeOH로 세척하고 Kimwipe로 부드럽게 닦으십시오.
  5. 필요한 경우, 항상 MeOH로 끝나는, MeOH / H 2 O / MeOH 청소주기를 반복합니다.
  6. 접시에 남은 귀신 명소이나 잔여물이 없는지 확인합니다. 귀신 장소가있다면 귀하의 장갑 낀 손으로 (Kimwipes와 함께 비벼하지 마십시오)와 표면을 마찰하면서, 탈이온수와 접시를 씻어. MeOH / H 2 O / MeOH 청소주기를 반복합니다.
  7. 즉시 세척 후 접시를 사용합니다.

얇은 레이어 기판 솔루션의 준비

  1. 포화 4 - HCCA (2 부품 ACN, 1 일부 물, 0.1 % 최종 TFA) 3 부품 이소프로판올 1 부분을 섞는다.

    참고 : 얇은 레이어 기판 솔루션은 매우 안정이며, 년간 어둠 속에 상온에서 보관하실 수 있습니다. 또한 4 저장될 수 있습니다 ° C.

얇은 레이어 기판 만들기

  1. 접시의 왼쪽 중심과 피펫 팁의 측면과 확산에 얇은 레이어 기판 솔루션의 20 50μL을 적용합니다. 한 방향으로 지나간다.
  2. 솔루션 마르면 매우 빠르게 유기 용매 증발이 접시의 표면에 물이 방울 분 뒤에 출발로. 이 시점에서, Kimwipe의 플라이와 처음 부드럽게와 접시의 표면을 얼룩으로 집게 손가락을 포장.
  3. 표면이 물방울에서 해방되면 Kimwipe를 사용하여 단일 방향 전면 대응으로 전체 접시를 닦으십시오.

    참고 :이 솔루션은 강판의 표면에 걸쳐 충분히 확산하지 않는 경우, ACN 구성을 향상시키고 얇은 레이어를 재현. 솔루션의 확산에 영향을 미칠 수있는 몇 가지 매개 변수가 주변 습도 및 온도를 포함합니다.

    참고 : 골드 플레이트, 레이어는 일반적으로 보는 가벼운 각도에 따라 노란 반영으로 나타납니다. 강판으로 레이어만을 가장자리가 정상적으로 표시됩니다.

  4. 악기를 오염으로부터 행렬을 방지하기 위해 접시 홀더에 넣어 전에 신선한 Kimwipe으로 접시의 가장자리를 청소합니다.

매트릭스 솔루션의 준비

  1. 4 HCCA 포화 FWI에서 (개미의 산 세 부분, 1 일부 물, 2 부품 이소프로판올) 막과 가용성 단백질을 모두 분석을 권장합니다. 매우 소수성 큰 펩티드 (M> 4000 U)의 분석을 위해 특별한 경우에도 사용할 수 있습니다. 완전히 방식의 장점을 물리 치고, 얇은 레이어 기판을 분해하므로 단백질을 찾을 때 사용되는 매트릭스 솔루션 ~ 50% 유기 콘텐츠를 초과하지 않는지 확인하십시오.

얇은 레이어 기판의 시험

  1. 접시에 매트릭스 솔루션의 스팟 0.5μL. 약간 흰 침전물은 얇은 레이어와 비말 사이의 인터페이스에 나타납니다. 이 계층은 완전히 비말의 바닥을 커버하는 경우, 보통 10~15초 내에 진공 라인과 초과 액체를 대기음. 그것이 형태로 침전, 30 초 이상 걸린다면, 그것은 얇은 레이어 기판 및 / 또는 매트릭스 솔루션에 문제가있을 수도 표시됩니다.

샘플 응용 프로그램

  1. 시작 솔루션에 analyte 농도는 10 1000μM 이내에해야합니다.
  2. 0.2과 2μM 사이에 최종 analyte 농도에 매트릭스 솔루션에 analyte 솔루션을 희석. 예를 들어, 샘플 및 매트릭스 솔루션의 9​​μl의 1μl로 시작합니다.

    참고 : 매트릭스가 최종 솔루션에 포화되는 가까운 거리에 있는지 확인하십시오, 그렇지 않으면 당신은 얇은 레이어 기판 redissolve 것입니다.

    참고 : 품위있는 신호를 얻기 위해 필요한 Analyte의 농도는 솔루션의 복잡 및 구성 (예 : 오염 물질) 및 analyte의 ionizability에 크게 의존하고 있습니다.

    참고 : 단일 단계 희석 좋은 결과를 얻을 수 없다면, 당신이 다른 희석 단계를 시도해야합니다. 카운터 - 직관적이지만, 고농도 analyte 솔루션은 거의 좋은 스펙트럼을 생산하지 않습니다.

    참고 : 막 단백질은 일반적으로 큰 dilutions을 필요로합니다.

  3. 접시 샘플 / 매트릭스 혼합물 스팟 0.5μl. 약간 흰 침전물은 얇은 레이어와 비말 사이의 인터페이스에서 양식됩니다. 이 침전물은 매트릭스와 analyte의 cocrystallization입니다. 이 계층은 완전히 비말의 바닥을 커버, 우스10~15초 이내 앨리, 진공 라인과 초과 액체를 대기음. 그것이 형태로 침전, 30 초 이상 걸린다면, 그것은 결정을 방지하거나 analyte 너무 집중되는 오염 물질 현재의 표시 수 있습니다.

Calibrant 응용 프로그램

  1. 0.1 - 0.5μM 사이에 최종 calibrant 농도와 유사한 방식으로 calibrant / 매트릭스 혼합물을 준비합니다.
  2. 샘플 명소와 근접 거리에 접시에 자리 0.5μl의 calibrant / 매트릭스 혼합물. 이것은 물리적 근접는 접시가 스펙트럼에 calibrants 몇 레이저 주사를 추가하는 샘플 수집 동안 calibrant 자리에 샘플 장소에서 이동되는 의사 내부 교정 절차에 사용됩니다. 이 방법은 외부 교정에만보다 높은 질량 정확도 교정을 보장합니다.

단계 워싱

  1. 얼음 차가운 0.1 % TFA 수성 솔루션의 약 2μL 각 자리를 씻으십시오. 진공 라인 초과 액체를 대기음.

질량 스펙트럼의 취득

  1. 이제 대량 스펙트럼를 얻기위한 준비가되어 있습니다. 당신이 FWI 매트릭스 솔루션을 사용하는 경우 같은 formylation로 analyte에 돌이킬 수없는 수정을 방지하기 위해 가능한 빨리, 당신은 스펙트럼을 획득해야합니다.

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References

  1. Xiang, F., Beavis, R. C. A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).
  2. Cadene, M., Chait, B. T. A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins. Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).
  3. Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains. J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).

Comments

4 Comments

  1. WHAT ADVANTAGES AND DISADVANTAGES DO MALDI HAVE OVER ELECTRON SPRAY IONIZATION METHOD IN TERMS OF PRECISION,ACCURACY , INSTRUMENTATION AND POSSIBLE INTERFERENCES  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 15, 2008 - 1:34 AM
  2. MALDI, especially with the ultra thin layer method described here, can be use to reliably measure the molecular masses of small quantities of proteins (or protein fragments), even if they are relatively insoluble. For example, the described method allows for the mass spectrometric analysis of intact membrane proteins that are only soluble in the presence of detergents and/or membrane lipids. We have found the procedure to be highly robust for proteins ranging in molecular mass up to as high as 380 kDa. When using electrospray ionization, such measurements can often be quite challenging, especially when only small amounts of protein (sub-picomole) are available and extensive optimization of conditions is not feasible. Mass accuracy in the 100 ppm range is possible in cases where the protein of interest is highly homogenous (see reference ² above).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 23, 2009 - 5:38 PM
  3. Congratulations for this excellent method. I have a doubt about the formic acid concentration. Reference ² describ formic acid reagent at 88% and I think that it was dilute to 1%. Am I right?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 12, 2010 - 3:38 PM
  4. The reagent is indeed Formic Acid, 88% (Certified ACS), Fisher Chemical, as stated in reference ². I think, strictly speaking, the specification that Fisher gives is >=88%.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 12, 2010 - 3:51 PM

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