Homogene snelle detectie van biologische testen met behulp van Magnetic Modulation biosensing System

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Magnetische modulatie biosensing systeem wordt gebruikt om snel, gevoelig en eenvoudig te detecteren biologische assays, zoals DNA-moleculen en eiwitten.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Danielli, A., Porat, N., Ehrlich, M., Arie, A. Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System. J. Vis. Exp. (40), e1935, doi:10.3791/1935 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Een magnetische modulatie biosensing systeem (MMB) [1,2] snel en homogeen zijn ontdekt biologische doelwitten bij lage concentraties, zonder wassen of scheiding stap. Wanneer de IL-8 doelwit aanwezig was, een 'sandwich'-gebaseerde test bevestigd magnetische korrels met IL-8-capture antilichaam aan gekoppeld fluorescerende eiwit streptavidine via de IL-8 target en een gebiotinyleerde IL-8 antilichaam. De magnetische kralen zijn gemanoeuvreerd in de oscillerende beweging door het aanbrengen van een wisselend magnetisch veld gradiënt door middel van twee elektromagnetische polen. De fluorescerende eiwitten, die zijn bevestigd aan de magnetische korrels worden samengevat in de detectie gebied en hun beweging in en uit een orthogonale laserstraal produceert een periodieke fluorescent signaal dat gedemoduleerd synchrone detectie. De magnetische modulatie biosensing systeem werd vroeger gebruikt om de coderende sequenties van de niet-structurele Ibaraki virus eiwit 3 (NS3) complementair DNA (cDNA) [2] op te sporen. De technieken die in dit werk aangetoond voor externe manipulatie en condensatie van deeltjes kunnen worden gebruikt voor andere toepassingen, zoals de levering van magnetisch gekoppelde drugs

Protocol

IL-8 test:

  1. Het reactiemengsel onder meer de volgende vier onderdelen in 100 ul eindvolume van testbuffer in hun respectievelijke concentraties. 10 ul van magnetische kralen met capture-antilichaam op 100 kralen / ul eindconcentraties, 2 pi van gebiotinyleerd IL-8 antilichaam bij een nano-gram/μl uiteindelijke concentratie, een ui van streptavidine fluorescerend eiwit bij 20 nano-gram/μl uiteindelijke concentratie, en 1 ul van IL-8 doel op 0,48 pico-gram/μl. De componenten worden toegevoegd een voor een naar de assay buffer en vervolgens geschud gedurende 30 minuten.
  2. Een controle reactie is bereid op dezelfde manier, zonder de IL-8 doelwit.
  3. De reacties worden later geplaatst, zonder enige scheiding of wassen stap in de cuvetten en gecontroleerd met behulp van de MMB-systeem.

MMB-systeem:

  1. Plaats de cuvet in zijn positie tussen de twee elektromagnetische polen.
  2. Bedien de modulatie huidige en wacht 30 seconden om aggregatie en condensatie van de kralen maken
  3. Meet het signaal van de lock-in versterker met behulp van een oscilloscoop.

Representatieve resultaten:

Visuele inspectie van de geaggregeerde kralen presenteerde een duidelijk verschil tussen de reactie met het doel en de reactie zonder het doel. In alle reacties met de doelgroep, de kralen vormden een enkele, dichte aggregaat dat bewoog in en uit de laserstraal in een verenigen manier. Echter, in alle de reactie, zonder het doel, de kralen waren minder geaggregeerd en hun beweging was minder te verenigen (zie figuur 1).

Figuur 1
Figuur 1: visuele inspectie van de sandwich immunoassay "(a) zonder het doelwit IL-8 (b) Met het doel IL-8.

De paal modulatie klok (geel) en de PMT uitgangssignaal (magenta), terwijl het detecteren van 0,48 pico-gram IL-8 doelwit zijn weergegeven in Figuur 1 (a). De modulatie frequentie voor elke paal is op 2 Hz. Echter, omdat het theoretisch werd verwacht, toen de kralen van de laserstraal pas, de PMT detecteert het tl-licht en er is een piek in de PMT uitgangsspanning. Daarom is de demodulatie frequentie is op 4 Hz. Wanneer het PMT-signaal en de verdubbelde-modulatie klok (op 4 Hz) worden toegevoerd aan de sluis in versterker, de kwetsbare fase detector detecteert de synchronisatie en de resultaten met een hoge spanning (zie figuur 2).

Figuur 2
Figuur 2: (a) de modulatie klok (geel) en de PMT-signaal (magenta) voor het opsporen 0,48 pico-gram IL-8 doelwit. (B) Het resulteerde in slot versterker spanning op twee verschillende scans.

Het slot in de versterker tonen geen signaal wanneer de te controleren steekproef werd getest. Dit feit, samen met de visuele verschil in aggregatie suggereert dat de MMB systeem duidelijk kunnen identificeren van de aanwezigheid van IL-8 doelwit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Samengevat, we laten zien dat de MMB systeem kan worden gebruikt om de aanwezigheid van IL-8 doelwit te detecteren bij lage concentraties (0,5 pico-gram is de detectiegrens van de Bio-Plex Precision Pro cytokine assays [3,4]). Het vermogen van het systeem is niet beperkt tot IL-8 en kan gebruikt worden om andere eiwitten te detecteren. De voordelen van de MMB-systeem zijn de mogelijkheid om de doelgroep te detecteren snel en zonder enige scheiding of wasstap. Zo, het vergemakkelijkt de detectie proces en kan het systeem worden gebruikt in het veld toepassingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Dit werk werd mede ondersteund door het Ishaya Horowitz Fonds.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bio-Plex Pro Human Cytokine IL-8 set Bio-Rad 171-B5008M
Recombinant human IL-8 target Thermo Fisher Scientific, Inc. R202625
Biotinylated monoclonal mouse anti human IL-8 antibody G265-8 BD Biosciences 554718
Streptavidin coupled fluorescent protein Bio-Rad Streptavidin PE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Danielli, A., Arie, A., Porat, N., Ehrlich, M. Detection of fluorescent-labeled probes at sub-picomolar concentrations by magnetic modulation. Optics Express. 16, 19253-19259 (2008).
  2. Danielli, A., Porat, N., Arie, A., Ehrlich, M. Rapid homogenous detection of the Ibaraki virus NS3 cDNA at pico-molar concentrations by magnetic modulation. Biosensors and Bioelectronics. 25, 858-863 (2009).
  3. Bio-Rad "Human angiogenesis assay panel". Bio-Plex Pro. Forthcoming.
  4. Instruction Manual. Bio-Plex Precision Pro Cytokine Assay. Bio-Rad Laboratories. Hercules, CA. Forthcoming.

Comments

2 Comments

  1. In regards to the IL-8 Assay: [1] Did you have a specific concentration values on hand? [²] Is there a specific pH range that you used? [3] How did you optimize so that the target antigen would bind to both the magnetic bead and the fluorescent protein?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 19, 2010 - 2:26 PM
  2. Hi Michael,
    Here are the answers to your questions:
    [1] Did you have a specific concentration values on hand?

    We made several concentrations according to the Bio-Rad kit that we used. We chose to present the results with the smallest concentration that we made.

    [²] Is there a specific pH range that you used?

    We used the assay buffer of the kit. I guess that it had the optimal ph for the reaction.

    [3] How did you optimize so that the target antigen would bind to both the magnetic bead and the fluorescent protein?

    This kit is optimized already. You may check the reference list of the JoVE manuscript and see the kit&#x²019;s specifications. For further information on the MMB system as well as on the IL-8 kit, I suggest that you look at additional paper that we published: A. Danielli, N. Porat, M. Ehrlich, and A. Arie, &#x²01C;Magnetic modulation biosensing for rapid and homogeneous detection of biological targets at low concentrations&#x²01D;, Current Pharmaceutical Biotechnology, 11, 1²8-137 (²010)

    Best regards,

    Amos Danielli

    Reply
    Posted by: Amos D.
    November 2, 2010 - 3:44 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics