Detectie van eiwit interacties in Plant met behulp van een Gateway-compatibele Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) Systeem

Om de interactie tussen twee eiwitten te testen, moeten de twee genen van belang worden gekloneerd in onze BF- en vectoren met behulp van de Gateway-cloningtechniek. Deze constructen worden getransformeerd in Agrobacterium GV3101. De bacteriële culturen van GV3101 die de constructen bevatten, worden gemengd en gezamenlijk geïnfiltreerd in de bladeren.

Als de twee kandidaateiwitten met elkaar interageren, kan het YFP-signaal worden waargenomen met behulp van een confocale microscoop. Het hoofddoel van de BFC-techniek is het testen van de interactie tussen twee eiwitten. Bij vavo hebben we een reeks gateway-compatibele BFC- en IS-two-hybrid-vectoren ontwikkeld, die onderzoekers voorzien van gebruiksvriendelijke instrumenten om zowel BFC- als ISTO-two-hybrid-assays uit te voeren.

In deze video gaan we de eenvoud van het gebruik van ons BFC-systeem demonstreren om eiwitinteracties te testen in een eukaryoot expressiesysteem. Eerst moet u de GV 3 1 0 1 bacteriële cultuur voorbereiden.

Kies een enkele kolonie van uw plaat en ent deze in 5 mL YEB-medium met de juiste antibiotica. Schud deze culturen vervolgens gedurende de nacht bij 28 °C. De snelheid is 200 rpm.

De bacteriële culturen zouden de volgende ochtend klaar moeten zijn. Controleer of de bacteriën niet overgroeid zijn. Haal de culturen uit de incubator en breng een monster van elke cultuur over in een steriele centrifugebuis van 1,5 mL.

Plaats de centrifugebuizen in een tafelcentrifuge. Centrifugeer de bacteriën 10 minuten bij 1000 G bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg. Was vervolgens het pellet door één volume infiltratiemedium toe te voegen en resuspendeer dit door enkele keren zachtjes te pipetteren.

Herhaal de wasstap nog twee keer. Dit is belangrijk omdat het helpt om sporen van antibiotica in het bacteriële medium te verwijderen, die anders de plantencellen na infiltratie kunnen beschadigen. Na de laatste wasbeurt wordt het pellet opnieuw gesuspendeerd in 0,5 mL infiltratiemedium; meet de OD₆₀₀ van deze bacteriesuspensies met een spectrofotometer, waarbij infiltratiemedium als blanco controle wordt gebruikt.

Na de OD-meting moet de OD worden aangepast met behulp van infiltratiemedium. De uiteindelijke OD moet tussen 1 en 1,2 liggen. Alle bacteriële suspensies moeten worden voorbereid voordat u doorgaat naar de volgende stap.

Breng gelijke hoeveelheden bacteriële suspensies over die overeenkomen met uw twee kandidaate eiwitten en meng deze in een nieuwe 1,5 ml buis. Het bacteriële mengsel is nu klaar voor infiltratie. Bereid alle combinaties voor en vergeet niet een negatieve controle op te nemen. Gebruik vijf tot zes weken oude Nicotiana benthamiana planten voor de infiltratie.

U kunt de planten uit de groeikamer halen en ze een uur voor de infiltratie op kamertemperatuur plaatsen om de huidmondjes te openen. Dit zal het infiltratieproces vergemakkelijken. Zuig ongeveer 100 µL van de gesuspendeerde bacteriën op.

Meng het mengsel in een manuele spuit met een stompe naald zonder de naald. Plaats de punt van de spuit tegen de onderkant van het blad. Ondersteun de bovenkant van de knie met uw vinger.

Druk over het algemeen op de zuiger. U zou de vloeistof door het blad moeten zien diffunderen terwijl deze de meso fyllen en de luchtruimtes vult. Markeer na infiltratie het geïnfiltreerde gebied met een markeerstift. Anders zult u na twee dagen het geïnfiltreerde gebied niet meer kunnen identificeren. Als u verschillende bacteriële mengsels moet infiltreren, zorg er dan voor dat u uw handschoenen bespuit met 50% ethanol of dat u uw handschoenen wisselt tussen de infiltraties.

Probeer een ribruimte van One meter tussen de infiltraties over te laten om kruiscontaminatie te voorkomen. De PFA-signalen moeten elke 24 uur worden gemonitord vanaf de infiltratie tot maximaal vijf dagen. U kunt twee overtrekmouwen van verschillende Sizes gebruiken om het monster vast te houden.

Plaats eerst één druppel gedestilleerd water op een objectglasdekglas. Snijd vervolgens een klein stukje bladweefsel uit de geïnfiltreerde zone. Probeer te voorkomen dat er een nerf in het monster terechtkomt.

Plaats het met het mes gesneden weefsel in het water op de objectglas. Leg er vervolgens een kleiner dekglas overheen en druk dit voorzichtig aan. Het monster kan nu onder de microscoop worden geobserveerd. Hier gebruiken we deze NACA T CSS P twee confocale microscoop om het BIFC-signaal te visualiseren.

Ook een standaard confocale microscoop kan worden gebruikt. Confocale microscopie levert betere beelden en detecteert zwakke signalen. U kunt de YFP-parameter gebruiken om de VFC-signalen in dit NCAs P twee-systeem te detecteren.

U kunt simpelweg dubbelklikken op deze YFP-voorinstelling hier, waardoor de excitatie automatisch wordt ingeschakeld en het emissiedetectiebereik wordt ingesteld. Als u een ander systeem gebruikt, raadpleeg dan de handleiding om de parameters correct in te stellen. Wij hopen dat u na het bekijken van deze video in staat zult zijn om de BFCE uit te voeren om eiwit-eiwitinteracties te testen met behulp van het unbe MI Transcend-expressiesysteem.

Deze procedure kan ook worden toegepast op tabaksplanten en AY-planten. Onze BFC-vectoren bevatten respectievelijk ook een HA- en vlagtag, waardoor u indien nodig ook co-IP kunt uitvoeren om de interacties te valideren.