Крупномасштабная Экраны метагеномных библиотеки

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Pham, V. D., Palden, T., DeLong, E. F. Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries. J. Vis. Exp. (4), e201, doi:10.3791/201 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Метагеномных архива библиотеки крупных фрагментов смежных геномных последовательностей из микроорганизмов, не требуя предварительного культивирования. Создание упрощенной процедуре для создания и проверки метагеномных библиотек поэтому полезен для эффективного высокопроизводительного расследования генетических и метаболических свойств некультурных комплексов микроорганизмов. Здесь основные протоколы представлены на видео, которое мы предлагаем, является наиболее полезным форматом для точного описания длительный процесс, который попеременно зависит от роботов приборов и (человеческого) вмешательства руководства. Во-первых, мы использовали робототехники обнаружить библиотеку клонов на высокой плотности мембран macroarray, каждый из которых может содержать повторяющиеся колоний от двадцати четырех 384-луночных библиотеки. Автоматизация имеет важное значение для этой процедуры не только точность и скорость, но и за счет миниатюризации масштабах, необходимых, чтобы соответствовать большое количество клонов в библиотеке высокой плотности пространственных механизмов. После генерируется, мы в следующий раз продемонстрировал, как macroarray мембраны могут пройти обследование на гены интереса с использованием модифицированной версии стандартных протоколов для зонда маркировки, мембранные гибридизация и обнаружения сигнала. Мы дополняли наглядной демонстрации этих процедур с подробного письменного описания этапов и материалов, необходимых, все из которых доступны в Интернете вместе с видео.

Protocol

1. Гибридизация процедуры

Один гибридизации трубка будет принимать по 1 или 2 мембраны (размер 22 на 22 см). Используйте 50 мл гибридизации смеси и 0,5 мг ДНК-зонда (10 нг / мл, конечная концентрация) в гибридизации трубки. Для достижения наилучших результатов, используйте гель-очищенной ДНК в качестве зонда. Если расширение масштабов подготовки зонда, увеличение количества трубок, а не увеличения количества реагентов в трубке.

Зонд подготовки (0,5 мг ДНК):

  1. Развести 15 мкл поперечных связей решение с 60 мкл воды.
  2. Развести ДНК до 10 нг / мкл водой до 50 мкл общего объема в винт крышками микропробирок.
  3. Денатурации ДНК в течение 5 минут в кипящую воду.
  4. Быстро передавайте в лед и дайте остыть в течение 5 мин. Спиновые кратко.
  5. Добавить 50 мкл реакционного буфера и аккуратно перемешать.
  6. Добавьте 10 мкл реагента маркировки и аккуратно перемешать.
  7. Добавить 50 мкл разбавленного поперечных связей решение с шага 1 и аккуратно перемешать. Vortex мягко и спина кратко.
  8. Инкубировать при 37 ° С в течение 30 мин.
  9. Держите на льду в течение до 2 ч или добавить равный объем 100% глицерина и хранить при температуре -20 ° C.

    Примечание: Использование воды, поставляемой в комплекте. Храните все реагенты на льду, если не указано иное.

Мембранные подготовки и гибридизации

  1. Разогрейте 50 мл буфера гибридизации и гибридизации трубки до 60 ° C.
  2. Добавить гибридизации буфера для гибридизации трубки. Свернуть мембраны (ов) и добавить к гибридизации трубки. (Если добавить 2 мембраны в трубку, сначала свернуть одной мембраны полностью, затем сверните другие мембраны на первое место в том же направлении.)
  3. Инкубируйте гибридизации трубке при 60 ° С не менее ½ ч. (Удостоверьтесь, что мембрана (ы) промокнуть основательно.)
  4. Передача около 1 мл буфера гибридизации с длинной пипеткой от гибридизации трубки в пробирку меченым зондом. Vortex мягко и спина кратко. Передача смесь обратно в гибридизации трубки.
  5. Инкубировать при 60 ° С в течение ночи.

    Примечание: Используйте пинцет и перчатки при работе с оболочкой. Смешайте содержание гибридизации трубы аккуратно, потому что слишком много агитация вызовет постоянного образования нежелательных пены. Мембраны должны быть добавлены в мокром состоянии, замочить в буфер гибридизации или воды в случае необходимости и стечь лишней жидкости перед добавлением.

2. Определение процедуры

Стиральная мембран

  1. Разогреть первичного буфера стиральную до 60 ° C. (Используйте микроволновую печь и / или нагревательного элемента.)
  2. Если Есть две мембраны в одном гибридизации трубки, передача одной мембраны на чистую, разогретую, пустые трубки гибридизации.
  3. Кратко промыть гибридизации трубки около 50 мл первичной промывочным буфером.
  4. Добавить 100 мл первичной промывочный буфер в трубку гибридизации и инкубировать при температуре 60 ° С в течение 10 мин.
  5. Повторите шаг 3 и 4.
  6. Передача мембраны для мытья тары и инкубировать, по крайней мере 250 мл вторичный буфер стирка при комнатной температуре в течение 5 мин.
  7. Повторите шаг 6.

    Примечание: Мембраны могут быть оставлены на вторичном буфере стирка при комнатной температуре в течение до ½ часа до генерации сигнала.

Поколения и обнаружения сигнала (процедура для одной мембраны)

  1. Лента двух кусков плоских SaranWrap на настольные (по одному на шаге 2 и по одному на шаге 4).
  2. Тщательно отвода избыточного буфер из мембраны, касаясь углов мембраны к стенке контейнера и передачи мембраны на SaranWrap (образец вверх).
  3. Залить 6-7 мл ECF реагента над мембраной и раз Саран запахом мембраны. Тщательно распространять ECF реагента над мембраны, мягко движущихся Kimwipe более SaranWrap. Инкубировать в течение 5 мин.
  4. Слить избыток реагента ECF от мембраны и передача его на новый SaranWrap, сложите запахом мембраны и уплотнения краев ленты. Обложка мембрана с алюминиевой фольгой. Инкубируйте в течение 1-2 часов.
  5. Подготовка пластин стекла сканера, распределяя 1-2 мл ECF реагента над стеклянной пластиной. Затем перенесите мембраны на стеклянную пластину (образец стороной вниз) и распространять еще 1-2 мл реагента ECF над мембраной. Наложение с SaranWrap и осторожно подтолкнуть все пузырьки воздуха в сторону от мембраны. (Вы можете разместить жесткой пластины сверху SaranWrap держать мембрана прижимается к стеклянной пластинке.)
  6. Используйте Fuji FLA-5100 флуоресценции сканер ("1 лазер 1 изображение" режим) со следующими параметрами: возбуждение 473 нм, обнаружение фильтр LPB (510 нм), разрешение 50 мкм, 16-битный сигнал окончания CH1 400 В. (сканирование занимает около 15-20 мин на оболочку размером 22 на 22 см).

    Дополнительно:

  7. Дайте настояться в течение 2-4 часов (или дольше).
  8. Повторите сканирование как в шаге 6.

3. Зачистка и хранения процедуры (Нуф версия)

  1. Передача мембраны до 100% и др.hanol и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин при легком помешивании.
  2. Замените свежие 100% этилового спирта и выдержать в течение ночи при комнатной температуре. (Мембрана может оставаться в этаноле в течение нескольких дней.)
  3. Замените этанола с дистиллированной водой и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин.
  4. Добавить 100 мл воды и 5 мл 10% SDS (последние 0,5% SDS) для гибридизации трубки и аккуратно перемешать. Добавить мембраны.
  5. Инкубировать при 80 ° С в течение 1 ч.
  6. Передача мембраны чистый, пустой контейнер.
  7. Добавить 500 мл воды и 5 мл 10% SDS (окончательный 0,1% SDS) стакан и тепло энергичный варить в микроволновой печи.
  8. Налейте кипящую почти 0,1% SDS решением над мембраной и мягко агитировать за несколько минут. Дать остыть до комнатной температуры.
  9. Полоскание в по меньшей мере 250 мл стерильного 100 мМ Трис рН 8, по крайней мере 10 мин.
  10. Оберните мембраны в SaranWrap и тщательно близко краям ленты. Хранить при температуре 4 ° С. (Мембраны никогда не должна высыхать.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Зачистки процедура не была оптимизирована. Тем не менее, зачистки процедурой, приведенной в инструкции производителя (2 моет каждый, 10 мин в 100% этанол, 1 мыть 1 ч при 60 ° С в 0,5% SDS) является недостаточной. По крайней мере инкубации в течение ночи в 100% этанола необходимо растворить продукт ECF реакции; несколько дней инкубации в 100% этилового спирта, похоже, не оказывают негативного влияния на способность reprobe мембраны. SDS лечения производителя также, кажется, недостаточно. Нуф пытался 1 ч при 80 ° C с 0,5% SDS следуют одна лечения с почти кипящей 0,1% SDS успехом. Трейси показал, что одно время заливки более с почти кипящей 0,1% SDS достаточно.

Полезные советы:
Гибридизации буфер, гибридизация трубки, и первичные промывочный буфер должен быть предварительно нагретую до 60 ° С до использования, и должна храниться при этой температуре в течение всего эксперимента. Например, держать буферов на плитке с погруженными термометр; на тарелку Corning отопления, установка около 3 результаты в 60 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
AlkPhos Direct Labelling Reagents kit Amersham RPN3680 Contains labeling reagent, cross-linker solution, reaction buffer, water, control DNA, hybridization buffer, blocking reagent. Store hybridization buffer and blocking reagent at room temperature, other reagents at 2-8°C.
ECF Substrate kit Amersham RPN3685 Contains ECF substrate, ECF substrate dilution buffer.Note: Pack contains total 60 ml reagent; aliquot into 10 ml samples in Falcon tube and store at 20°C. Use about 10 ml per membrane (size of 22 by 22 cm).
20x Secondary Wash Buffer buffer 121 g Tris(final 1 M), 117 g NaCl(final 2 M).Adjust pH to 10. Adjust to 1 L with water. Store at 2-8°C for up to 4 months.
0.5 M NaH2PO4 buffer pH 7 buffer 69 g NaH2PO4.H2O. Adjust pH to 7 with NaOH. Adjust to 1 L with water. Store at room temperature.
1 M MgCl2 50.8 g MgCl2.6H2OAdjust to 250 ml with water. Store at room temperature.
10% (w/v) SDS 20 g SDSAdjust to 200 ml with water. Store at room temperatur
Combination pack RPN3692 = RPN3680 + RPN3685

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Comments

1 Comment

  1. whats the success rate?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 14, 2010 - 1:26 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics