Создание первичных культурах фибробластов взрослых от грызунов

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

В этой статье описывается протокол для изоляции и обслуживание первичных культурах фибробластов из кожи и ткани легких диких грызунов.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents. J. Vis. Exp. (44), e2033, doi:10.3791/2033 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Важность использования первичных элементов, а не линии раковых клеток, для биологических исследований становится широкое признание. Первичные элементы являются предпочтительными при исследовании клеточного цикла управления, апоптоза и репарации ДНК, как раковые клетки нести мутации в генах, участвующих в этих процессах. Первичные элементы не могут быть культурными бесконечно из-за наступления старения репликативной или aneuploidization. Таким образом, новые культуры должны быть созданы на регулярной основе. Процедура выделения грызунов эмбриональных фибробластов хорошо известна, но изоляция взрослых культур фибробластов часто представляет проблему. Взрослых фибробластов грызунов изолированы от мышиных моделях болезни человека может быть предпочтительным контроль при сравнении их от человеческих фибробластов пациентов. Кроме того, взрослые фибробласты только материал при работе с дикими грызунами, где беременные самки не могут быть легко получены. Здесь мы предлагаем протокол для изоляции и культуры взрослых фибробластов из кожи грызунов и легких. Мы использовали эту процедуру успешно изолировать фибробластов из более чем двадцати видов грызунов от лабораторных мышей и крыс диких грызунов, таких как бобр, дикобраз, и белки.

Protocol

1. Перед началом работы

  1. Стерилизовать ножницы и пинцет с 70% этанола.
  2. Место малой магнитной мешалкой внутри 30 мл стакан, залить двумя слоями фольги, и автоклав.
  3. Подготовка 28 Вунш ЕД / мл исходного раствора Liberase Blendzyme 3 в стерильной воде. Сделать 0,5 мл аликвоты и замораживают при температуре -20 ° C. Оттепель новых аликвоту перед каждым использованием. Решение может появиться облачно после размораживания. Vortex решение пока не станет ясно.
  4. Разминка СМИ культуре клеток.

2. Подготовка животных Пример

Внимание: дикие животные могут содержаться патогенные микроорганизмы, такие как вирус бешенства. Всегда быть в курсе открытых острых предметов.

  1. Усыпить животное и место каркаса при 4 ° C. Лучше всего использовать туши сразу же, однако, если это невозможно, таких как, если животные собираются в поле, туши может быть использован в течение 24 часов. После 24 часов снижается ячейки доходности.
  2. Рассеките животное в хирургическом люкс или в капот химические (не в ткани капот культуры).
  3. Подмышками область удобный сайт для сбора образцов кожи, как подмышки кожа тоньше, содержит меньше жира и меха менее плотной. Чистый разрез сайта с 70% этанола. Убедитесь, что мех пропитывается этанолом.
  4. Бритье меха вокруг разреза с острым скальпелем. Бритье большую площадь, чем желаемый разреза. Постарайтесь свести к минимуму сокращения к коже. Спрей области с 70% этанола и дайте ему высохнуть.
  5. Для сбора акцизного образец кожи фрагмент примерно на 1 см 2. Pinch кожи с тканью щипцы, и вырезать ножницами. Постарайтесь, чтобы не порезать жировой слой с кожи, а жир мешает коллагеназы пищеварения. Для сбора образцов легких, мыть области груди на 70% этанола, и открыть кожи на груди с помощью ножниц, сделав Т-образный разрез и потянув за исключением полы кожи. Вымойте открыл мышц области с 70% этанола и дайте высохнуть. Вырезать грудной клетки стерильные щипцы и ножницы (используйте кость фрезы для крупных животных). Используйте стерильные методы, чтобы избежать загрязнения внутренних органов. Не прикасайтесь к внутренним органам с инструментами, которые затрагивали шерсть животных. Вырезать легких фрагментов примерно 1 см 2, используя стерильные щипцы и ножницы.
  6. Место фрагментов ткани в 50 мл стерильного труб с PBS, чтобы избежать высыхания.
  7. Мойте за пределами 50 мл трубки с фрагментами тканей с этанолом, и взять их на капот культуры ткани.
  8. Правильно распоряжаться туши животного.

3. Извлечение Клетки

  1. Передача фрагментов тканей в 10 см культуре ткани блюдо использованием стерильного скальпеля. Не передавайте слишком много PBS с образцом.
  2. Вырезать ткани в ~ 1 мм части, используя два скальпеля. Используйте два лезвия использованием ножниц, начиная от центра и вытягивать друг от друга. Держите ткани сжатой вверх, не режут по частям. Когда резки достаточно кожи напоминает замазку, он не будет разделяться на куски, но будет растягиваться тонкий. Легочной ткани легче резать, и он будет разделиться на мелкие кусочки.
  3. Использование скальпеля, передача вырезать ткань в стерильные 30 мл стакан с стерильных мешалкой. Промыть пластины используются для резки ткани с 10 мл DMEM/F12 СМИ с 0,14 единиц Вунш / мл Liberase Blendzyme 3 и 1X антибиотик / противогрибковым и добавить решение в стакан 30 мл с фрагментов тканей.
  4. Обложка стакан с стерильную пленку, и инкубировать при 37 ° С, помешивая, в течение 30 до 90 минут. Длина инкубации зависит от типа и вида ткани. Будьте осторожны, не за-дайджест ткани. Лучшая урожайность достигается при фрагментов тканей по-прежнему присутствуют в конце пищеварения. Кожа занимает больше времени, чтобы переварить, чем легких. Кожа из крупных животных требуется больше времени, чтобы переварить. Проверьте пищеварения через 30 минут, а затем каждые 10 мин. Когда кожа пищеварения завершения СМИ мутнеет и кожицы отделены друг от друга, а по краям фигур становятся "нечеткой". Легкое пищеварение должно быть прекращено, когда легкие фрагменты меняют цвет от красного до белого, и приступить к формированию липкие волокна.
  5. Внесите раствор, содержащий фрагменты ткани вверх и вниз, разорвать сгустки. Перенесите раствор в стерильные 50 мл трубки. Если фрагменты легко перемещаться через 10 мл пипетки резки и пищеварение было сделано хорошо. Промыть стакан 3 раза по 10 мл теплой DMEM/F12 средств массовой информации с 15% FBS, 1X антибиотик / противогрибковым и добавить информации к 50 мл трубки с фрагментами тканей. Закрыть 50 мл трубки и смешать обращением несколько раз. FBS в СМИ остановится Liberase пищеварения.
  6. Спиновые на 524 г в размахивая ведром культуре ткани центрифуги в течение 5 мин. Удалить супернатант. Ресуспендируют гранул в 10 мл теплой DMEM/F12 средств массовой информации с 15% FBS, 1X антибиотик / противогрибковым. Внесите подвеска смаксимальное усилие на разрыв ткани штук.
  7. Добавьте еще 30 мл DMEM/F12 средств массовой информации с 15% FBS, 1X антибиотик / противогрибковым, перемешать и центрифуге при 524 г в размахивая ведром культуре ткани центрифуги в течение 5 мин. Повторите еще раз, чтобы удалить следы Liberase.
  8. Ресуспендируют гранул в 10 мл DMEM/F12 средств массовой информации с 15% FBS, 1X антибиотик / противогрибковым и трансфер в 10 см ткани блюдо культуры и место в культуре ткани инкубаторе при температуре 37 ° C, 5% СО 2, 3% O 2 .
  9. Проверьте пластины каждый день в течение фибробластов и СМИ цвета. Если изоляция была успешной, фибробласты выползать из фрагментов тканей и приложить к пластинке (рис. 1). Фибробласты начинают выхода фрагментов тканей в течение 2-5 дней.
  10. Если цвет средства массовой информации изменения в желтый, это указывает на возможное загрязнение или переполненных клетках. Изучить плит под микроскопом при большом увеличении. Если бактерии, грибки, глисты или присутствуют отклонения пластин (это редко проблема с лабораторными животными, однако может возникнуть, когда образцы собираются от диких). Если нет загрязнение присутствует, но СМИ изменили цвет, это вызвано либо слишком много клеток, или слишком много фрагментов тканей, расположенных в одной тарелки. Если более 60% пластина покрыта прилагается фибробластов, изменение средств массовой информации на пластине и передачи фрагментов тканей с новой пластинки с новыми медиа. Если это не так много фибробластов прикреплены к пластине, изменение средств массовой информации и разделить ткани куски 2-4 пластины.
  11. Через 7 дней, если средства массовой информации не были изменены ранее, изменение средств массовой информации и передачи фрагментов тканей с новой пластинкой с новыми средствами массовой информации.
  12. Инкубируйте клетки и ткани фрагментов для дополнительных 7 дней. К 14-й день всех жизнеспособных фибробластов вышли из фрагментов тканей.
  13. Через 14 дней от начала изолятор, отбросить старые средства массовой информации и фрагментов тканей, урожай клеток и пластины их на новую пластинку в 5х10 5 клеток / пластину EMEM с 15% FBS, 1X Пенициллин / стрептомицин, без незаменимых аминокислот и пирувата натрия. EMEM СМИ будут поддерживать рост фибробластов только и другие типы клеток умрет или остановки пролиферации.
  14. После клетки достигает 80-90% слияния, заморозить аликвоту клеток для использования в будущем.
  15. Продолжить культивирования клетки путем разделения их на 5х10 5 клеток / пластину, когда клетки достигают 80-90% слияния.

4. Представитель Результаты

Нормальные фибробласты крупные клетки с крупными выступами (lamellipodia) (рис. 2). Фибробласты растут в монослой. Здоровый растущий культура содержит 1-10% в клетках этапе М, признан окружены клетками возвышается над поверхностью пластины, но не отделена от пластины (рис. 3). Как правило, 10 см блюдо с присадками 5х10 5 клеток становится вырожденной в течение 3-4 дней. Время удвоения сильно зависит от вида и может быть больше, для некоторых долгоживущих видов грызунов 1. Когда клетки заполняют пластину они арестовывают распространения в стадии G1. Типичные сливной пластины фибробластов содержит плотно слой клеток (рис. 4). Когда клетки достигают 90% слияния они готовы к расщеплению. При желании, клетки могут быть сохранены на арестованы сливной пластине в течение длительного периода времени с регулярными изменениями среды (один или два раза в неделю).

Рисунок 1
Рисунок 1. Фибробластов мыши изоляции от кожи () и легких (B). СМИ была изменена, чтобы удалить одиноких клеток и мусора до принятия картины на 7 день.

Рисунок 2
Рисунок 2. Фибробластов мыши легких.

Рисунок 3
Рисунок 3. Области мышиных фибробластов, содержащих клетки в М-сцены, снятых в 10-кратным увеличением.

Рисунок 4
Рисунок 4. Сливной пластины фибробластов мыши, сфотографировали на 10-кратным увеличением.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Нормальная первичных фибробластов обеспечивают прекрасную альтернативу установленном раковых клеток линий в биологических исследованиях. Важным преимуществом является то, что фибробласты, они не несут мутации онкогенов и опухолевых супрессоров и сохранить нетронутым контрольно-пропускные пункты клеточного цикла. Это делает нормальные фибробласты предпочтительной системой для изучения регуляции клеточного цикла, репарации ДНК и апоптоза. Протокол, описанный здесь, обеспечивает простой рецепт для изоляции и обслуживание первичных фибробластов. Этот протокол был использован успешно изолировать фибробластов из более чем 20 видов грызунов.

Важно сохранения стерильности во все времена при работе с культурами клеток, чтобы избежать загрязнения. Если лаборатория также культур агрессивного рака клеточных линий, таких как клетки HeLa, фибробласты следует обрабатывать отдельно от раковых клеток. Желательно иметь назначенного капот и инкубатор для первичных культур.

Желательно, чтобы поддерживать первичных клеточных культур при физиологической концентрации кислорода в размере 3%. Атмосферный (20%) сокращает продолжительность жизни кислород культур и увеличивает окислительный стресс. Мышь фибробласты являются чувствительными к окислительному стрессу и будет стареть или введите кризис в ~ 14 удвоений популяции, когда поддерживается на уровне 20% (в атмосфере) кислорода. Мышь фибробластов может сохраняться неопределенно долго на уровне 3% кислорода 2.

Всегда вести учет численности населения удвоение культур. Крупные виды (массы тела выше 8000 г), вероятно, чтобы показать репликативного старения, и будет иметь ограниченный срок службы в области культуры, даже на уровне 3% кислорода 1. Клетки из более мелких видов, таких как мыши и крысы, будет расти до бесконечности в размере 3% кислорода, но со временем может стать анеуплоидных. Если это возможно, начать эксперименты с использованием клеток при низких удвоения популяции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements

Мы благодарим д-р Стивен Austad за предоставление первой версии этого протокола. Эта работа была поддержана грантами NIH и Эллисон Медицинский фонд В. Г. и А. С.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 media Invitrogen 11330-032
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified Invitrogen 01437-036 The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts.
Antibiotic/Antimycotic Invitrogen 15420-096
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
Liberase TM Research Grade Roche 05401127001 Replacement enzyme.
A note from the authors: Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 05401127001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.
EMEM media ATCC 30-203 The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate.
Feathered #21 disposable, sterile scalpel Multiple suppliers
Three Gas Control incubator Forma or Heraeus

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seluanov, A. Distinct tumor suppressor mechanisms evolve in rodent species that differ in size and lifespan. Aging . Cell. 7, 813-823 (2008).
  2. Parrinello, S. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol. 5, 741-747 (2003).

Comments

29 Comments

  1. Very helpful protocol. Got it working at the very first try, Would highly recommend the protocol.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 14, 2012 - 5:10 PM
  2. I have recently isolated fibroblasts from fresh fibrotic human lung. I used collagenase and plated the cells via your protocol. the cells seem to be of ² populations: one is long (²0% of plate) typical of fibroblast but the other cells are round. They look like they just started to adhere to the plate. What cells could these be? Is this happen often? COuld they be a subset of fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Barbara S.
    April 4, 2012 - 9:33 AM
  3. Hi
    The round cells are epithelial cells that always accompany lung fibroblast isolation. These cells will just float. After you switch the media to EMEM (mentioned in Step 13) and start splitting the fibroblasts, these cells will go away.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2012 - 12:11 PM
  4. I have used your protocol successfully before on human lung tissue. However this time, the majority of our cells were epithelial- look very much like keritanocytes. Is there something we could do to only keep the fibroblasts growing- change to MEM media?
    Also, the next time we try this protocol, is there anything we can do to not get so many epithelial cells?WIll be happy for any suggestions. Thanks.

    Reply
    Posted by: Barbara S.
    April 5, 2012 - 8:14 AM
  5. Hi Barbara,
    We always get the round epithelial cells during our lung fibroblast isolation too. When you switch to EMEM media and start splitting the fibroblasts, they will be selected for and the epithelial cells will be lost.
    Next time you try the protocol, you can use EMEM media for the whole isolation procedure instead of DMEM/F1² to minimize the epithelial cells you get. But the trade-off is that the efficiency of isolation might decrease. Good luck.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2012 - 12:15 PM
  6. A note from the authors:
    Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3, they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 054011²7001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2012 - 12:31 PM
  7. Thank you so much for your reply. I split them yesterday and changed the media to MEM.

    Reply
    Posted by: Barbara S.
    April 6, 2012 - 7:35 AM
  8. What is the best way to remove tissue peices on day 7? Especially with the larger tissue peices, ones that you can clearly see, produce more epithelial cells, where as the small peices (as in your pictures) produce mostly pure fibroblasts. Also, do you transplant the tissues on day 7 regardless of the confluency of your plate?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 11:59 AM
  9. On day 7, we gently aspirate the supernatant (with the tissue pieces) with a pipette, transfer it to a new plate and provide the original plate with fresh media. In this way, the small pieces attached to the plate are not disturbed and the other tissue debris with the potential to give out more fibroblasts can do so on a new plate.
    Also, yes, it is a good idea to transfer the tissues on a new plate on day 7.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 3:43 PM
  10. When you trypsinize initially, do you do this aggressively and try to remove all the cells from the plate (fibroblast and epithelial)? I have found that the fibroblasts seem to trypsinize first and can thus help to purify the culture, but my cell yield is significantly smaller (too small). Thank you for you help.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 4:05 PM
  11. The first trypsinization dŒs not have to be aggressive. As long as all the fibroblasts are off the plate and floating, we dont worry about the epithelial cells. They usually disappear after the first couple of passages with EMEM media. The fibroblasts are fast growing and will be selected for with passaging.
    To improve the yield, I would suggest ² things in the isolation procedure : Mincing the tissue very well and incubating the tissue pieces for a longer time in the Collagenase enzyme (while taking care to avoid over-digestion).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 4:18 PM
  12. You recommend storing 0.5 mL aliquots of Blendzyme at ²8 units/ml (i.e. 14 wunsch units per aliquot) but you recommend using 0.14 units/ml in 10 mls of media, or 1.4 wunsch units per digestion) This implies each aliquot is for 10 digestions. Is this correct?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 16, 2012 - 10:59 AM
  13. Yes

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 16, 2012 - 11:04 AM
  14. After 14 days I achieve confluence and then split into fibroblast specific growth media and these cells have no trouble reaching 80-90%. When I subsequently split this population the cells senesce. Is there any obvious reason for this? It would think that 14 days of growth would cause a primary cell to senesce but your protocol suggests that I should be able to continue splitting my cells and further purfy in the process. I appreciate your help!

    Reply
    Posted by: Justin K.
    May 4, 2012 - 10:49 AM
  15. Hi Justin
    Are these mouse fibroblasts? Are you growing them in ²0% oxygen? If you are, then they will senesce. We grow all our cells in 3% oxygen and 5% CO² conditions.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 9, 2012 - 3:06 PM
  16. Hi, one of the first steps recommends to euthanize the animal and store it at 4oC. Do we complete this step even if we plan on using the animal right away? If so, for how long do we store the animal at 4oC? Is putting it on ice also acceptable?

    Reply
    Posted by: J A.
    May 13, 2012 - 7:49 PM
  17. No..It is best to use the animal right away. The 4C step is only if circumstances make it impossible to process it right away. In this case, we store the corpse at 4C(better) or on ice(in case of wild caught animals) for not more than ²4 hours.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 13, 2012 - 7:57 PM
  18. Also, another question I have is about the tissue fragments in the media. When would be the best time to remove them from the cells and replace them with media?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 14, 2012 - 12:42 AM
  19. It depends. Usually, if the media turns yellow a few days after isolation and if there aren't enough fibroblasts on the plate, we collect the fragments, suspend them in fresh media and plate them back. As the protocol says, day 14 is when we usually get rid of the tissue fragments.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 14, 2012 - 2:51 PM
  20. Hi,

    I a couple of questions about the reagents used. My first question is about the liberase enzyme used. I noticed that the liberase enzyme 3 from Roche has been discontinued. Would you recommend replacing it with the Liberase TM Research Grade medium enzyme with Thermolysin? If so, would you recommend keeping the concentration the same (.14 U/mL)? My second question is about the Fetal Bovine Serum used in this experiment. I understand that you recommend using the Qualified Fetal Bovine Serum because it has been shown to support the growth of primary fibroblast cultures. In my lab we use heat-inactivated FBS. Would you recommend me switching from heat-inactivated to qualified FBS?

    Thank you in advance for your help :)

    Reply
    Posted by: J A.
    May 21, 2012 - 11:25 AM
  21. Yes. We now use TM instead of Liberase 3 with the same concentration.
    I understand that heat-inactivation of FBS is usually done to get rid of complement factors. I don't know how critical it is for your experiments to do this but we never use heat-inactivated serum.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 24, 2012 - 3:06 PM
  22. I also have a question about plating the tissue into the media. ²4- hours after I plated my tissue pieces into the media, I looked at my cultures under the microscope and saw little round cells that adhered to the plate. I understand that the protocol mentions that fibroblasts do not typically exit the tissue for at least 48 hours, and the round epithelial cells that assist the growth of fibroblasts usually float through the media. I was just wondering if seeing these cells after ²4 hours is normal.

    Reply
    Posted by: J A.
    May 24, 2012 - 12:59 PM
  23. Yes it is normal, more for lung fibroblast isolation. Once the fibroblasts start growing, the round cells will be selected against.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 24, 2012 - 2:57 PM
  24. Hi,

    I was wondering what concentration of trypsin EDTA you used? I use trypsin 0.²5% trypsin EDTA to remove my cells during splitting (after an incubation time of 4 minutes). After trypsinizing the cells for 4 minutes, I have noticed that less than half of them are detached from the plate. I am afraid to leave the cells in trypsin for longer than 4 minutes because I do not want to damage them. Any suggestions?

    Reply
    Posted by: J A.
    July 18, 2012 - 1:05 AM
  25. We use Red trypsin with 0.²5% EDTA..Its very strong and we only treat cells with it for 1-² minutes. So you wash/rinse the plate with PBS after aspirating media, before adding trypsin? Because the FBS in the media inhibits trypsin activity and if the plates are not washed with PBS first, trypsin cannot act properly.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    July 18, 2012 - 11:28 AM
  26. Thank you for such detailed procedure. I am curious is it possible that the keratinocytes also exist in the fibroblast culture? Thank you.

    Reply
    Posted by: Hua-Ling C.
    September 19, 2012 - 3:16 AM
  27. Dear all, my adult fibroblasts (GFP positive C67Bl/6 mice) are not growing very well (DMEM, high glucose, Na-pyrovate, Pen/Strp, 15%FBS). Do you have any suggestions about what I could add to the media to increase proliferation? Thanks a lot. Gunnar

    Reply
    Posted by: Gunnar P.
    March 1, 2013 - 2:03 PM
  28. Can this protocol be adapted to isolate cancer-associated fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Wei L.
    July 9, 2013 - 2:59 PM
  29. Do you know what is the best marker to check the purity of mouse lung fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Jenny t.
    July 15, 2014 - 5:02 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics