В этой статье описывается протокол для изоляции и обслуживание первичных культурах фибробластов из кожи и ткани легких диких грызунов.
Abstract
Важность использования первичных элементов, а не линии раковых клеток, для биологических исследований становится широкое признание. Первичные элементы являются предпочтительными при исследовании клеточного цикла управления, апоптоза и репарации ДНК, как раковые клетки нести мутации в генах, участвующих в этих процессах. Первичные элементы не могут быть культурными бесконечно из-за наступления старения репликативной или aneuploidization. Таким образом, новые культуры должны быть созданы на регулярной основе. Процедура выделения грызунов эмбриональных фибробластов хорошо известна, но изоляция взрослых культур фибробластов часто представляет проблему. Взрослых фибробластов грызунов изолированы от мышиных моделях болезни человека может быть предпочтительным контроль при сравнении их от человеческих фибробластов пациентов. Кроме того, взрослые фибробласты только материал при работе с дикими грызунами, где беременные самки не могут быть легко получены. Здесь мы предлагаем протокол для изоляции и культуры взрослых фибробластов из кожи грызунов и легких. Мы использовали эту процедуру успешно изолировать фибробластов из более чем двадцати видов грызунов от лабораторных мышей и крыс диких грызунов, таких как бобр, дикобраз, и белки.
Protocol
1. Перед началом работы Стерилизовать ножницы и пинцет с 70% этанола. Место малой магнитной мешалкой внутри 30 мл стакан, залить двумя слоями фольги, и автоклав. Подготовка 28 Вунш ЕД / мл исходного раствора Liberase Blendzyme 3 в стерильной воде. Сделать 0,5 мл аликвоты и замораживают ?…
Discussion
Нормальная первичных фибробластов обеспечивают прекрасную альтернативу установленном раковых клеток линий в биологических исследованиях. Важным преимуществом является то, что фибробласты, они не несут мутации онкогенов и опухолевых супрессоров и сохранить нетронутым контрольно-п?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-р Стивен Austad за предоставление первой версии этого протокола. Эта работа была поддержана грантами NIH и Эллисон Медицинский фонд В. Г. и А. С.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
DMEM/F12 media
Invitrogen
11330-032
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified
Invitrogen
01437-036
The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts.
Antibiotic/Antimycotic
Invitrogen
15420-096
Penicillin/Streptomycin
Invitrogen
15140-122
Liberase TM Research Grade
Roche
05401127001
Replacement enzyme.
A note from the authors:
Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 – 10 mg, Cat. no. 05401127001 – 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.
EMEM media
ATCC
30-203
The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate.
Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents. J. Vis. Exp. (44), e2033, doi:10.3791/2033 (2010).