कृंतक से न्यूरॉन्स और गैर मानव प्राइमेट मस्तिष्क स्लाइसें के DiOLISTIC लेबल

Neuroscience
 

Summary

हम जीन बंदूक का उपयोग करने के लिए rodents और अलग अलग उम्र के गैर मानव प्राइमेट से मस्तिष्क स्लाइसें में न्यूरॉन्स में DiI जैसे फ्लोरोसेंट रंजक, परिचय प्रदर्शित करता है. इस विशेष मामले में, हम वयस्क (3-6 महीने पुरानी) चूहों और वयस्क cynomologus बंदरों (9-15 साल पुराने) का उपयोग करें. इस तकनीक है, मूल रूप से डा. Lichtman की प्रयोगशाला द्वारा वर्णित (गण मन

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Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices. J. Vis. Exp. (41), e2081, doi:10.3791/2081 (2010).

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Abstract

DiOLISTIC धुंधला जीन बंदूक का उपयोग करता है DiI जैसे फ्लोरोसेंट रंजक, मस्तिष्क स्लाइसें (गण मन एट अल, 2009, ओ 'ब्रायन और Lummis, 2007, गण मन एट अल, 2000) के न्यूरॉन्स में , परिचय. यहाँ हम प्रत्येक अनुकरणीय छवियों के साथ अच्छे और बुरे परिणाम है कि जब तक तकनीक की स्थापना में मदद मिलेगी साथ आवश्यक कदम के एक विस्तृत वर्णन प्रदान करते हैं. हमारे अनुभव में, कुछ कदम DiOLISTICS के सफल आवेदन के लिए महत्वपूर्ण साबित हुई. इन विचारों DiI लेपित गोलियों की गुणवत्ता, लगानेवाला जोखिम की हद तक, एकाग्रता और डिटर्जेंट के ऊष्मायन समाधान में प्रयोग किया जाता शामिल हैं. युक्तियाँ और आम समस्याओं के लिए समाधान प्रदान कर रहे हैं.

यह एक बहुमुखी लेबलिंग तकनीक है कि उम्र के एक विस्तृत रेंज में कई जानवरों की प्रजातियों के लिए लागू किया जा सकता है. अन्य फ्लोरोसेंट लेबलिंग तकनीक है कि युवा जानवरों से तैयारी करने के लिए सीमित कर रहे हैं या चूहों को प्रतिबंधित क्योंकि वे एक फ्लोरोसेंट transgene अभिव्यक्ति पर भरोसा के विपरीत, DiOLISTIC लेबलिंग सभी उम्र, प्रजातियों और जीनोटाइप के जानवरों के लिए लागू किया जा सकता है और इसके साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है कक्षों की एक विशेष subpopulation की पहचान immunostaining. यहाँ हम और बढ़ाता dendrite शाखाओं में बंटी और वृक्ष के समान रीढ़ आकारिकी के उद्देश्य के साथ वयस्क चूहों वयस्क गैर मानव प्राइमेट से मस्तिष्क स्लाइसें में DiOLISTICS के लेबल न्यूरॉन्स उपयोग करने के लिए प्रदर्शित करता है.

Protocol

1. तैयारी / DiI टंगस्टन मनका बुलेट: DiI (1 1'-Dioctadecyl-3, 3,3 ', perchlorate 3'-tetramethylindocarbocyanine) गोलियों मस्तिष्क स्लाइसें काटने के अग्रिम में तैयार किया जाना चाहिए. प्रक्रिया कितने गोलियों एक बार में तैयार कर रहे हैं पर लगभग 2-4 घंटे के आधार लेता है.

  1. यदि टंगस्टन मोतियों के एक नए बैच से शुरू, प्रत्येक 300 मिलीग्राम की aliquots तैयार. Aliquots methylene क्लोराइड के 2 मिलीलीटर में टंगस्टन के 6 ग्राम निलंबित द्वारा तैयार कर रहे हैं. फिर, microfuge ट्यूबों में 100 मनका समाधान के μl विंदुक 300 मिलीग्राम टंगस्टन मोतियों की aliquots के उत्पादन के लिए कमरे के तापमान पर स्टोर aliquots (नोट: methylene क्लोराइड बहुत जल्दी evaporates शराब भी वाष्पीकरण कम से कम इस्तेमाल किया जा सकता है.) ..
  2. मोतियों की aliquots से शुरू, methylene क्लोराइड के 300 μl में प्रत्येक विभाज्य (300 मिलीग्राम टंगस्टन मोती) resuspend और वाष्पीकरण को रोकने के जल्दी कवर करने के लिए. गोलियों की यह मात्रा तीन बैचों के लिए पर्याप्त है.
  3. Lipophilic डाई DiI के 13.5 मिलीग्राम वजन और methylene क्लोराइड के 450 μl (अंतिम एकाग्रता 3mg/100μl =) जोड़ने के द्वारा डाई समाधान तैयार .
  4. डाई के साथ मोती कोट. के एक टुकड़े पर एक गिलास स्लाइड प्लेस स्लाइड पर मोम लेपित कागज और विंदुक मोतियों की 100 μl तौलना. DiI समाधान के 100 μl जोड़ें, मिश्रण अच्छी तरह से जब तक मोती प्रकाश ग्रे बारी पिपेट टिप, और शुष्क हवा का उपयोग कर.
  5. एक रेजर ब्लेड का उपयोग गिलास स्लाइड बंद मोती परिमार्जन और एक ठीक पाउडर में मोती पासा (नोट: एक नए ब्लेड का उपयोग करें यदि एक से अधिक रंग गोलियों इतनी के रूप में रंगों नहीं दूषित कर )..
  6. पर परिमार्जन मोती एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में कागज और कीप मोती तौलना. के 3 मिलीलीटर पानी जोड़ें और कमरे के तापमान पर 10-30 मिनट के लिए पानी के स्नान में sonicate (नोट: पाउडर और sonication के dicing लिपटे मोतियों है कि व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की विरल लेबलिंग को बाधित करेगा के clumps के गठन को कम करने के लिए लागू कर रहे हैं).

2. Polyvinylpyrrolidone (PVP) समाधान और टयूबिंग की तैयारी: बुलेट (TEZFEL टयूबिंग) टयूबिंग, यह कोट polyvinylpyrrolidone समाधान (PVP) के साथ मनका अनुलग्नक में सुधार.

  1. 10 मिलीग्राम PVP / एमएल के एक एकाग्रता में PVP समाधान के पानी में 10 मिलीलीटर की तैयारी.
  2. टयूबिंग अनुकूलक के साथ एक 12 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करें (थोड़ा बड़ा व्यास के साथ लचीला टयूबिंग) बुलेट टयूबिंग के माध्यम से PVP समाधान गुजरती हैं और फिर इसे दूसरे छोर निष्कासित. कोट अधिक बुलेट टयूबिंग समाधान पुन: उपयोग करना है अगर एक साथ कई बैचों तैयार हैं. उपयोग के बाद PVP समाधान त्यागें.
  3. बुलेट टयूबिंग मोती जोड़ने के लिए, भंवर एक समरूप समाधान उत्पादन और टयूबिंग के माध्यम से मनका समाधान खींच इतना है कि मोती को समान रूप से टयूबिंग भर वितरित कर रहे हैं सिरिंज का उपयोग करने के लिए मोती. ((नोट:) टयूबिंग में हवाई बुलबुले की संख्या को कम करने की कोशिश).
  4. फ़ीड प्रस्तुत करने का स्टेशन के माध्यम से टयूबिंग और मोतियों को व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं. धीरे पानी निकालने के लिए इतना है कि केवल मोतियों रहते सिरिंज का प्रयोग करें.
  5. प्रस्तुत करने का स्टेशन और नाइट्रोजन गैस के साथ सूखी में टयूबिंग स्पिन जब तक पानी की बूँदों अब दिखाई दे रहे हैं. इस कदम लगभग 10-20 मिनट ले जाएगा.
  6. 13 मिमी लंबाई और जगमगाहट Drierite या निर्जल कैल्शियम सल्फेट के कुछ प्रकार युक्त शीशियों में जगह में टयूबिंग कटर के साथ गोलियों का कट. लपेटें पन्नी में प्रकाश से बचाने शीशियों.

3. DiI धुंधला: यह लेबलिंग तकनीक विविध प्रजातियों से मस्तिष्क के ऊतकों में न्यूरॉन्स दाग इस्तेमाल किया जा सकता है, इस विशेष मामले में, (3-6 महीने) माउस और गैर मानव प्राइमेट (9-15 साल की उम्र) से.

यह बेहतर है कि स्लाइस तय मस्तिष्क लगानेवाला समाधान के transcardiac छिड़काव द्वारा प्राप्त ऊतकों से तैयार कर रहे हैं क्योंकि ऊतक संरक्षण के लिए इस शर्त के तहत सबसे अच्छा होने की उम्मीद है. हालांकि, छिड़काव द्वारा नियतन हमेशा संभव नहीं है (के रूप में बंदर के ऊतक के साथ मामला था) और DiOLISTIC लेबलिंग अभी भी सफलतापूर्वक ऊतक तैयारी के लिए विभिन्न प्रक्रियाओं के तहत लागू किया जा सकता है. यहाँ हम ऊतक तैयार करने के लिए तीन अलग अलग प्रक्रियाओं का वर्णन:

  1. Transcardiac छिड़काव द्वारा मस्तिष्क ठीक → 10 → मिनट कट टुकड़ा के लिए मस्तिष्क → postfix हटायें → दाग
  2. → मस्तिष्क ऊतक की कटौती ब्लॉक → तय ब्लॉक → पीबीएस → कटौती टुकड़ा में धो → दाग निकालें
  3. मस्तिष्क निकालें कट स्लाइसें तय → → → धोने → दाग

वर्तमान अध्ययन में, बंदर दिमाग विषय है कि बर्फ के ठंडे कृत्रिम मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी (ACSF) द्रव मस्तिष्क फसल से पहले और ऊतक के एक ब्लॉक पूंछवाला युक्त (4 मिमी मोटी) के साथ transcardially perfused थे से प्राप्त किया गयाएन डी putamen कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए तय की गई थी. सभी प्रक्रियाओं के लिए, लगानेवाला समाधान में 4% paraformaldehyde और पीबीएस (ताजा तैयार या 15 दिन के भीतर इस्तेमाल किया) में 4% sucrose शामिल हैं. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि निर्धारण बार सफल धुंधला के लिए महत्वपूर्ण हैं है. Overfixation प्लाज्मा झिल्ली की अखंडता में खलल न डालें और डाई के कारण सेल के बाहर रिसाव (परिणाम तहत और अधिक जानकारी देखने के) द्वारा धुंधला हो जाना प्रभावित कर सकते हैं.

  1. प्रक्रिया के लिए एक और ख, स्लाइस (200μm) से तय मस्तिष्क या ऊतक ब्लॉक और पीबीएस के साथ 24 अच्छी तरह से थाली में रखा स्लाइस काट रहे हैं. प्रक्रिया के लिए, ताजा तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें (200 सुक्ष्ममापी) ठंड काटने युक्त समाधान में एक vibratome (मिमी में) 110 Choline-सीएल, 3 25 NaHCO, 1.25 2 नाह 4 पीओ, KCl 2.5, 0.5 से 2 CaCl, 7 MgCl के साथ काट रहे हैं 2, 25 ग्लूकोज, 11.6 ascorbic एसिड, 3.1 Pyruvic एसिड (osmolarity = 310 mOsmols) स्लाइस तुरंत बाद और 24 अच्छी तरह प्लेटें में रखा जाता है और कमरे के तापमान पर लगानेवाला समाधान के साथ 30 मिनट के लिए तय .
  2. पीबीएस के साथ स्लाइस, 3 बार धोएं.
  3. शूटिंग स्लाइस से पहले, पीबीएस कुओं से हटाने और, एक तूलिका का प्रयोग, अच्छी तरह से केंद्र में टुकड़ा जगह है.
  4. DiI गोलियों 3.0 सुक्ष्ममापी फिल्टर नमूना और प्रति बैरल के अंत के बीच 1.5 सेमी की दूरी पर बंदूक रखकर 120-180 साई हीलियम गैस के दबाव में एक जीन Helios गन प्रणाली का उपयोग कर कागज के माध्यम से गोली मारो.
    (महत्वपूर्ण नोट: केवल टुकड़ा की सतह के 50 मिमी के भीतर न्यूरॉन्स इस विधि द्वारा लेबल किया जाएगा, इसलिए यह महत्वपूर्ण है washes के दौरान और बढ़ते के लिए ऊपर का सामना करना पड़ रहा टुकड़ा के एक ही पक्ष रखने के इस तरह, आप सुनिश्चित कर देगा कि लेबल न्यूरॉन्स फोकल दूरी के भीतर हो सकता है जब एक confocal खुर्दबीन के साथ इमेजिंग) .
  5. पीबीएस 3 बार के साथ स्लाइसें धो और उन्हें पीबीएस में कई घंटे के लिए DiI dendrites साथ प्रसार करने की अनुमति की दुकान.
  6. लम्बा गोल्ड Antifade साथ एक गिलास स्लाइड पर स्लाइस माउंट और एक 18X18 मिमी नंबर 1 coverslip साथ कवर. (नोट: प्रक्रिया ग के लिए, यह सबसे अच्छा है उसी दिन स्लाइस माउंट स्लाइस की अखंडता के रूप में अच्छी तरह से रातोंरात बनाए रखा नहीं है).
  7. बढ़ते मीडिया के बाद स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ सील सूख गया है.
  8. वैकल्पिक रूप से, स्लाइस बढ़ते के रूप में नीचे वर्णित से पहले एंटीबॉडी के साथ दाग जा सकती है.
    (नोट: स्लाइड्स कम से कम 6 महीने एक वर्ष के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अगर अंधेरे में संग्रहीत 4 बजे ° सी. DiI प्रकाश संवेदनशील और लंबे समय तक प्रकाश के लिए जोखिम है दाग के कारण फीका करना होगा ).

4. एंटीबॉडी धुंधला: Immunostaining 3.4 कदम के बाद और बढ़ते से पहले किया जाना चाहिए .

  1. Permeabilization: 0.01% में सेते स्लाइस ट्राइटन पीबीएस समाधान में कमरे के तापमान पर 15 मिनट (अच्छी तरह से प्रति 300-500 μl) के लिए X-100 .
    नोट: डिटर्जेंट के उच्च सांद्रता का उपयोग के रूप में इस DiI भंग करने और काफी फ्लोरोसेंट धुंधला हो जाना कम हो जाएगा मत करो . डिटर्जेंट में समय कम से कम के रूप में व्यापक incubations भी DiI लेबलिंग कम हो जाएगा की कोशिश करो. यदि विस्तारित incubations आवश्यक हैं, पीबीएस में स्लाइस समाधान अवरुद्ध में रखने के बजाय .
  2. अवरुद्ध: 10% बकरी सीरम युक्त समाधान रोकने में सेते स्लाइस, 0.01% ट्राइटन पीबीएस में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए X-100 .
  3. प्राथमिक एंटीबॉडी अवरुद्ध समाधान (1:1000 कमजोर पड़ने पर खरगोश जैसे विरोधी GFP एंटीबॉडी) में वांछित कमजोर पड़ने पर एंटीबॉडी जोड़ें. 300-500 μl प्रति अच्छी तरह से जोड़ें और 1-2 घंटे के लिए सेते हैं. (नोट: अगर रातोंरात incubations आवश्यक हैं, समाधान अवरुद्ध से डिटर्जेंट निकालने के लिए).
  4. 5 के लिए धो PBS के साथ स्लाइस - 15 मिनट, 3 बार.
  5. माध्यमिक एंटीबॉडी: कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं. अवरुद्ध समाधान में वांछित कमजोर पड़ने (जैसे Alexa Fluor 488 1:1000 कमजोर पड़ने पर संयुग्मित एंटीबॉडी) पर माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार है.
  6. पीबीएस के साथ 5-15 मिनट, 4 बार के लिए स्लाइस धो लें.
  7. गोल्ड Antifade लम्बा और एक 18x18 मिमी नंबर 1 coverslip के साथ कवर के साथ स्लाइड्स पर स्लाइस माउंट. नेल पॉलिश के साथ बढ़ते मीडिया के बाद सील सूख गया है.

5. प्रतिनिधि परिणाम:

  1. सही लेबलिंग के लिए जाँच: एक फ्लोरोसेंट विदारक पारा दीपक और लाल फ्लोरोसेंट फिल्टर क्यूब सफल DiOLISTIC लेबलिंग की पुष्टि के साथ सुसज्जित गुंजाइश के तहत धारा visualized किया जा सकता है. चित्रा 1 में अच्छी तरह से लेबल मस्तिष्क कम बढ़ाई प्राप्त वर्गों के अनुकरणीय छवियों से पता चलता है. दो महत्वपूर्ण विशेषताओं को देखने के लिए एक विरल लेबलिंग (चित्रा 1 ए) पैटर्न और व्यक्तिगत सेलुलर घटक (चित्रा 1B - सी) की पहचान करने की क्षमता हैं. समस्या निवारण DiOLISTIC लेबलिंग: चित्रा 2 वर्गों के उदाहरण है जिसमें DiOLISTIC लेबलिंग गलत तरीके से काम से पता चलता है. हमारे अनुभव में, वहाँ अक्षम लेबलिंग के लिए तीन मुख्य कारण हैं:
    • लेबल भी विरल या सघन है: बहुत कुछ कोशिकाओं अनुभाग प्रति एक मामले में चिह्नित कर रहे हैं या बहुत अधिक सेल अलगाव और एकल सेलुलर तत्वों के अध्ययन को रोकने के लिए चिह्नित कर रहे हैं. समाधान: अंतिम TEFZEL बुलेट टयूबिंग (1.6 अनुभाग) कोटिंग के लिए प्रयोग किया जाता समाधान में लिपटे मोतियों की एकाग्रता को समायोजित. घटाएँ या पानी मोती भंग के क्रम में भी विरल है या बहुत घने लेबलिंग के लिए सही करने के लिए इस्तेमाल किया (3 मिलीलीटर प्रारंभिक मूल्य) की मात्रा में वृद्धि, क्रमशः. इसके अलावा, लेबलिंग कम क्षमता इष्टतम गैस के दबाव से कम कारण हो सकता है जब वर्गों पर लिपटे मोतियों की शूटिंग. इस संभावना को यकीन है कि TEFZEL बुलेट टयूबिंग लिपटे मोतियों के सबसे जारी किया गया है और शूटिंग के बाद यह स्पष्ट प्रतीत होता है है बनाने की संभावना से इनकार कर सकते हैं. अन्यथा, शूटिंग के लिए गैस के दबाव बढ़ाया जाना चाहिए.
    • बुरा बुलेट्स बुलेट की तैयारी के दौरान बड़े clumps या डाई लेपित टंगस्टन मोती के समूहों का गठन कर रहे हैं. धारा 2A बी चित्रा में उदाहरण समान होगा. समाधान: नए 1.5 और / अनुभाग के लिए विशेष ध्यान दे गोलियों बनाने या 1.6 अनुभाग में sonication समय का विस्तार.
    • ओवर - निर्धारण: ऊतक paraformaldehyde समाधान में फिक्सिंग (200-300 सुक्ष्ममापी वर्गों के लिए 30 मिनट, 1 घंटे 4 मिमी वर्गों के लिए) के लिए बेहतर समय की आवश्यकता की तुलना में समय के लिए रखा जाता है. यह प्लाज्मा झिल्ली की अखंडता समझौता और लेबल वर्गों है कि चित्रा -2 सी - डी में दिखाए गए उन में जो लेबलिंग ध्यान से बाहर लगता है डाई की कोशिकाओं के बाहर फैलाव के कारण की तरह लग पैदा करता है. हल: निर्धारण के समय को कम.
  2. Confocal इमेजिंग: छवि के ढेर पूरे सेल के लिए और dendrite क्षेत्रों के लिए 63x पानी विसर्जन उद्देश्य एक 20x उद्देश्य के साथ एक confocal खुर्दबीन (मेटा Zeiss LSM 510) का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं. DiI माध्यमिक एंटीबॉडी से एक डीपीएस 561 एनएम लेजर लाइन और हरी प्रतिदीप्ति का उपयोग किया गया था एक 488 एनएम लेजर लाइन का उपयोग कर उत्साहित उत्साहित किया गया था. लेबल हासिल की जब confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर नमूने के ऑप्टिकल सेक्शनिंग आगे एकल लेबल कोशिकाओं के नमूने में अलगाव के लिए अनुमति देता है. चित्रा 3A माउस मस्तिष्क और इसकी जटिल dendrite शाखा पैटर्न से striatal मध्यम काँटेदार न्यूरॉन से पता चलता है. (3B चित्रा) कृंतक और गैर मानव प्राइमेट (चित्रा 3C) से इन न्यूरॉन्स की dendrite शाखाओं के उच्च बढ़ाई छवियों dendrites और वृक्ष के समान spines दोनों प्रजातियों में इस तकनीक का उपयोग करने में धुंधला की डिग्री को प्रदर्शित करता है. Dendrites और उनके protrusions (कांटा) को अच्छी तरह से परिभाषित दिखाई देते हैं जब भी लंबे, पतले रीढ़ मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स में प्रचुर मात्रा में सिर पर विचार.

    जब immunostaining के साथ DiOLISTICS संयुक्त, confocal इमेजिंग भी स्पष्ट ही फोकल हवाई जहाज़ और एक ही कक्ष में दाग localizing में मददगार है. चित्रा 4 DiI लेबलिंग और GFP के लिए किसी एकल कक्ष में immunostaining colocalization का एक उदाहरण दिखाता है. छवि एक ढेर (0.7 सुक्ष्ममापी z-अनुभाग) एक ट्रांसजेनिक माउस व्यक्त D1 dopamine रिसेप्टर प्रमोटर के तहत फ्लोरोसेंट प्रोटीन GFP से striatal टुकड़ा से प्राप्त है.

चित्रा 1
चित्रा 1. DiI गैर मानव प्राइमेट से मस्तिष्क स्लाइसें में न्यूरॉन्स की लेबलिंग. (ए) एक cynomolgus बंदर है कि DiI साथ न्यूरॉन्स की विरल लेबलिंग दिखाता है पूंछवाला नाभिक से युक्त एक दाग मस्तिष्क टुकड़ा के कम बढ़ाई छवि (ई.पू.) पृथक मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स आसानी से एक फ्लोरोसेंट विदारक गुंजाइश का उपयोग कर पहचाना जा सकता है.

चित्रा 2
चित्रा 2 समस्या निवारण DiOLISTIC लेबलिंग. (एबी) बंदर के पृष्ठीय striatum (ए) और माउस से सना हुआ स्लाइस (बी) डाई लिपटे मोतियों के बड़े clumps दिखा रहा है और एक परिणाम के रूप में, कोई व्यक्ति सेलुलर तत्वों प्रतिष्ठित किया जा सकता है छवियाँ (सीडी). DiOLISTIC लागू करने के परिणाम उदाहरण देना वर्गों है कि समय या जहां ऊतक संरक्षण की लंबी अवधि के के लिए लगानेवाला समाधान में रखा गया था लेबलिंग बंदर (सी) और माउस ऊतक (डी) में विफल रहा.

चित्रा 3
चित्रा 3 striatal मध्यम काँटेदार न्यूरॉन के Confocal छवि DiI के साथ दाग. (ए), एक पूरे सेल की छवि ढेर वृक्ष के समान शाखाओं के morphological विश्लेषण के लिए अनुमति देता है (ई.पू.) dendrite क्षेत्रों माउस से (बी) और बंदर (सी) मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स dendrite और कांटा के स्पष्ट लेबलिंग दिखा.

चित्रा 4
चित्रा 4. Immunostaining साथ DiOLISTIC लेबलिंग का मेल . (ए) DiI लेबल न्यूरॉन (बी) विरोधी GFP एंटीबॉडी का उपयोग कर के रूप में ली एट अल से अनुकूलित तरीकों द्वारा वर्णित Immunostaining. (2006). ए (सी) लाल और हरे रंग प्रतिदीप्ति के समग्र छवि के रूप में समान क्षेत्र GFP पॉजिटिव न्यूरॉन के रूप में DiI - लेबल न्यूरॉन को पहचानती है.

Discussion

DiOLISTIC लेबलिंग fluorescently लेबलिंग कोशिकाओं के लिए सबसे बहुमुखी उपलब्ध तकनीकों में से एक है क्योंकि यह विभिन्न प्रजातियों से ऊतक वर्गों के लिए लागू किया जा सकता है, उम्र की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए, और ऊतकों को ताजा या लगानेवाला perfused पशुओं से प्राप्त ( गण मन एट अल , 2009). प्रक्रिया अपेक्षाकृत तेजी से है के रूप में यह 1-2 दिन लगते हैं और यह immunostaining (ली एट अल., 2006) जैसे अन्य अधिक शास्त्रीय लेबलिंग दृष्टिकोण के साथ संयुक्त किया जा सकता है. विशेष ध्यान फिक्सिंग और ऊष्मायन समाधान में उच्च डिटर्जेंट सांद्रता का उपयोग अधिक से बचने के लिए भुगतान किया जाना चाहिए है क्योंकि इन lipophilic झिल्ली की अखंडता शामिल है और डाई कोशिकाओं के बाहर रिसाव के कारण होगा. एंटीबॉडी प्रवेश की कम मात्रा द्वारा मदद की जा सकती है Triton एक्स 100 (ली एट अल., 2006) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से digitonin या ऊष्मायन समाधान में सैपोनिन (Matsubayashi एट अल. 2008) . कुछ संशोधनों कि इस तकनीक को लागू किया जा सकता है एकाधिक गण मन एट अल (2000) या एंटीबॉडी जोखिम (नीली एट अल, 2009) की लंबाई और प्रकार बदलने के द्वारा वर्णित के रूप में रंगों के साथ गोलियों का उपयोग शामिल है.

परंपरागत रूप से, DiI मस्तिष्क में neuronal अनुमानों को ट्रेस करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. DiOLISTIC लेबलिंग एक सेल आकारिकी की जांच करने के लिए उपयोगी विधि का वर्णन करके अपने आवेदन का विस्तार है. Neuronal morphology बड़े मस्तिष्क और अटकलें हैं कि सेल आकार तंत्रिका तंत्र में neuronal आबादी के समारोह बहुलता पर प्रतिबिंबित हो सकता है में पाया विविधता की वजह से ब्याज की एक महान है. इस का एक उदाहरण तथ्य यह है कि स्तनधारी तंत्रिका तंत्र प्रदर्शन छोटे फलाव में कई न्यूरॉन्स वृक्ष के समान spines कि glutamatergic synapses के साइट रहे हैं बुलाया है. इस रास्ते में, किसी कक्ष पर glutamatergic synapses के घनत्व वृक्ष के समान spines के घनत्व, जो लेबलिंग तकनीक के साथ साथ वर्णित का उपयोग करके मापा जा सकता है के लिए सहसंबद्ध किया जा सकता है. इसके अलावा, dendrite कुल लंबाई, शाखाओं में बंटी पैटर्न, वृक्ष के समान रीढ़ की हड्डी आकार और घनत्व के रूप में इस तरह के अन्य morphological मापदंडों और मात्रा निर्धारित किया जा सकता है है अध्ययन.

neuronal आकारिकी अध्ययन के लिए फ्लोरोसेंट लेबलिंग का उपयोग कई फायदे हैं जब अधिक परंपरागत तकनीक है कि उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी (जैसे Golgi धुंधला) पर भरोसा करने के लिए तुलना में है क्योंकि यह उच्च संकल्प इमेजिंग confocal के लिए अनुमति देता है. वृक्ष के समान रीढ़ घनत्व को मापने के उद्देश्य से प्रयोगों में एक fluorophore के रूप में DiI का उपयोग और आकारिकी का एक अन्य लाभ अपनी lipophilic गुण है. प्लाज्मा झिल्ली में DiI विभाजन और neuronal प्रक्रियाओं और वृक्ष के समान protrusions की एक अच्छी तरह से परिभाषित रूपरेखा प्रदान करता है. सबसे वृक्ष के समान spines (1 से कम femtoliter) की छोटी मात्रा को देखते हुए, झिल्ली धुंधला हो जाना और अधिक कुशल है और cytoplasmic धुंधला की तुलना में छोटे, पतले protrusions के बेहतर दृश्य के लिए अनुमति देता है.

Disclosures

सभी पशु की प्रक्रिया पशु और NIAAA और ओरेगन नेशनल प्राइमेट रिसर्च सेंटर में उपयोग समिति की देखभाल से मार्गदर्शन के बाद प्रदर्शन किया गया. लेखकों खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgements

हम उनकी सहायता के लिए तकनीक और उनके confocal खुर्दबीन उपयोग के लिए डा. Fumi ओनो प्रयोगशाला के प्रारंभिक सेट अप के दौरान माइकल Feyder और Terrell होलोवे स्वीकार करते हैं करना चाहते हैं. इस शोध NIAAA और NINDS के अंदर कार्यक्रम के माध्यम से स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा वित्त पोषित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’- tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate (DiI) Invitrogen D-282
Methylene chloride Mallinckrodt Baker Inc. H485-06
Tungsten beads Bio-Rad 165-2269 1.7 μm diameter
Polyvinylpyrrolidone Calbiochem 529504
Tefzel bullet tubing Bio-Rad 165-2441
Tubing cutter Bio-Rad 165-2422
Helios Gene Gun Bio-Rad 165-2431
Isopore membrane filter paper EMD Millipore TSTP02500 3.0 μm pore size
ProLong Gold Antifade Invitrogen P36930
Paraformaldehyde Alfa Aesar 30525-89-4 (16% w/v)

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References

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