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दो thymidine analogues के Immunofluorescent प्राथमिक ऊतक में (CldU और IDU) डिटेक्शन

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Biology
 

Summary

हम एक वयस्क चूहों के ऊतकों में कोशिका विभाजन के लगातार दो राउंड यों thymidine analogues के अनुक्रमिक निगमन (CldU और IDU) का पता लगाने के लिए रणनीति निकाली गई है. यह रणनीति लंबे समय रहते ऊतकों की कोशिका कारोबार oncogenic परिवर्तन, या पारगमन amplifying कोशिकाओं का पता लगाने के लिए उपयोगी है.

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Tuttle, A. H., Rankin, M. M., Teta, M., Sartori, D. J., Stein, G. M., Kim, G. J., Virgilio, C., Granger, A., Zhou, D., Long, S. H., Schiffman, A. B., Kushner, J. A. Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue. J. Vis. Exp. (46), e2166, doi:10.3791/2166 (2010).

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Abstract

कोशिका विभाजन के सटीक माप प्रायोगिक जीव विज्ञान में एक मौलिक चुनौती है कि तेजी से जटिल है जब धीरे धीरे कोशिकाओं को विभाजित विश्लेषण कर रहे हैं हो जाता है. स्थापित करने के लिए कोशिका विभाजन का पता लगाने के तरीकों सेल संस्कृति, carboxyfluorescein di-aetate succinimidyl (CFSE) एस्टर, जैसे ki67 या PCNA mitogenic प्रतिजनों के इम्युनो - पता लगाने जैसे महत्वपूर्ण रंगों के कमजोर पड़ने, और thymidine analogues में निरंतर माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रत्यक्ष दृश्य शामिल हैं. Thymidine analogues tritiated thymidine, इम्युनो - ब्रोमो (BrdU) deoxyuridine, क्लोरोफ्लूरोकार्बन deoxyuridine (CldU) और iodo deoxyuridine (IDU) के लिए पता लगाने और ethinyl - deoxyuridine के लिए रासायनिक पता लगाने के लिए रेडियो का पता लगाने सहित तरीकों की एक किस्म के द्वारा पता लगाया जा सकता है (EDU). हम एक वयस्क चूहों के ऊतकों में अलग thymidine analogues के अनुक्रमिक निगमन (CldU और IDU) का पता लगाने की रणनीति निकाली गई है. हमारे विधि जांचकर्ताओं सही कोशिका विभाजन के लगातार दो दौर मात्रा ठहराना करने के लिए अनुमति देता है. Immunostaining अनुकूलन प्रोटोकॉल करके हमारे दृष्टिकोण बहुत कम खुराक thymidine analogues के पीने के पानी, सुरक्षित के माध्यम से प्रशासित करने के लिए समय की लंबी अवधि के लिए चूहों के लिए प्रशासन का पता लगा सकते हैं. नतीजतन, हमारी तकनीक बहुत लंबे समय रहते ऊतकों में कोशिका कारोबार का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इष्टतम immunofluoresent धुंधला परिणाम अग्न्याशय, त्वचा, पेट, यकृत, अधिवृक्क, वृषण, अंडाशय, थायराइड, लिम्फ नोड, और मस्तिष्क सहित कई प्रकार के ऊतकों में प्राप्त किया जा सकता है. हम भी इस तकनीक को लागू किया है ऊतकों के भीतर oncogenic परिवर्तन की पहचान. हम आगे इस तकनीक लागू करने के लिए निर्धारित करती है कि पारगमन-amplifying कोशिकाओं या ऊतकों के विकास और नवीकरण के लिए योगदान दिया है. इस अर्थ में, thymidine analogues के अनुक्रमिक प्रशासन और ऊतक homeostasis में शामिल कोशिकाओं के मूल अस्तित्व के अध्ययन के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है.

Protocol

1. CldU और IDU के साथ लेबल ऊतकों

  1. Thymidine analogues के (CldU या IDU) पानी में भंग. प्रत्येक रसायन के 1mg / एमएल वजन और जोड़ने आसुत जल की कांच की बोतलें अलग. हम आम तौर पर एक समय में प्रत्येक के 1 लीटर तैयार करते हैं.
  2. हलचल प्लेट या आंदोलनकारी के अन्य फार्म पर रसायनों का भंग. CldU 10 मिनट में भंग होगा. कमरे के तापमान पर आंदोलन. IDU 37 में आंदोलन के एक घंटे ° सी एक प्रकार के बरतन में से अधिक की आवश्यकता है. जल स्रोतों को IDU विलेयता को प्रभावित कर सकते हैं. यदि IDU रातोंरात मिलाते बाद बहाल रहता है, पानी की एक क्लीनर स्रोत का प्रयास करें. समाधान 4 ° C अंधेरे में संग्रहीत हैं.
  3. पहली thymidine युक्त वांछित लेबलिंग अवधि के लिए चूहों समाधान प्रशासन (या तो CldU या IDU). चूहों लेबल की अवधि के दौरान unlabeled पानी के लिए उपयोग किया है करने की अनुमति नहीं है. जब नामित लेबलिंग अवधि के पूरा हो गया है, कम से कम 24 घंटे के लिए unlabeled पानी के साथ एक वार्शआउट शुरू (thymidine युक्त analogues कई घंटे की सीरम आधा जीवन है). दूसरा thymidine युक्त वांछित लेबलिंग अवधि के लिए चूहों समाधान प्रशासन (या तो CldU या IDU). फिर से भरना पानी की बोतलें नियमित रूप से निर्जलीकरण को रोकने के लिए!
  4. वैकल्पिक रूप से, चूहों और फिर CdlU IDU के अनुक्रमिक intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा लेबल किया जा सकता है. 10mg / एमएल एकाग्रता पर CldU या IDU तैयार. IDU केंद्रित सोडियम हीड्राकसीड बाद जोरदार झटकों से समाधान के निलंबन में जाने के अलावा ड्रॉप वार की आवश्यकता हो सकती है. अतिरिक्त सोडियम हीड्राकसीड जोड़ने मत करो. सोडियम हीड्राकसीड के एक IDU के 10 एमएल समाधान के लिए ड्रॉप 37 आंदोलन के एक घंटे के द्वारा पीछा किया ° सी एक प्रकार के बरतन में जोड़ें. समाधान में यदि नहीं, सोडियम हीड्राकसीड के अलावा दोहराएँ. Intraperitoneal अंतरिक्ष में जी शरीर के वजन के प्रति 100mcg इंजेक्षन.
  5. नियंत्रण स्लाइड्स इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक हैं. एक परिणाम के रूप में, हम दृढ़ता से सुझाव है कि जांचकर्ताओं thymidine एनालॉग लेबलिंग के कई रूपों ले जाने के लिए संवेदनशीलता और विशिष्टता को सुनिश्चित करने. ये 1 शामिल होना चाहिए. चूहे कि केवल CldU साथ लेबल रहे थे, 2. चूहों कि केवल IDU के साथ लेबल रहे थे, 3. चूहों कि sequentially CldU और तब IDU के साथ लेबल रहे थे, 4. चूहे कि sequentially रिवर्स क्रम में लेबल थे, IDU और तब CldU के साथ पहली बार, 5 चूहे कि केवल पानी के साथ लेबल नकली हैं. जब CldU और IDU के साथ लेबल के लिए सीखने के लिए, जांचकर्ताओं हमेशा बाहर सभी 5 हित के ऊतकों से नियंत्रण स्लाइड के ऊपर सेट के साथ पूरे प्रोटोकॉल ले.

2. टिशू हार्वेस्ट, फिक्सेशन, और स्लाइड तैयार

  1. उपयुक्त चतनाशून्य करनेवाली औषधि का प्रयोग, घातक अधिक मात्रा प्रदर्शन और फिर exsanguination के माध्यम से माउस बलिदान. ताजा ऊतक निकालें और 24 घंटे के लिए 4 में 4% paraformalehyde ° सी के साथ ठीक है. 01:04 formalin बफर और 4 बजे दुकान ° C embedding के लिए ऊतक स्थानांतरण.
  2. वैकल्पिक रूप से, घातक अधिक मात्रा प्रदर्शन और फिर नमकीन घोल के साथ छोड़ दिया हृदय वेंट्रिकल के माध्यम से माउस perfuse जब तक रक्त शरीर से मंजूरी दे दी है, तो तुरंत 4% paraformaldehyde के 30-50 सीसी के साथ perfuse. 4 ° C में embedding के लिए और 01:04 Formalin बफर में ब्याज की दुकान के ऊतकों निकालें.
  3. ऊतक निर्जलीकरण और आयल एम्बेडिंग के बाद, 5 माइक्रोन ऊतक वर्गों और चार्ज स्लाइड्स पर जगह काटा. 65 में स्लाइड्स सेंकना डिग्री सेल्सियस 16 घंटे के लिए ऊतक के आसंजन के लिए स्लाइड सुनिश्चित करने के लिए (नीचे प्रतिजन पुनर्प्राप्ति कदम के साथ आवश्यक).

3. निर्जलीकरण, Permeabilization एंटीजन, और रिट्रीवल

  1. 5 मिनट के लिए दो xylene स्नान में स्लाइड्स डुबो कर अतिरिक्त आयल निकालें. प्रत्येक.
  2. 100, 95, 90, 80 70 और 50% इथेनॉल में स्लाइड्स पानी से पतला डुबो कर ऊतक rehydrate. स्लाइड्स 3 मिनट के लिए भिगोएँ. प्रत्येक एकाग्रता में, 100% के साथ शुरू करने और अंतिम विसर्जन के लिए 50% की दिशा में जा रहा है.
  3. 5 मिनट के लिए स्लाइड्स को धो लें. 1x पीबीएस में.
  4. 5 मिनट (ताजा हर समय बना) के लिए 0.2% ट्राइटन एक्स समाधान में स्लाइड्स डुबो द्वारा कोशिकाओं Permeabilize.
  5. माइक्रोवेव ऊतक प्रतिजन पुनर्प्राप्ति के लिए स्लाइड तैयार करें. एक गिलास बीकर में स्लाइड्स पर्याप्त मात्रा 0.01M पीएच 6.0 सोडियम साइट्रेट बफर के साथ प्लेस, ताकि समाधान खाते में 5 बाष्पीकरणीय घटाने के लिए स्लाइड के शीर्ष के ऊपर सेमी शामिल है.
  6. माइक्रोवेव स्लाइड जब तक समाधान उबल रहा है (पूर्ण सत्ता में 3-10 मिनट). शक्ति को कम जब तक समाधान धीरे धीरे गर्म है (10-80%) और एक अतिरिक्त 20 मिनट के लिए जारी है. माइक्रोवेव समय - समय पर जाँच करने के लिए सुनिश्चित समाधान एक धीमी गति से उबाल पर रहता है.
  7. प्लेस बीकर एक बेंच शीर्ष पर स्लाइड्स युक्त और धीरे कमरे के तापमान (लगभग 2 घंटे) करने के लिए शांत अनुमति देते हैं.
  8. पुष्टि करें कि स्लाइड एक थर्मामीटर का उपयोग कर कमरे के तापमान पर हैं.
  9. 40 मिनट के लिए 1.5N एचसीएल में विसर्जित स्लाइड. कमरे के तापमान पर.
  10. धो 1X Pbs, 5 मिनट में दो बार स्लाइड. धोने के प्रति.

4. प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी

  1. यह महत्वपूर्ण है कि स्लाइड्स पूरे प्रोटोकॉल के माध्यम से बहुत नम रहते हैं. सूखी ऊतक बहुत अधिक ऑटोप्रतिदीप्ति, जिसके परिणामस्वरूप छवियों अनुपयोगी बना. करने के लिए मर रहा है, एक समय में इस प्रक्रिया को एक स्लाइड को रोकने के.
  2. सर्किल एक कलम (यानी, मोम) को अवरुद्ध तरल के साथ स्लाइड्स पर प्रत्येक अनुभाग. 1x पीबीएस के कंटेनर में स्लाइड्स वापस प्लेस.
  3. गीला कागज तौलिये रखकर एक airtight प्लास्टिक के कंटेनर के तल पर एक नम ऊष्मायन चैम्बर फ्लैट रखी.
  4. 10% गधा सीरम 1x पीबीएस में पतला के अवरुद्ध समाधान करें. यह पूरी तरह से समाधान के साथ प्रत्येक अनुभाग को कवर करने के लिए महत्वपूर्ण है. ऊतक वर्गों है कि एक एक्स 1.5 सेंटीमीटर के लिए, अनुभाग प्रति समाधान के 50 माइक्रो लीटर का एक मात्रा के लिए पर्याप्त है.
  5. अवरुद्ध स्लाइड्स के लिए समाधान जोड़ें. 1x पीबीएस से स्लाइड निकालें और धीरे सूखी कागज तौलिए के एक ढेर पर स्लाइड बढ़त दोहन द्वारा अतिरिक्त तरल खत्म. ऊष्मायन कक्ष में रखें स्लाइड और प्रत्येक अनुभाग के लिए 50 10% ब्लॉक समाधान के सूक्ष्म लीटर जोड़ें. जब सभी स्लाइड्स करीब कंटेनर और 1 घंटे के लिए सेते कमरे के तापमान पर पूरा कर रहे हैं.
  6. प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने तैयार IDU का पता लगाने. 5% गधा सीरम में 1:250 एकाग्रता 1x पीबीएस में बनाया पर विरोधी BrdU माउस पतला. बंद स्लाइड से ब्लॉक समाधान ठोकर और ऊष्मायन कक्ष में वापस जगह है. प्रत्येक अनुभाग के लिए ऊपर प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें और 4 में रात भर सेते डिग्री सेल्सियस
  7. उच्च तंगी धोने (जो माउस विरोधी BrdU CldU antisera के द्वारा बाध्यकारी कम से कम) तैयार करें. नए सिरे से कम नमक TBST बफर करें (Tris 36mm, 50mm NaCl, 0.5% के बीच - 20, पीएच 8.0). आप स्लाइड्स की जोड़ी प्रति बफर के 40 एमएल की आवश्यकता होगी. प्रत्येक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब बफर के 40 एमएल जोड़ें. इससे पहले स्लाइड्स जोड़ने, पहले से गरम 37 का हल डिग्री सेल्सियस
  8. एक समय में दो, ऊष्मायन कक्ष से स्लाइड्स निकालने के लिए, उन्हें वापस से वापस जगह (ताकि ऊतकों के नमूनों को एक दूसरे से दूर चेहरा) और से अतिरिक्त प्राथमिक एंटीबॉडी नल. कम नमक TBST और कवर से भरा ट्यूबों में स्लाइड्स रखें. 20 मिनट के लिए ट्यूबों आंदोलन. एक जीवाणु संस्कृति इनक्यूबेटर मिलाते तापमान के साथ 37 डिग्री सेल्सियस, और 225 rpm के लिए सेट गति में.
  9. स्लाइड ताजा 1X पीबीएस में दो बार धोएं. 5 मिनट. धोने के प्रति.
  10. CldU और ऊतक प्रतिजन का पता लगाने के के लिए अगले प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार है, अगर वांछित. 5% गधा सीरम में 1:250 एकाग्रता 1x पीबीएस में बनाया पर विरोधी BrdU चूहे पतला. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में एकाग्रता काम में ऊतक प्रतिजन के खिलाफ प्राथमिक antisera पतला.
  11. अतिरिक्त 1x पीबीएस ठोकर से स्लाइड्स की, और उन्हें ऊष्मायन कक्ष में जगह है. प्रत्येक अनुभाग के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें और 4 में रात भर सेते डिग्री सेल्सियस
  12. स्लाइड ताजा 1X पीबीएस में दो बार धोएं. 5 मिनट. धोने के प्रति.
  13. माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार है. Cy2 गधा विरोधी चूहे 1:250 और Cy5 गधा विरोधी माउस 1:500 एक 1X पीबीएस 5% गधा सीरम युक्त समाधान में पतला. Cy3 ऊतक प्रतिजन antisera के प्राथमिक प्रजातियों का पता लगाने के लिए माध्यमिक जोड़ें. इसके अलावा, DAPI के एक शेयर 0.4mg / एमएल माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान में 1:150 का हल पतला.
  14. ऊष्मायन कक्ष में अतिरिक्त 1X पीबीएस बंद स्लाइड और जगह ठोकर. प्रत्येक अनुभाग के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.
  15. स्लाइड ताजा 1X पीबीएस में दो बार धोएं. 5 मिनट. धोने के प्रति.
  16. स्लाइड्स की अधिक 1X बंद पीबीएस ठोकर और कवर के साथ गोल्ड विरोधी फीका बढ़ते मीडिया (dyanine रंगों के साथ प्रयोग Vectashield नहीं करते!) लम्बा गिलास पालन. कवर फिसल जाता है पर प्रेस हवाई बुलबुले को खत्म करने के लिए. 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस

5. इमेजिंग और विश्लेषण

  1. ब्याज के ऊतकों छवि एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के साथ एक उच्च ऊर्जा प्रकाश स्रोत, उद्देश्यों की योजना apochromatic, और एक उच्च दक्षता खुर्दबीन कैमरा (जैसे हमामात्सू Orca ईआर) के साथ सुसज्जित. AMCA (DAPI), Cy2 (CldU), Cy3 (ऊतक प्रतिजन), और Cy5 चैनल (IDU) में छवियों पर कब्जा. बहु परत एक एकल छवि फ़ाइल बनाने के लिए छवियों को मर्ज.
  2. यदि सही ढंग से प्रदर्शन किया, DAPI दाग नाभिक homogeneously उज्ज्वल हो जाएगा. ऊतक प्रतिजन (जैसे इंसुलिन) ब्याज की कोशिकाओं को उजागर करना चाहिए. यदि DAPI या ऊतक प्रतिजन के साथ धुंधला हो जाना कमजोर या असंगत है, 1X रातोंरात पीबीएस में विसर्जित स्लाइड को कवर पर्ची हटाने और माध्यमिक antisera के आवेदन दोहराने है.
  3. Cy3 में ऊतक प्रतिजन पर ध्यान दें. CldU और Cy2 और Cy5 चैनलों में IDU धुंधला हो जाना, चैनलों के बीच toggling की जाँच करें. मार्करों, के रूप में अत्यधिक IDU और सह - धनात्मकता CldU द्वारा संकेत के बीच संभावित पार जेट के लिए देखो. ऊतकों कि केवल CldU या IDU होते हैं के लिए देखो. CldU या IDU सकारात्मक नाभिक के अभाव लेबलिंग या धुंधला के साथ एक तकनीकी समस्या का संकेत हो सकता है. इस मामले में, एक अत्यधिक replicative ऊतक (जैसे लसीका नोड) के लिए देखो.
  4. छवियों का विश्लेषण. DAPI और ऊतक प्रतिजन युक्त परतों प्रदर्शित. प्रमुख हाथ में एक सफेद बोर्ड मार्कर और गैर प्रमुख हाथ में एक सेल काउंटर का उपयोग, प्रत्येक नाभिक एक सूखी मिटा मार्कर (उर्फ सफेद बोर्ड मार्कर) के साथ एक विषम निशान के साथ चिह्नित. हित के ऊतक के भीतर DAPI सकारात्मक कोशिकाओं की गिनती. कुल सेल गिनती रिकार्ड. एक सूखी रबड़ के निशान हटाने का उपयोग करें. प्रदर्शन परतयुक्त DAPI, ऊतक प्रतिजन, और CldU. हित के ऊतक के भीतर CldU सकारात्मक कोशिकाओं की गिनती. कीर्तिमान CldU सेल गिनती लेकिन निशान मिटा नहीं है. बदलें ऊतक प्रतिजन, CldU, और IDU युक्त परतों कल्पना प्रदर्शन. गणना CldU IDU डबल सकारात्मक कोशिकाओं. रिकॉर्ड मूल्य पर, सभी निशान मिटा, और परतों से युक्त DAPI, ऊतक प्रतिजन, और IDU प्रदर्शित. हित के ऊतक के भीतर IDU सकारात्मक कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना. कीर्तिमान IDU सेल गिनती.

6. प्रतिनिधि परिणाम

हम क्रमिक रूप से तत्काल बलिदान के बाद दो सप्ताह, के लिए CldU के साथ 6 सप्ताह पुरानी मादा चूहों के एक सप्ताह और फिर IDU के लिए लेबल. Pancreata CldU, IDU, और इंसुलिन (एक ऊतक प्रतिजन), के रूप में के रूप में अच्छी तरह से DAPI का पता लगाने के दाग थे. Islets समान रूप से इंसुलिन के साथ दाग थे. CldU दाग नाभिक IDU दाग नाभिक (चित्रा 2) से अलग थे. आइलेट के बाहर कई नाभिक CldU सह सकारात्मक IDU (चित्रा 2, नीचे सही, सफेद तीर) थे. एक एकल इंसुलिन सकारात्मक सेल दोनों CldU और IDU (चित्रा 2, नीचे सही, मैजंटा तीर) के लिए परमाणु धुंधला हो जाना था.

चूहे. फिलाडेल्फिया के बच्चों के अस्पताल के IACUC समिति के दिशा निर्देशों के अनुसार सभी चूहों के साथ प्रयोगों प्रदर्शन किया गया. स्त्री B6.129 F1 जंगली प्रकार चूहों Taconic (Germantown न्यूयॉर्क), फिलाडेल्फिया के बच्चों के अस्पताल में प्रयोगशाला पशु सुविधा पर रखे, और PMI पोषण इंटरनेशनल (Richmond. इंडियाना) से खिलाया माउस आहार 5015 से खरीदे गए थे.

रणनीति लेबल. IDU (इस योजना में लाल चिह्नित) के साथ CldU के साथ प्रथम कक्ष विभाजन घटना (हरे रंग की इस योजना में चिह्नित) और दूसरी कोशिका विभाजन लेबलिंग करके अनुक्रमिक दोनों CldU और IDU (हरी / लाल) के साथ सह - लेबल की कोशिकाओं में कोशिका विभाजन के परिणाम .

अग्नाशय के चूहों के भीतर सेल के कारोबार के thymidine लेबलिंग के प्रतिनिधि परिणाम है. केंद्र में Langerhans की आइलेट के साथ एक माउस अग्न्याशय की Immunofluorescent छवि. माउस CldU के साथ 1 सप्ताह और 2 सप्ताह पीने के पानी में तत्काल बलिदान से पहले के लिए फिर IDU के लिए infused गया था. अग्न्याशय नमूना के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित संसाधित किया गया था. अलग परतों के साथ 40x उद्देश्य छवियों, की गणना के लिए उपयुक्त का प्रदर्शन किया. विलय छवियों DAPI (सफेद) (हरा) CldU, IDU (लाल), इंसुलिन (पीला) होते हैं. (ऊपरी बाएँ) DAPI और इंसुलिन. (ऊपरी दाएँ) CldU और इंसुलिन. (निचले बाएँ) IDU और इंसुलिन. (कम सही) CldU, IDU, और इंसुलिन. स्केल पट्टी: 100μm.

चित्रा 1
चित्रा 1 लेबल रणनीति. IDU (इस योजना में लाल चिह्नित) के साथ CldU के साथ प्रथम कक्ष विभाजन घटना (हरे रंग की इस योजना में चिह्नित) और दूसरी कोशिका विभाजन लेबलिंग करके अनुक्रमिक दोनों CldU और IDU (हरी / लाल) के साथ सह - लेबल की कोशिकाओं में कोशिका विभाजन के परिणाम .

चित्रा 2
चित्रा 2 अग्नाशय चूहों के भीतर सेल कारोबार के thymidine लेबलिंग के प्रतिनिधि परिणाम है. केंद्र में Langerhans की आइलेट के साथ एक माउस अग्न्याशय की Immunofluorescent छवि. माउस CldU के साथ 1 सप्ताह और 2 सप्ताह पीने के पानी में तत्काल बलिदान से पहले के लिए फिर IDU के लिए infused गया था. अग्न्याशय नमूना के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित संसाधित किया गया था. अलग परतों के साथ 40x उद्देश्य छवियों, की गणना के लिए उपयुक्त का प्रदर्शन किया. विलय छवियों DAPI (सफेद) (हरा) CldU, IDU (लाल), इंसुलिन (पीला) होते हैं. (ऊपरी बाएँ) DAPI और इंसुलिन. (ऊपरी दाएँ) CldU और इंसुलिन. (निचले बाएँ) IDU और इंसुलिन. (कम सही) CldU, IDU, और इंसुलिन. स्केल पट्टी: 100μm.

Discussion

हमारे सेल कारोबार लेबलिंग thymidine आधारित दृष्टिकोण के लिए दृष्टिकोण जैव चिकित्सा अनुसंधान में कई संभावित अनुप्रयोगों है. तिथि करने के लिए, हम अग्न्याशय पर ध्यान केंद्रित किया है, लेकिन हम भी इस रणनीति लागू करने के लिए त्वचा की कोशिका कारोबार, पेट, यकृत, अधिवृक्क, गुर्दे, वृषण, अंडाशय, थायराइड, लिम्फ नोड, hematopoiesis, और एक मस्तिष्क की जांच . क्योंकि सेल कारोबार ऊतक से ऊतकों को बदलता है, रणनीतियों लेबलिंग हित के अंग से सबसे सम्मोहक जानकारी प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. मॉरिसन और उनके सहयोगियों ने 1 दिन प्रत्येक hematopoiesis 2 लेबल के लिए CldU और IDU इस्तेमाल किया. Kuhn और उनके सहयोगियों ने 4 दिनों के लिए प्रत्येक CldU और IDU उपयोग regenerating मायोकार्डियम में 3 कोशिका विभाजन का पता लगाने. इसके विपरीत, हम CldU और IDU 9 जानवर 1,4-6 उम्र के रूप में कम से कम सेल कारोबार के साथ अग्नाशय islets, एक ऊतक के भीतर बेसल सेल कारोबार लेबल कुल महीने के लिए इस्तेमाल किया है. हमारे लेबलिंग रणनीति का सबसे स्पष्ट संभावित आवेदन के लिए अध्ययन ऊतक homeostasis के भीतर सेल कारोबार को परिभाषित करने के लिए. लेकिन हमारी तकनीक कई अन्य संभावित अनुप्रयोगों है. उदाहरण के लिए, हम भी हाल ही में इस तकनीक लागू करने के लिए ऊतकों के भीतर oncogenic परिवर्तन, जहाँ वृद्धि की प्रतिकृति का फोकल क्षेत्रों CldU या IDU 5 की वृद्धि निगमन द्वारा आसानी से पहचाना जा सकता है है की पहचान. मॉरिसन और उनके सहयोगियों ने 1 दिन प्रत्येक लेबल hematopoietic स्टेम सेल के व्यवहार को बनाए रखना 2 के लिए परीक्षण के लिए CldU और IDU इस्तेमाल किया. हम भी अनुक्रमिक thymidine अनुरूप निर्धारित करने के लिए अगर पारगमन-amplifying कोशिकाओं या ऊतकों 1 के विकास और नवीकरण के लिए योगदान लेबलिंग लागू है . Thymidine analogues के इस आवेदन अनुक्रमिक प्रशासन और ऊतक homeostasis में शामिल कोशिकाओं के मूल अस्तित्व के अध्ययन के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है.

Thymidine analogues सावधानी के बिना नहीं किया जाना चाहिए. सिंथेटिक thymidine analogues कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए संभावित toxicities है, और उनके उपयोग सैद्धांतिक रूप से बढ़ रही पशुओं में सेल कारोबार प्रभावित हो सकती है. Thymidine analogues के कैंसर रोगियों के लिए एजेंट radiosensitizing के रूप में इस्तेमाल किया गया है, और सेल कारोबार धीमा हो सकता है है. इस प्रकार हम सावधानी से ब्याज की उनके ऊतकों में संभावित toxicities के लिए जांच के लिए जांचकर्ताओं से आग्रह करता हूं. उदाहरण के लिए, Trumpp और उनके सहयोगियों को लगता है कि प्रणालीगत BrdU hematopoietic स्टेम सेल सेल 7 चक्र में प्रवेश करने के लिए मजबूर कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, Rutter और उनके सहयोगियों ने कहा कि उच्च खुराक thymidine analogues 8 अग्न्याशय के विकास के लिए विषाक्त कर रहे हैं. हाल ही में Hellerstein और KineMed सहयोगियों, इंक में पाया गया कि BrdU प्रशासन अंतर आइलेट प्रसार 16-25% द्वारा एक मालिकाना भारी पानी लेबलिंग 9 तकनीक का उपयोग कर धीमा कर देती है. पूरे आइलेट Hellerstein और उनके सहयोगियों के द्वारा प्रयोग किया जाता तैयारी कई अन्य endocrine और गैर endocrine सेल प्रकार है, जो कुल आइलेट तैयारी के जितना 50% शामिल सकता है निहित. हालांकि, हम पाते हैं BrdU की है कि लंबे समय तक प्रेरणा युवा वयस्क चूहों में बीटा सेल प्रसार को प्रभावित नहीं करता है, के रूप में ki67 4 अभिव्यक्ति द्वारा मापा. इसी तरह, CldU और IDU के लंबे समय तक प्रशासन बीटा सेल जन विस्तार 1 ख़राब नहीं लगती. इसके अलावा, बीटा सेल प्रसार दर समय और चूहों कि केवल कुछ घंटे (दरों बराबर समय अवधि के लिए सामान्यीकृत कर रहे हैं) के लिए चिह्नित कर रहे हैं की लंबी अवधि के के लिए BrdU लेबल के साथ चूहों के बीच में बराबर हैं. साथ में, इन परिणामों का सुझाव है कि चूहों को सुरक्षित रूप से लंबी अवधि के thymidine analogues के कम खुराक प्रशासन बर्दाश्त कर सकते हैं. फिर भी, हम बाहर अग्नाशय बीटा सेल के विकास में thymidine analogues द्वारा संभावित विषाक्तता नहीं शासन कर सकते हैं. एक परिणाम के रूप में, हम करने के लिए नियंत्रण प्रदर्शन जब thymidine analogues के साथ चूहों लेबलिंग, और अन्य जांचकर्ताओं के लिए इतनी के रूप में अच्छी तरह से करने के आग्रह करता हूं जारी है.

अनुक्रमिक thymidine एनालॉग लेबलिंग की हमारी तकनीक नुकसान और तकनीकी चुनौतियों के बिना नहीं है. एक परिणाम के रूप में, नियंत्रण स्लाइड विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं. हम नियंत्रण स्लाइड्स कि 1 से विभिन्न ऊतकों से मिलकर उत्पन्न किया है) चूहे कि केवल CldU साथ लेबल रहे थे;. 2) चूहे कि केवल IDU साथ लेबल रहे थे; 3) चूहे कि sequentially CldU और तब IDU के साथ लेबल रहे थे; 4) चूहे कि sequentially रिवर्स क्रम में लेबल थे, पहले IDU और तब CldU के साथ; 5) चूहे कि केवल पानी के साथ लेबल नकली हैं. जब CldU और IDU के साथ लेबल के लिए सीखने के लिए, जांचकर्ताओं हमेशा बाहर सभी 5 हित के ऊतकों से स्लाइड्स के ऊपर सेट के साथ पूरे प्रोटोकॉल ले.

CldU और IDU के बीच में थोड़ा सा पार जेट एक दुर्भाग्यपूर्ण लेकिन अपरिहार्य दोनों thymidine analogues के साथ लेबलिंग नकारात्मक पहलू है. CldU और IDU तकनीक समानताएं में antisera कि मूल रूप से विभिन्न प्रजातियों (माउस और चूहा) में थे BrdU के खिलाफ निकाली बीच में अंतर पर आधारित है. हमारी प्रोटोकॉल, बोझिल जबकि ऐसे पार जेट को कम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है. नतीजतन, हम जो जांचकर्ताओं प्रोटोकॉल (ओं) के कदम लंघन पर विचार के बीच सावधानी से आग्रह करता हूं. विशेष रूप में, हम हैमाध्यमिक antisera के साथ समस्याओं का सामना करना पड़ा है कि माउस और चूहे के बीच में पार प्रतिक्रियाशील रहे हैं. यह है कि पूरी तरह से कर रहे हैं माउस और चूहे के बीच में पार adsorbed जैक्सन antisera के उपयोग द्वारा कम किया जा सकता है.

हम कभी कभी पर्याप्त thymidine निगमन का पता लगाने में विफल है. ऐसे मामलों में यह महत्वपूर्ण है सकारात्मक नियंत्रण स्लाइड्स का उपयोग करने के लिए निर्धारित है जो अभिकर्मक या कदम काम नहीं कर रहा था. कठिनाइयाँ आम तौर पर कर रहे हैं antisera, शुष्क स्लाइड्स, या अपर्याप्त परमाणु permeabilization का बुरा aliquots के कारण है. हम को सफलतापूर्वक IDU के साथ भ्रूण विकसित लेबल में विफल रहा है. इस प्रकार, सभी ऊतकों IDU के लिए पारगम्य नहीं हो सकता है.

डबल thymidine एनालॉग लेबलिंग के लिए CldU और IDU के लिए वैकल्पिक क्षितिज पर हैं. Edu (deoxyuridine 5 - ethinyl-2) तांबे उत्प्रेरित क्लिक रसायन शास्त्र 10,11 पता लगाने के लिए एक सब्सट्रेट किया जा सकता है . Edu तरीकों का पता लगाने डीएनए strands की जुदाई की आवश्यकता नहीं है, और इस प्रकार उच्च प्रवाह cytometry 12 से विश्लेषण करने के लिए उत्तरदायी हैं. Edu है लेकिन 10 BrdU के साथ प्रतिक्रियाशील पार संगत नहीं है . Edu सेल विभिन्न माउस के ऊतकों के अग्नाशय बीटा 13 कोशिकाओं, आंतों एल 14 कोशिकाओं और 15 epidermis सहित कारोबार यों इस्तेमाल किया गया है. Edu पल (500mg प्रति 1000 अमरीकी डॉलर) में काफी महंगा है. फिर भी, Edu पता लगाने के लिए अधिक BrdU पता लगाने की तुलना में 10 संवेदनशील प्रतीत होता है. इस प्रकार, यह आर्थिक Edu और CldU और IDU के बजाय BrdU गठबंधन संभव हो सकता है. Triply Edu, CldU, और IDU के लिए लेबल चूहों में कोशिका विभाजन के तीन अलग - अलग दौर की इस पद्धति का भी पता लगाने की अनुमति हो सकती है.

सारांश में, अनुक्रमिक thymidine एनालॉग लेबलिंग के बारे में हमारी तकनीक सेल कारोबार का पता लगाने के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण है. हमें उम्मीद है कि हमारे दृष्टिकोण अन्य वैज्ञानिकों के लिए सक्षम बनाता है अधिक सही कोशिका विभाजन यों, और उम्मीद है कि यह ऊतकों homeostasis में नए मानदंड खुल जाएगा.

Disclosures

चूहों के साथ सभी प्रयोगों जानवरों की सुविधा में फिलाडेल्फिया के बच्चों के अस्पताल में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया.

Acknowledgments

JDRF, एनआईएच (R01-DK081469), पेन्सिलवेनिया के राष्ट्रमंडल (पुनर्योजी चिकित्सा अनुदान 4100043362 में उत्कृष्टता के लिए केंद्र), ऑफ डाइम्स के मार्च (तुलसी O'Connor स्टार्टर विद्वान अनुसंधान पुरस्कार), और पेंसिल्वेनिया DERC पायलट के एक विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित और व्यवहार्यता अनुदान (DK19525).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-chloro-2-deoxyuridine (CldU) MP Biomedicals 0210547891
5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU) MP Biomedicals 0210035701
4% Paraformaldehyde USB Corp., Affymetrix 19943
10% Buffered Formalin Fisher Scientific 23-427-098
XYLENES VWR international EM-XX0060-4
Ethanol, Anhydrous (Histological) Fisher Scientific A405P-4
PBS, 10X Powder Concentrate Fisher Scientific BP665-1
Triton –X-100 Fisher Scientific BP151-500
Hydrochloric Acid VWR international BDH3028-2.5LG
Normal Donkey Serum Jackson ImmunoResearch 017-000-121
Mouse Anti BrdU BD Biosciences 347580
Rat mab anti BrdU Accurate Chemical & Scientific Corporation OBT0030
Cy2 donkey anti-rat Jackson ImmunoResearch 712-225-153 Fully adsorbed secondaries from Jackson (minimal cross reactivity).
Cy5 donkey anti-mouse Jackson ImmunoResearch 715-175-151 See above
Glass Cover Slips Sigma-Aldrich C9056-1CS
YFP Filter Chroma Technology Corp. 49003 ET EYFP Reduces auto-fluorescence in Cy2 channel
Cy3 Filter Chroma Technology Corp. 49004 ET Cy3
Cy5 Filter Chroma Technology Corp. 49006 ET Cy5
ORCA ER Microscope Camera Hamamatsu Corp. C4742-95-12ER Excellent detection of fluorophores
ProLong Gold antifade reagent Invitrogen P36930 Do not use Vectashield (toxic to cyanine dyes).

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References

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Comments

1 Comment

  1. Very detailed and well explained. Found it very useful to plan my experiments.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 25, 2011 - 10:48 AM

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