Co-cultuur modellen van Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown op Live menselijke luchtwegen cellen

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dit artikel beschrijft verschillende methoden van groeiende

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Moreau-Marquis, S., Redelman, C. V., Stanton, B. A., Anderson, G. G. Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells. J. Vis. Exp. (44), e2186, doi:10.3791/2186 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bacteriële biofilms zijn geassocieerd met een aantal verschillende ziekten bij de mens, maar biofilm ontwikkeling is in het algemeen onderzocht op niet-levende oppervlakken. In dit artikel beschrijven we protocollen voor het vormen van Pseudomonas aeruginosa biofilms op menselijke epitheelcellen (CFBE cellen) in kweek. In de eerste methode (genoemd de Static Co-cultuur Biofilm Model), P. aeruginosa is geïncubeerd met CFBE cellen gekweekt als samenvloeiende monolagen op standaard weefselkweek platen. Hoewel de bacterie is zeer giftig voor de epitheelcellen, de toevoeging van arginine vertraagt ​​de vernietiging van de monolaag lang genoeg om biofilms te vormen op de CFBE cellen. De tweede methode (aangeduid als de Flow Cell Co-cultuur Biofilm Model), omvat de aanpassing van een biofilm flow cel apparatuur, die vaak wordt gebruikt in de biofilm onderzoek, om een ​​glazen dekglaasje aan het ondersteunen van een confluente monolaag van cellen CFBE tegemoet te komen. Deze monolaag wordt geënt met P. aeruginosa en een peristaltische pomp stroomt dan vers medium over de cellen. In beide systemen, bacteriën biofilms vormen binnen 6-8 uur na inoculatie. Visualisatie van de biofilm wordt versterkt door het gebruik van P. aeruginosa stammen constitutief uiten van groen fluorescerend eiwit (GFP). De statische en Flow Cell Co-cultuur Biofilm assays zijn modelsystemen voor de vroege P. aeruginosa infectie van de Cystic Fibrosis (CF) long-, en deze technieken laat verschillende aspecten van P. aeruginosa biofilmvorming en virulentie te bestuderen, met inbegrip van biofilm cytotoxiciteit, meting van de biofilm CFU en kleuring en visualiseren van de biofilm.

Protocol

1. Static Co-cultuur Biofilm Model

  1. De Static Co-cultuur Biofilm model maakt gebruik van een CFBE41o-cellen (CFBE cellen), die zijn vereeuwigd cellen oorspronkelijk ontwikkeld vanuit een individu met CF homozygoot voor de ΔF508-CFTR mutatie 2,3,4. CFBE cellen moet worden uitgezet met een concentratie van 10 6 cellen / putje in een 6-well weefselkweek plaat of 2 X 10 5 in een 24-well plaat in weefselkweek minimaal essentieel medium (MEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum, 2 mM L-glutamine, 50 U / ml penicilline, en 50 ug / ml streptomycine. We maken gebruik van 1,5 ml medium per putje in 6-well platen en 0,5 ml medium per well in 24-wells platen.
  2. De cellen moeten worden gekweekt bij 37 ° C en 5% CO 2 -95% lucht voor 7-10 dagen tot een confluente monolaag voor enting met bacteriën vormen. Het medium moet elke worden veranderd 2-3 dagen. Deze voorwaarden hebben aangetoond te leiden tot de vorming van een confluente monolaag en tight junctions.
  3. Groeien P. aeruginosa in 5 ml LB 18 uur bij 37 ° C op een incubator shaker bij 200 rpm. Onder deze omstandigheden, P. aeruginosa culturen zal doorgaans tot een dichtheid van 5x10 9 CFU / mL.
  4. Voor bacteriële inoculatie, verwijder het medium van CFBE cellen en voeg een gelijk volume van MEM zonder fenol rood, aangevuld met 2 mM L-glutamine (Microscopie medium). Confluerende CFBE monolagen zijn geënt met P. aeruginosa bij een multipliciteit van infectie van ongeveer 30:1 ten opzichte van het aantal cellen CFBE oorspronkelijk gezaaid. Dit komt overeen met 2 x 10 7 CFU / ml in 1,5 ml MEM / goed voor 6-well platen en 1,2 x 10 7 CFU / ml in 0,5 ml MEM / goed voor de 24-wells platen.
  5. Incubeer de platen gedurende 1 uur bij 37 ° C en 5% CO 2 -95% lucht.
  6. Na de 1 uur incubatie, moet het supernatant worden verwijderd en vervangen met vers Microscopie medium, aangevuld met 0,4% arginine.
  7. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO 2 -95% lucht voor verschillende tijdstippen (tot ongeveer 8 uur) en analyseren van de integriteit van de CFBE monolaag met fase-contrast microscopie. Als de luchtwegen cellen zijn niet-confluent, P. aeruginosa zal snel (binnen een paar minuten) toegang krijgen tot de basolaterale oppervlak van de cellen en vernietigen cellulaire integriteit. Inoculatie met P. aeruginosa stammen die constitutief GFP resultaten uit te drukken in fluorescerende biofilm microkolonies die kunnen worden gevisualiseerd door epifluorescentie of confocale microscopie.
  8. De bacteriële CFU in de biofilm kan worden bepaald door het wassen van de co-cultuur 2-3 maal met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) om planktonische bacteriën te elimineren. Na het wassen, behandelen met 0,1% Triton X-100 in PBS of MEM gedurende 10-15 minuten tot de epitheelcellen lyseren en de biofilm verspreiden.
  9. Vortex gedurende 3 minuten en voor te bereiden seriële verdunningen van het lysaat. Plaat van deze verdunningen op LB-agar en incubeer overnacht bij 37 ° C. Tel de kolonies de volgende dag naar de CFU te bepalen.

2. Flow Cell Co-cultuur Biofilm Model

  1. De Flow Cell Co-cultuur Biofilm Model (flow-test) houdt in wijziging van de standaard biofilm stroom cel apparatuur om tegemoet CFBE cellen 5.
  2. Plaats een aantal van 40 mm diameter glas dekglaasjes in een schoon bekerglas van 100 ml. Dek goed af met 2 lagen aluminium folie en autoclaaf op een droog cyclus voor 20 minuten.
  3. Werken in een celkweek kap, pak een steriele dekglaasje uit de beker met behulp van ethanol gewassen pincet en plaats in een steriele 60-mm kunststof schotel.
  4. Voeg 3 ml van de voorverwarmde celgroei medium, druk op de dekglaasje met de punt van de pipet op een zeepbel zitten eronder te verwijderen en het dekglaasje kracht om de bodem van de plastic schotel.
  5. Zaad 2x10 6 cellen per schaal en schud de schaal heen en weer. Vermijd wervelende om te voorkomen dat het centrifugeren de cellen tegen de zijkanten van de schotel.
  6. Zet de schaal in een 5% CO 2 -95% lucht incubator bij 37 ° C en voeden de cellen om de andere dag met 3 ml vers groeimedium voor 8 tot 10 dagen. De cellen vormen een confluente monolaag op het glas dekglaasje aan.
  7. Grow P. aeruginosa in 5 ml LB 18 uur bij 37 ° C op een incubator shaker bij 200 rpm. Onder deze omstandigheden, P. aeruginosa culturen zal doorgaans tot een dichtheid van 5x10 9 CFU / mL. We maken gebruik van P. aeruginosa stam PAO1 het dragen van de pSMC21 plasmide voor constitutieve expressie van GFP 6.
  8. Voeg 1 mL van de bacteriecultuur in een steriele microcentrifugebuis. Centrifugeer bij 6000 rpm gedurende 3 min, en twee keer was de bacteriële pellet in 1 ml van de Microscopie medium.
  9. Verdun 0,5 ml van de gewassen en geresuspendeerd bacteriën in 4,5 mL Microscopie medium tot een concentratie van ~ 5x10 8 CFU / ml te bereiken.
  10. Observatie van levende cellenin real-time beeldvorming vraagt ​​om een ​​kamer gekoppeld aan een peristaltische pomp (tot een stroom van voedingsstoffen voor de langere lengte van tijd te waarborgen) en een temperatuurregelaar. We gebruiken de Bioptechs FCS2 (Focht Live-Cell) kamer is aangesloten op een low-flow micro-perfusie pomp met 1 / 16 e C-flex buis gesneden juiste lengtes en geautoclaveerd voor steriliteit, en temperatuur-geregeld via de FCS2 kamer controller. We houden de ingangsbron van medium in een 37 ° C waterbad pal naast de microscoop bevindt.
  11. Monteer de stroom kamer. De FCS2 kamer is voorzien van een self-locking base (die zit op het podium tijdens de adapter imaging) en een bovenste helft is aangesloten op de perfusie buizen en de kamer controller. De kamer is upside-down gemonteerd voordat ze omgedraaid en geplaatst op het podium adapter. Houd de bovenste helft van de kamer op zijn kop, zodat de doorbloeding buizen zichtbaar zijn, en lijn de gaten van een 0,75 mm dikke rubberen afdichting op de perfusie buizen. Stapel de microaqueduct slide voorzien van de kamer op de top van de rubberen pakking, zorg ervoor dat de gegroefde zijde omhoog, en plaats nog een rubberen pakking op de bovenkant van de dia. De dikte en de interne geometrie van deze tweede pakking bepaalt het volume van de kamer. We meestal werken met een 0,75 mm dikke rubberen pakking met een 30-mm ronde interne geometrie.
  12. Voeg 1 mL van de voorverwarmde (37 ° C) Microscopie medium in het midden van de dia.
  13. Haal een 60-mm gerecht uit de celkweek incubator, verwijdert u de gebruikte medium en een keer was de cellen met 3 ml van de voorverwarmde Microscopie medium. Deze stap zorgt ervoor dat de eliminatie van de fenolrood en antibiotica in de cel aanwezig groeimedium. Fenol rood licht fluorescerende en kunnen interfereren met de beeldvorming, terwijl antibiotica kunnen uitroeien P. aeruginosa bacterie voordat ze kunnen vaststellen biofilms.
  14. Met behulp van ethanol gewassen pincet, haalt u de dekglaasje uit de schotel en lagere hem ondersteboven op de hiel van de Microscopie medium geplaatst op de kamer. Het dekglaasje is nu rust op de tweede rubberen pakking en de monolaag van de luchtwegen cellen is naar beneden gericht.
  15. Houd de gemonteerde componenten in de ene hand, plaats de voet van de kamer op de top van de stack, en draai de kamer meer dan snel, zodat alles goed is kant naar boven. Vergrendel de voet op zijn plaats door te draaien aan de ring.
  16. Sluit de inlaatbuis om de lage-flow micro-perfusie pomp en start de stroom met een snelheid van 20 ml / uur, debiet is in het zwemmen snelheden van P. aeruginosa. Een tweede stuk buis koppelingen de pomp naar een kolf van Microscopie medium geplaatst in de 37 ° C waterbad pal naast de microscoop bevindt.
  17. Bevestig steriele pre-cut 1 / 16 e C-Flex slang aan de inlaat en uitlaat perfusie buizen van de kamer, sluit u de temperatuurregelaar, plaats dan de verzamelde kamer op de microscoop stadium van een omgekeerde fluorescentie microscoop.
  18. Met behulp van een 1-ml wegwerpspuit, injecteer de eerder bereide bacteriële suspensie in de kamer, met behulp van een twee-weg-klep geplaatst in-lijn tussen de pomp en de kamer. In onze bijzondere setting, het duurt een 0,6 ml volume van de bacteriële suspensie te bereiken van de kamer. Pas dit volume op basis van uw specifieke lengte van de leidingen. Wij vinden het ook handig om een ​​in-line wegwerp 0,22 um filter tussen de pomp en de twee-weg-klep om bacteriën te voorkomen dat stroom in te zwemmen en besmetten de input fles plaats.
  19. , Zodat bacteriën hechten aan de luchtwegen cellen, stop de pomp voor 2u. De stroom kan vervolgens opnieuw geïnitieerd en in stand gehouden op 20 ml / h voor de rest van het experiment.
  20. Toezicht op de integriteit van de luchtweg cellen door differentieel interferentie contrast (DIC) microscopie gedurende het experiment om te controleren op tekenen van schade aan de monolaag. Tegelijkertijd, volg de ontwikkeling van GFP-gelabelde P. aeruginosa biofilms op het apicale oppervlak van de luchtwegen cellen door de acquisitie van beelden met een omgekeerde confocale of wide-field fluorescentie microscoop.

3. Representatieve resultaten

We maken gebruik van een stam van P. aeruginosa met de pSMC21 plasmide die het mogelijk maakt voor constitutieve expressie van GFP 6. Om deze reden kan GFP-gelabelde biofilms groeien op een CFBE monolaag worden gevisualiseerd door epifluorescentie microscopie. Als alternatief kan visualisatie van de biofilm worden bereikt door kleuring niet-gemerkte P. aeruginosa met een 1% calcofluor wit-oplossing gedurende 1 uur bij 37 ° C 1.

Voor beeldvorming van biofilm vorming op CFBE cellen in de flow test gebruiken we een op maat gemaakte stadium adapter, maar meerdere bedrijven kan nu speciaal ingerichte podium adapters. Wij werken met een Olympus IX70 omgekeerde microscoop uitgerust met een ORCA-AG diepe koeling CCD-camera en een X60 olie-immersie objectief (numerieke apertuur 1.40). Het filter Whiel is voorzien van een 480/40 nm band pass filter excitatie en een 535/30 nm band pass filter emissie. Digitale beelden werden verkregen met de Openlab 4.0.3-software-pakket (improvisatie) en volumes werden deconvolved door iteratief restauratie met behulp van de Volocity 3.5.1 software (improvisatie). Kwantitatieve analyse van 3D-structuren biofilm werd bereikt met de COMSTAT beeldanalyse software pakket 7,8.

Voor elke beschouwd als co-cultuur model, moet men bijzondere aandacht besteden aan de cytotoxiciteit ontwikkelen tussen de componenten van het model. In zowel de statische als de stroom cel assays, vonden we dat de CFBE monolaag kan de aanwezigheid van P. te weerstaan aeruginosa tot 8 uur na inoculatie, zonder enig teken van verandering. Epitheliale monolaag integriteit kan worden beoordeeld door fase-contrast microscopie met behulp van een omgekeerde microscoop een (Figuur 1A) of door het differentieel interferentie contrast (DIC) microscopie gedurende het experiment 5. Na verloop van tijd, P. aeruginosa zal produceren giftige stoffen en virulentiefactoren die zich ophopen en kan de epitheliale cel monolayer geheel of in delen (Figuur 1B-1C) schade. Cytotoxiciteit kan kwantitatief worden beoordeeld met behulp van verschillende kits om de vrijlating van lactaat dehydrogenase (LDH) te meten van de epitheelcellen. LDH is een stabiele cytosol enzym uitgebracht in de extracellulaire milieu op cel lysis of celdood.

Wanneer de integriteit van de luchtweg monolaag niet in het gedrang (typisch voor ~ 8 uur na inenting), P. aeruginosa biofilms met succes kan vormen en ontwikkelen op het apicale oppervlak van de luchtwegen cellen in beide beschreven co-cultuur modellen (Figuur 2A-2B). Volgende 3D-reconstructie (figuur 2C) en kwantificeren, kan biomassa accumulatie nauwkeurig worden bepaald. We hebben ook gebruik gemaakt van deze co-cultuur biofilms in verschillende fenotypische testen. Bijvoorbeeld, zoals hierboven vermeld, kan biofilm CFU gemakkelijk worden bepaald door het lyseren van de epitheelcellen, serieel verdunning van het lysaat en plating op agar platen. Wij hebben gevonden deze techniek voordelig bij het bepalen van de weerstand van verschillende stammen tot een behandeling met antibiotica. Bovendien kan biofilm toxiciteit in de richting van de epitheliale cellen worden gemeten met behulp van commercieel verkrijgbare LDH detectie kits. Op deze manier kan de rol van virulentiefactoren in toxiciteit van biofilms worden beoordeeld. Deze modelsystemen ondersteunen ook een aantal van genexpressie toepassingen, waaronder initiatiefnemer fusion studies, RT-PCR, en microarray analyse 1,5,9.

Figuur 1
Figuur 1. Monolaag van CFBE cellen en representatief beeld van de gecompromitteerde en beschadigde luchtwegen celmonolagen ten gevolge van P. aeruginosa biofilm groei. (A) representatief beeld van een confluente monolaag van CFBE cellen gekweekt in weefselkweek platen, beoordeeld door fase-contrast microscopie. Schaalbalk, 120 micrometer. (B) Voorbeeld van een gecompromitteerde CFBE monolaag. Hoewel de monolaag niet voor de hand liggende zichtbare tekenen van schade nog weer te geven, P. aeruginosa bacteriën worden gezien verspreiden tussen de strakke knooppunten van de epitheliale cellen en het verkrijgen van toegang tot de basolaterale membranen. Biofilmvorming is meestal niet bereikt onder deze omstandigheden te wijten aan de monolaag verslechteren. Schaalbalk, 20 urn. (C) Voorbeeld van een overwoekerde P. aeruginosa biofilm waargenomen 24 uur na inenting. Na het succesvol ondersteunen van biofilmvorming, was de CFBE monolaag onherstelbaar beschadigd en is nu vrijwel afwezig. Resterende biofilm, groeien als een vlakke laag van bacteriën, wordt verbonden aan het glas dekglaasje aan. Schaalbalk, 20 urn.

Figuur 2
Figuur 2. P. aeruginosa biofilms geteeld op het apicale oppervlak van samenvloeiende CFBE cellen met behulp van de statische Co-cultuur Biofilm Model en de Flow Cell Co-cultuur Biofilm Model. (A) representatief beeld van een GFP-expressie P. aeruginosa biofilm gekweekt op een confluente monolaag van CFBE cellen met behulp van de statische Co-cultuur Biofilm model, beoordeeld door epifluorescentie microscopie. Beeld is een overlay van de fase contrast kanaal en de fluorescentie kanaal. Schaalbalk, 35 micrometer. (B) representatief beeld van een GFP-gemerkte P. aeruginosa biofilm geteeld voor 6 uur op een confluente monolaag van CFBE cellen met behulp van de Flow Cell Co-cultuur Biofilm Model. Ter bevordering van de visualisatie van de luchtweg monolaag, werden kernen gekleurd met 10 ug / mL Hoechst 33342 (Molecular Probes) gedurende 30 minuten voorafgaand aan de inoculatie met P. aeruginosa. Samengevoegd en pseudocolored beelden werden bekeken door differentieel interferentie contrast (DIC), en de bijbehorende fluorescerende beelden worden getoond. Biofilms, presenteren als groene groepjes aan de apicale oppervlak van de CFBE cellen, zijn verspreid over de luchtwegen cellen. Schaalbalk, 20 urn. (C) Drie-dimensionale wederopbouwTIE van de z-series image stacks met de typische paddestoel-achtige structuren van 6 h-oud P. aeruginosa biofilms vormen op een CFBE cel monolaag. Schaalbalk, 10 urn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biofilms zijn gemeenschappen van bacteriën die vorm in reactie op prikkels uit de omgeving. Deze milieu-signalen leiden tot wereldwijde wijzigingen in de regelgeving binnen elke bacterie, wat resulteert in binding aan een oppervlak, aggregatie, de productie van exopolysacchariden, en andere fenotypes zoals verhoogde resistentie tegen antibiotica 10. In de afgelopen paar decennia, is er veel bewijs ondersteunde de hypothese dat biofilms een grote rol spelen in de pathogenese van chronische infecties. Zo is het algemeen geaccepteerd dat P. aeruginosa is in staat om chronische infecties te vestigen in de longen van Cystic Fibrosis (CF) patiënten door de vorming van biofilms 11. CF is een erfelijke aandoening, waarbij mutaties in het CFTR-gen leiden tot een onjuiste chloride secretie 12. CF-patiënten meestal ervaring veranderde luchtweg fysiologie leidt tot dik slijm pluggen in de luchtwegen en, tegelijkertijd, op microbiële infecties 13. Door de late adolescentie, de overheersende besmettelijke agent van CF luchtwegen is P. aeruginosa, wat leidt tot een chronische infectie die biofilm is resistent zijn tegen antibiotica 14.

De protocollen beschreven in dit document zijn ontwikkeld om te fungeren als modelsystemen voor het bestuderen van biofilm vorming op levende longcellen. Bacteriële biofilms zijn betrokken bij tal van ziekten staten en, toch, zijn meestal onderzocht op niet-levende vaste oppervlakken, zoals glas en plastic 15,16. Door het bestuderen van biofilmvorming en groei op abiotische oppervlakken slechts, is een ontbrekende belangrijke interacties tussen pathogeen en gastheer die alleen kan optreden bij een model-systeem zoals beschreven in de protocollen hierboven. Met name de Static Co-cultuur Biofilm Model en de Flow Cell Co-cultuur Biofilm Model profiteren van de mogelijkheden van P. aeruginosa voor interactie met en binden aan de epitheliale oppervlak van de long. Met behulp van deze modellen hebben we aangetoond dat de reactie van de co-cultuur biofilms op behandeling met antibiotica uniek is en dat deze modellen hebben meer kans op betere weerspiegeling van de besmettelijke staat 1,5. In dit verband hebben we gemeld dat de weerstand tegen tobramycine neemt toe met> 25-voudig bij P. aeruginosa biofilms zijn geteeld op de luchtwegen cellen in vergelijking met biofilms gekweekt op abiotische oppervlakken zoals glas 5. Het is waarschijnlijk dat deze technieken de gebeurtenissen die zich voordoen tijdens de vroege kolonisatie van de long 17 weer te geven. Daarom is de co-cultuur model systemen vertegenwoordigen innovatieve hulpmiddelen voor het begrijpen van beginstadium van de infectie van de CF luchtwegepitheel door P. aeruginosa 1.

Weefselkweek systemen zijn meestal in dienst om interacties tussen gastheer en pathogeen te begrijpen. We hebben deze interacties een stap verder door de vorming van biofilms op levende menselijke epitheelcellen. In de toekomst, aangepaste versies van de modellen die hier beschreven zou kunnen worden gebruikt om de biofilm vorming van verschillende bacteriën in andere besmettelijke staten te onderzoeken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgements

We willen graag G. O Toole bedanken voor de begeleiding en suggesties bij de ontwikkeling van deze modellen. Dit werk werd ondersteund door de Cystic Fibrosis Foundation (ANDERS06F0 naar GGA, STANTO07RO en STANTO08GA aan BAS), de National Institutes of Health (T32A107363 aan GGA en R01-HL074175 naar BAS), en het National Center for Research Resources Centers for Biomedical Research Excellence (Cobre P20-RR018787 aan BAS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FCS2 (Focht Live-Cell) chamber Bioptechs 060319131616
FCS2 chamber controller Bioptechs 060319-2-0303
40 mm glass coverslips Bioptechs PH 40-1313-0319
MEM Mediatech, Inc. #10-010-CV
MEM without phenol red Mediatech, Inc. Mediatech, Manassass, VA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells. Infect Immun. 76, 1423-1433 (2008).
  2. Bruscia, E. Isolation of CF cell lines corrected at DeltaF508-CFTR locus by SFHR-mediated targeting. Gene Ther. 9, 683-685 (2002).
  3. Cozens, A. L. CFTR expression and chloride secretion in polarized immortal human bronchial epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 10, 38-47 (1994).
  4. Hentchel-Franks, K. Activation of airway cl- secretion in human subjects by adenosine. Am J Respir Cell Mol Biol. 31, 140-146 (2004).
  5. Moreau-Marquis, S. The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, 25-37 (2008).
  6. Kuchma, S. L., Connolly, J. P., O'Toole, G. A. A three-component regulatory system regulates biofilm maturation and type III secretion in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187, (2005).
  7. Heydorn, A. Experimental reproducibility in flow-chamber biofilms. Microbiology. 146, (Pt 10), 2409-2415 (2000).
  8. Heydorn, A. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146, (Pt 10), 2395-2407 (2000).
  9. Anderson, G. G., Yahr, T. L., Lovewell, R. R., O'Toole, G. A. The Pseudomonas aeruginosa magnesium transporter MgtE inhibits transcription of the type III secretion system. Infect Immun. 78, (2010).
  10. Costerton, J. W. Overview of microbial biofilms. J Ind Microbiol. 15, 137-140 (1995).
  11. Hoiby, N., Frederiksen, B., Pressler, T. Eradication of early Pseudomonas aeruginosa infection. J Cyst Fibros. 4, Suppl 2. 49-54 (2005).
  12. Ko, Y. H., Pedersen, P. L. Cystic fibrosis: a brief look at some highlights of a decade of research focused on elucidating and correcting the molecular basis of the disease. J Bioenerg Biomembr. 33, 513-521 (2001).
  13. Gibson, R. L., Burns, J. L., Ramsey, B. W. Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 168, 918-951 (2003).
  14. Furukawa, S., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. Keeping their options open: acute versus persistent infections. J Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).
  15. Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. Chapter 1, Unit 1B 1-Unit 1B 1 (2005).
  16. O'Toole, G. A., Kolter, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis. Mol Microbiol. 28, 449-461 (1998).
  17. Gomez, M. I., Prince, A. Opportunistic infections in lung disease: Pseudomonas infections in cystic fibrosis. Curr Opin Pharmacol. 7, 244-251 (2007).

Comments

4 Comments

  1. HI thanks for this video it was really great. I was wondering if you have tried using A549 cells.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 4, 2011 - 12:28 PM
  2. Not to my knowledge

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 4, 2011 - 5:27 PM
  3. Can this system be used to study effect of various antibiotics on P.
    aeruginosa biofilm formation

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 7, 2011 - 11:14 PM
  4. Yes, and we have done so (see references #1 and #5 of the protocol).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 8, 2011 - 1:42 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics