שילוב של הדגימה דבק קלטת מבוססי פלואורסצנטי באתרו הכלאה עבור איתור מהיר של סלמונלה על תוצרת טרייה

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

פרוטוקול זה מתאר גישה פשוטה דבק, סרט המבוסס על מדגם של עגבניות ושאר משטחים תוצרת טרייה, ואחריו איתור מהיר של כל תא

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce. J. Vis. Exp. (44), e2308, doi:10.3791/2308 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר גישה פשוטה עבור דגימה דבק, סרט המבוסס על עגבניות ושאר משטחים תוצרת טרייה, ואחריו הקרינה על הקלטת הכלאה באתרו (FISH) לאיתור תרבות עצמאית מהירה של Salmonella spp. קלטות תא טעון גם יכול להיות ממוקם עם הפנים כלפי מטה על אגר סלקטיבי להעשרת מוצק שלב לפני זיהוי. לחלופין, בנפח נמוך enrichments נוזלי (miniculture פני הנוזל) יכול להתבצע על פני השטח של הקלטת במרק הלא סלקטיבי, ואחריו דגים ניתוח באמצעות cytometry הזרימה. כדי להתחיל, דבק סטרילי מובא במגע עם תוצרת טרייה, לחץ עדין מוחל, ועל הסרט מוסר, פיזית לחילוץ חיידקים המצויים על גבי משטחים אלה. קלטות מורכבים דביקות בצד לעלות על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית התאים שנדגמו הם קבועים עם 10% פורמלין (30 דקות) ו מיובש באמצעות סדרה אתנול מדורגים (50, 80, ו - 95%; 3 דקות כל ריכוז). לאחר מכן, התא טעון קלטות הם הבחינו עם חוצץ המכיל סלמונלה במיקוד DNA קוקטייל בדיקה הכלאה במשך 15 - 30 דקות ב 55 מעלות צלזיוס, ואחריו קצר לשטוף במאגר כביסה להסיר בדיקה מאוגד. חסיד, דגים שכותרתו תאים counterstained מכן עם ה-DNA לצבוע 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) והתוצאות שנצפו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. להעשרת מוצק שלב, תא מטען קלטות ממוקמים עם הפנים כלפי מטה על משטח מתאים אגר סלקטיבי וטופחו על מנת לאפשר צמיחה באתרו של microcolonies סלמונלה, ואחריו דגים מיקרוסקופיה כמתואר לעיל. עבור miniculture פני הנוזל, תא מטען קלטות ממוקמים בצד הדביק למעלה וחדר זלוף סיליקון מוחל כך את הקלטת שקופיות מיקרוסקופ טופס התחתון של תא מים חזק שלתוכו נפח קטן (≤ 500 μL) של Trypticase סויה מרק (TSB) הוא הציג. יציאות כניסת חתומות ותאי מודגרת ב 35-37 מעלות צלזיוס, מה שמאפשר צמיחה המבוססת על הגברה של קלטת חילוץ חיידקים. לאחר דגירה, יציאות כניסת אינן חתומות, תאים מנותקים מעורב עם הגב נמרץ ושוב pipetting, שנקטפו באמצעות צנטריפוגה ותוקנו ב -10% ניטרלית שנאגרו פורמלין. לבסוף, דוגמאות הכלאה ובדק באמצעות זרימת cytometry לגלות נוכחות של סלמונלה spp. כפי שתואר כאן, שלנו "קלטת FISH" הגישה יכולים לספק דגימה פשוטה ומהירה וזיהוי של סלמונלה על משטחים עגבניות. יש לנו גם השתמשו בגישה זו הדגימה סוגים אחרים של תוצרת טרייה, כולל תרד ופלפלים חריפים.

Protocol

1. משטח דגימה עם דבק סטרילי

  1. בחר קלטת לשימוש הדגימה. זמינים מסחרית פטריות קלטת או Con-תאקט, זה קלטות הדגימה סטרילי ארוז במיוחד וקלות השימוש. עם זאת, מצאנו כי הקלטת שקוף (ברור אופטית) משרד גנריות יכול לשמש גם.
  2. השתמש בטוש בלתי מחיק לצייר ריבועים 1 2 ס"מ בצד הלא דביק של חתיכה 10 ס"מ של נייר דבק (תבנית הנייר יכול לשמש). זה ישמש כמדריך חזותי לציין באיזה חלק של הסרט נעשה שימוש במדגם השטח מזון או סביבתיים.
  3. טופס "C" בצורת לולאה של סרט, עם הצד הדביק מול פני השטח להיות שנדגמו. כדי לעשות זאת, החזק את קצוות דביקים עם האגודל והאצבע האמצעית עמדת האצבע על הכיכר נמשך על הגב (לא דביק בצד) של הקלטת (איור 1).
  4. הניחו את הקלטת על פני השטח להיות שנדגמו ולחץ בעדינות את האזור המסומן נגד פני השטח. מבלי לשחרר את הקצוות של הסרט, השתמש האצבע כדי להבטיח את הצד הדביק של הקלטת בא במגע מלא עם משטח המדגם, הימנעות בועות.
  5. שימוש בתנועה אפילו לאט למשוך את הקלטת מן המדגם, פיזית חילוץ משטח הנכנס חיידקים. הדקו את הקלטת תא מטען, הצד הדביק למעלה, גבי זכוכית מיקרוסקופ באמצעות משרד הגנרית סרט שקוף. ודאו כי המתח הנכון / מתיחה של הקלטת כך שטוח, ללא המקומט משטח נוצר. זה יעזור לצמצם בעיות עם דפורמציה / סלסול של הקלטת במהלך החימום הבאים במהלך ההכלאה.

2. מוצק שלב העשרה Miniculture פני הנוזל

  1. שלב מוצק העשרה מבוצע על ידי הצבת את הקלטת עם הפנים כלפי מטה על קסילוז-ליזין Tergitol-4 (XLT-4) צלחות אגר כך התאים שנדגמו ממוקמים במגע ישיר עם השטח אגר. החלק בתבניות קשר / מדגם של הקלטת ממוקם מיושר עם משטח אגר ועל קצה אחד של הקלטת הוא דבק רופף הקיר הצדדי של צלחת פטרי כדי להקל על הסרת קל של הקלטת מפני השטח אגר הבאים העשרה.
  2. צלחות הם הפוכים (כדי למנוע התעבות) ו מודגרות ב 35-37 ° C כדי לאפשר צמיחה מספקת של סלמונלה spp. משך תקופת הדגירה צורך להעשיר את התאים לרמה לגילוי יהיה תלוי ברמות זיהום ראשוני סלמונלה. ראינו היווצרות microcolony מעולה inocula הראשונית נמוכה לאחר 8 שעות העשרה.
  3. לאחר תקופת העשרה הרצוי, לפתוח את צלחת אגר. הקלטת ישמרו לדביקות שלה במהלך הדגירה. לחץ בעדינות את הקלטת נגד אגר באמצעות האצבע כדי להבטיח התאוששות מרבית של microcolonies נוצר על הממשק קלטת אגר. אחוז קלטת מהקצה מחובר לקיר של צלחת פטרי ולהסיר אותו עם בהילוך איטי אפילו,. הר את הקלטת תא מטען, הצד הדביק למעלה, לשקופית מיקרוסקופ, כמתואר בסעיף 1.5 לעיל. המשיכו לשלב "קיבוע והתייבשות" להלן.
  4. עבור miniculture פני הנוזל, מתחילים מהדק את הקלטת המשמש הדגימה לשקופית מיקרוסקופ, כמתואר בסעיף 1.5 לעיל. לאחר מכן, לכסות את החלק בתבניות קשר / מדגם של הקלטת עם תא שאינו סטרילי סיליקון זלוף (Coverwell, גרייס Bio-Labs, Inc), ויצרו תא אטום אשר התחתונה מורכבת קלטת התא טעון, הפונה כלפי מעלה. היטב, אבל בעדינות העיתונות חדר למקום על מנת להבטיח חותם למים.
  5. שימוש בג'ל גמיש טעינת פיפטה קצה, העברת ≤ 500 מרק μL סויה Trypticase או העשרה אחרות בינוני מתאים דרך אחת היציאות קטן של תא מפרצון. חותם בשתי יציאות עם הקלטת למשרד שקוף כדי למנוע אידוי שקופיות דגירה 35 ב -37 ° C לפי הצורך להעשרה מספקת. למרות כל פעולות יש לבצע על פי שיטות דגימה טוב וטיפול, עקרות של סרט נמל איטום או לתאי זלוף אינה נדרשת במהלך miniculture פני הנוזל. השילוב של דגים cytometry זרימה יאפשר אפליה ברורה של Salmonella spp. מתוך אי - יעד חיידקים שעלולים להיות נוכח, עם התרומה הגדולה ביותר של יעד שאינו צומח צפוי לבוא מן המדגם עצמו. המשיכו לשלב "קיבוע והתייבשות" להלן.

3. קיבוע והתייבשות

  1. עבור דגימה משטח ישיר או להעשרת שלב מוצק של סלמונלה spp. על אגר XLT-4, לבצע על קלטת קיבוע התא למשך 30 דקות ב 25 ° C שנאגרו על ידי כיסוי שטח מגע עם מדגם 500 μL 10% נייטרלי פורמלין.
  2. בטל מקבע לתוך מיכל סגר (מתחת למכסה המנוע כימי כדי למזער את החשיפה מעצבן / אדים רעילים).
  3. מייבשים בסדרה אתנול (50%, 80% ו 95%; 300 μL / 3 דקות כל ריכוז). המשיכו לשלב "הכלאה" להלן.
  4. עבור קיבעון של 500 μL מדגם פני הנוזל minicultureים, חדרי זלוף אינן חתומות, ועל קצה גמיש ג'ל טעינת פיפטה משמשת כדי לחלץ את enrichate. Pipetting מהירה למעלה ולמטה משמש כדי להבטיח סילוק יעיל של כל קלטת מחויב התאים הנותרים.
  5. בשלב הבא, כל נפח 500 miniculture μL מועברת צינורית microcentrifuge וסובב אל XG 2000 (5 דקות). Supernatant נמחקת, גלולה היא vortexed 30-60 במרץ עבור s, אז resuspended בנפח שווה של 10% נייטרלי שנאגרו פורמלין. תאים הם קבועים למשך 30 דקות במהירות של 25 ° C.
  6. מקבע לאחר מכן, הוא הסיר את המדגם הוא resuspended במאגר תא אחסון, כדלקמן. המדגם הוא הסתובב לעבר XG 2000 (5 דקות, 25 ° C) supernatant נמחקת, גלולה היא vortexed במרץ עבור 30-60 s, resuspended בנפח שווה של 50% לא מפוגל אתנול-50% פוספט שנאגרו מלוחים. תאים קבוע ניתן לאחסן לזמן בלתי מוגבל (שנים) ב -20 ° C. הערה: בכל פעם נוזלים משתנים (לדוגמה, כאשר החדרת חיץ מקבע או אחרת), חשוב ביסודיות resuspend (עם vortexing) התא גלולה בחלק מזערי (~ 10-20 μL) של מערכת "היוצא" נוזלי . זה יעזור למנוע clumping ולהבטיח כי השעיות אפילו של תאים בודדים מתקבלים. המשיכו לשלב "הכלאה" להלן.

4. הכלאה

  1. הכן הכלאה / כביסה חיץ שימוש מסחרי ביולוגיה מולקולרית כיתה פתרונות ציין בטבלה חומרים. סופי מרכיב ריכוזי חיץ הם 0.7 M NaCl, 0.1 מ 'טריס [pH 8.0], 10 mM EDTA, נתרן גופרתי 0.1% dodecyl, עשה עד נפח הרצוי הסופי עם מים מולקולרית כיתה ו מסונן באמצעות מזרק 0.22 מיקרומטר או לסנן כוס. המאגר זהה, ללא תוספת של בדיקות (ראה להלן) משמש חיץ כביסה. מחממים הכלאה ושטיפת מאגרים על 55 ° C.
  2. הוסף fluorescently שכותרתו Sal3 (Nordentoft et al, 1997;. 5'-AAT CAC TTC ACC TAC GTG-3 ") ו Salm-63 (Kutter et al, 2006;. 5'-TCG ACT GAC TTC AGC TCC-3" ) בדיקות oligonucleotide (לוח חומרים) למאגר הכלאה שחומם מראש. ריכוז בדיקה כוללת של 5 μL -1 ng משמש (למשל 2.5 ננוגרם μL -1 כל בדיקה; Bisha ו-Brehm Stecher, 2009a).
  3. לקבלת דוגמיות העשרה ישיר ל-קלטת מוצק שלב, כיסוי המדגם בתבניות לפנות שטח של הקלטת עם μL 300 של חיץ הכלאה המכיל את קוקטייל בדיקה להכליא תאים קלטת כבול בתא, לח הדגרה אטום מוגדר 55 ° C. אם קשר ישיר חממה כגון מכשיר שקופית חפיר (לוח חומרים) משמש, דוגמאות הכלאה של 15 דקות ו> 20 שקופיות יכול להיות מעובד בו זמנית. אם תנור רוטרי בסגנון הכלאה כגון מכשיר במבינו (לוח חומרים) משמש, מגלשות ממוקמים 50 צנטריפוגות מ"ל צינורות פוליפרופילן עבור הכלאה, שקופית אחת לכל צינור. בגלל העברת החום אינה ישירה, דוגמאות אלה הן הכלאה לתקופות ארוכות (עד 30 דקות).
  4. בעקבות הכלאה, מגלשות מוסרים ואת המכילים בדיקה הכלאה שכבת חיץ נמחקת. שקופיות הן מכן לשטוף קצר בעדינות עם חיץ כביסה שחומם מראש על ידי pipetting נפח קטן של המאגר על שקופית מוטה (3 שטיפות של 300 כל μL), או שטף רשמית (עד 30 דקות) עם כיסוי צדי החיץ כביסה שחומם מראש או טבילה שפופרת 50 מ"ל פוליפרופילן צנטריפוגה המכילה מאגר כביסה שחומם מראש. מניסיוננו, למרות לשטוף רשמי יספק תוצאות משופרות (אובך פחות מ בדיקה מאוגד), פשוט לשטוף היא נאותה לאיתור חד משמעי של Salmonella spp. בשלב הבא, הם שקופיות אוויר יבש לפני שעבר את הצעד "איתור" להלן.
  5. הכלאה של דגימות נוזל miniculture משטח מבוצע על ידי ספינינג מטה דגימות (שאך קבוע או נשמר חיץ אחסון ב -20 מעלות צלזיוס) במשך 5 דקות XG ב 2000, ואחריו vortexing הנמרצת של גלולה ו resuspension במאגר הכלאה μL שחומם מראש המכיל 100 קוקטייל בדיקה. דוגמאות הן הכלאה על 55 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות על גוש חום או דגירה אחרות תחנת מתאים (לוח חומרים), ואחריו תוספת של חיץ כביסה μL 500 שחומם מראש. כמו קלטת מחויב דוגמאות, דוגמאות אלה עשויים להיות שטף רשמית עד 30 דקות עם הדגירה נוסף על 55 מעלות צלזיוס במאגר זה לשטוף, עם vortexing לסירוגין. לחלופין, ניתן דגימות vortexed ביסודיות לאחר תוספת של חיץ כביסה μL 500 שחומם מראש, ואחריו קצירת מיידית לניתוח (להלן).
  6. לקראת זיהוי של סלמונלה spp. דרך cytometry זרימה, נוזל miniculture דגימות פני השטח הם הסתחררו מטה XG 2000 דקות 5, supernatant נמחקת ואת הדגימות resuspended בטמפרטורת החדר 300 μL (~ 25 ° C) PBS. אם דגימות דורשים הובלה למתקן מרוחק, או אם עיכוב צפוי בין הכלאה וניתוח, דגימות יכול להיות בקירור או שנערך על הקרח לפני anaתמוגה. לחלופין, ניתן להעביר דגימות למאגר תא אחסון (50:50 תערובת של PBS ואתנול מוחלט) שנערך -20 ° C עד שבוע ללא הפסד ניכר בדיקה, שמעניקה פלואורסצנטי (Bisha ו-Brehm Stecher, 2009 ב) .

5. איתור

  1. לגילוי על קלטת של סלמונלה spp. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ישיר ל-קלטת או מוצק העשרה דגימות שלב הם overlayed עם ~ 10 בינוני μL H-1200 Vectashield הרכבה המכיל את counterstain גרעיני 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), רכוב עם תלוש כיסוי, מודגרות אז בחושך במשך 10 דקות.
  2. שמן טבילה מושם על להחליק את המכסה, דגימות נבדקות באמצעות המטרה הגדלה גבוהה שמן (63x או 100x). המסנן DAPI משמש כדי להביא את המדגם אל המוקד, מיקרוסקופ מופעלת ואז לסנן את המתאים (ירוק או אדום, תלוי צבע המשמש קצה התווית בדיקות) ותאי סלמונלה הם הבקיע חזותית על פי הקרינה שלהם (איורים 2 ו -3).
  3. לגילוי cytometric של דגימות נוזל miniculture פני השטח, מכשירים שונים עשויים לשמש, בהתאם לזמינות המקומית. במעבדה שלנו, PBS, הושעה דגימות מועברים 5 מ"ל סיבוב תחתית צינורות דגימה (BD פלקון) ובדק באמצעות cytometer תזרים FACSCanto עם עירור ב 647 ננומטר (לוח חומרים). לקבלת דוגמיות מועשר המכיל מספר רב של חיידקים בסך הכל, את "זרימת שיעור נמוך" הגדרת (10 דקות μL -1) משמש 5,000-50,000 אירועים נאספים. הנתונים נותחו באמצעות תוכנה FlowJo (גרסה 8.8.6, עץ Star, Inc, Ashland, OR) או ניתוח אחר תוכנה מתאימה (איור 4, לוחות A ו-B).

6. נציג תוצאות

איור 1
באיור 1. השימוש דבק עבור מדגם של Salmonella spp. מפני השטח של עגבניות מזוהמים באופן מלאכותי.

איור 2
איור 2. תוצאות אופייניות של הדגימה ישיר ל-קלטת זיהוי דגים של סלמונלה Typhimurium ATCC 14028 מפני השטח של עגבנייה (100 X אובייקטיבי שמן). קוקטייל של שתי בדיקה של טקסס אדום שכותרתו בדיקות (Sal3/Salm-63) שימש לתייג את התאים האלה.

איור 3
איור 3. Microcolonies של סלמונלה Typhimurium ATCC 14,028 נוצר על פני השטח של אגר ליזין Tergitol-4 (XLT-4) קסילוז אחרי 8 שעות על קלטת העשרה ב 37 ° C. inoculum הראשוני היה שנדגמו מפני השטח של עגבניות מזוהמים באופן מלאכותי. מוצק שלב העשרה מגדיל את מספר התאים הזמינים עבור איתור גם משפר הסלולר תוכן rRNA.

איור 4
איור 4. השימוש דבק עבור מדגם של ס enterica serovar Typhimurium מפני השטח של עגבניות מזוהמים באופן מלאכותי, ואחריו ניתוח ישיר באמצעות דגים תזרים cytometry (לוח א ') או לאחר 5 שעות ללא סלקטיבית העשרה miniculture נוזלי משטח בתא זלוף מלא 500 μL Trypticase סויה מרק (לוח ב' ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שיטות פשוטה ומהירה לגילוי של פתוגנים על משטחים לייצר עשוי לסייע להפחית מחלות foodborne על ידי מתן מידע עדכני ושימושי. דבק סרט המבוסס על שיטות הדגימה שימשו מיקרוביולוגיה סביבתית, קלינית מזון מאז 1950 וה לערב הקשה של "סקוטש" בסגנון סרט על משטחים לסילוק של מיקרואורגניזמים, ואחריו בדיקה מיקרוסקופית ישירה או העברה של מיקרואורגניזמים חסיד התקשורת מוצק צמיחה (Barnetson & מילן, 1973; Edwards & הרטמן, 1952; Evancho et al, 2001;. Fung et al, 1980;. Lakshmanan & Schaffner, 2005; Langvad, 1980). שינוי לאחרונה תיאר את השילוב של הדגימה סרט המבוסס עם הקרינה הכלאה באתרו (FISH) לניתוח תרבות עצמאית של מיקרואורגניזמים מיישבים את משטחי האבן המונומנטים (La קוניו & C. Urzì, 2003). יש לנו ליישם גישה דומה עבור דגימה מהיר וזיהוי של סלמונלה הנוכחי על תוצרת טרייה, כולל תרד, עגבניות ופלפלים חריפים (Bisha ו-Brehm Stecher, 2009a). דבק ניתן להשתמש כדי להסיר תאים אלו מזונות דגימות אז יכול להיות מעובד לדגים שנצפו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בדרך זו, כמה כמו 10 3 סלמונלה CFU -2 ס"מ (גבול לגילוי שיטות מיקרוסקופיה מבוססת) ניתן להבחין על תוצרת טרייה תוך ~ 1.5-2 ח לחלופין, קצר (8 שעות) enrichments שלב מוצק יכול להתבצע על ידי הנחת פנים התא טעון הקלטת על אגר סלקטיבי, ואת microcolonies כתוצאה זוהה על ידי דג. עד שכיסה את הקלטת עם ≤ 500 התקשורת נוזלי μL, קלטת תאים שנדגמו סלמונלה יכולה להיות מנותקת זוהה מיד לאחר FISH באמצעות cytometry הזרימה (איור 4, לוח א '). דגירה קצר (~ 5 שעות) של אלה שאינם בררנים minicultures נוזלי מאפשר העשרה משמעותית של חיידקים, עם תאים סלמונלה זוהה בקלות תערובות מורכבות של תאים היעד היעד הלא אחרי דגים (איור 4, לוח ב '). ביחד, התוצאות שלנו מראות כי גישה זו מספקת שיטה חדשה מצגת חילוץ, זיהוי חיידקים מסוימים המצויים על גבי עגבניות תוצרת טרייה אחרים. למרות שתיארנו את השימוש של ה-DNA מבוסס בדיקות כאן, סביר להניח כי גישה זו עשויה גם להיות מורחבת כדי לכלול chemistries בדיקה חלופית, כגון חומצות גרעין פפטיד (PNAS), אשר ספציפית סלמונלה בדיקות יש גם תיאר (אלמיידה et al. 2010).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

מימון עבור עבודה זו סופק על ידי פרס לגדול ערכים קרן איווה כדי BFBS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fungi-Tape sampling tape Scientific Device Laboratory 745 http://www.scientificdevice.com/
Con-Tact-It sampling tape Birko Corporation, Denver, CO http://www.birkocorp.com/
Clear office tape, generic Various Should be optically clear, have low intrinsic fluorescence
Food surface Local Grocery Store Tomat–s (red tomat–s on the vine, not waxed or oiled) used here
Trypticase Soy Broth Difco Laboratories 211768 For non-selective liquid surface miniculture enrichment
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base Difco Laboratories 223420 For Salmonella-selective agar (XLT-4)
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement Difco Laboratories 235310 For Salmonella-selective agar (XLT-4)
Formalin solution Sigma-Aldrich HT5011 10% solution, neutral, buffered (cell fixative)
Absolute ethanol Sigma-Aldrich E7023 Molecular biology grade (pre-hybridization dehydration)
1.5 ml microcentrifuge tubes Various RNase- and DNase-free
Microscope slides and cover slips Thermo Fisher Scientific, Inc.
NaCl solution Sigma-Aldrich S5150 Molecular biology grade, 5M solution (hybridization buffer component)
Tris-EDTA buffer solution (100X concentrate) Sigma-Aldrich T9285 1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hybridization buffer component)
Sodium dodecyl sulfate solution Sigma-Aldrich L4522 10% solution in 18 megohm water (hybridization buffer component)
Sal3 and Salm-63 oligonucleotide probes Integrated DNA Technologies 5’-labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) or Texas Red (for microscopy) or Cy5 (for cytometry), HPLC-purified
Variable speed microcentrifuge Various Use rotor diameter to calculate RPM needed for RCF values described in protocol
CoverWell perfusion chamber Grace Bio-Lab Inc. PC1R-2.0 Non-sterile
Gel loading pipette tips (FS MultiFlex) Thermo Fisher Scientific, Inc. 05-408-151 Long, thin tips for easy access to small sampling ports and maneuverability within chamber
Aluminum heat block or precision-controlled heating station Various Eppendorf Thermomixer R dry block heating and cooling shaker used here
Bambino mini hybridization oven Boekel Scientific Model 230300 Slides are placed in 50 ml polypropylene centrifuge tubes for hybridization, heat transfer not direct
Slide Moat slide hybridizer Boekel Scientific Model 240000 Provides rapid, direct transmission of heat through glass slide
Vectashield H-1200 mounting medium with 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Vector Laboratories H-1200 Minimizes quenching of fluorescence during microscopy, provides DAPI counterstain
Fluorescence microscope Various Leitz Laborlux S used here
Digital camera Various Canon PowerShot A640 camera used here
Image acquisition software Various Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) used
Adobe Photoshop Adobe For minimal processing of images (overlay of images taken in different channels)
Flow cytometer Various FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) with red (647 nm) excitation used
Flow cytometry analysis software Various FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Almeida, C., Azevedo, N. F., Fernandes, R. M., Keevil, C. W., Vieira, M. J. Fluorescence in situ hybridization method using a peptide nucleic acid probe for the identification of Salmonella spp. in a broad spectrum of samples. Appl. Environ. Microbiol. 76, 4476-4485 (2010).
  2. Barnetson, R. S., Milne, L. J. R. Skin sampling for Candida with adhesive tape. Br. J. Dermatol. 88, 487-491 (1973).
  3. Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. Simple adhesive-tape-based sampling of tomato surfaces combined with rapid fluorescence in situ hybridization for Salmonella detection. Appl. Environ. Microbiol. 75, 1450-1455 Forthcoming.
  4. Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. Flow-through imaging cytometry for characterization of Salmonella subpopulations in alfalfa sprouts, a microbiologically complex food system. Biotechnol. J. 4, 880-887 (2009).
  5. Edwards, R. W., Hartman, E. A simple technique for collecting fungus specimens from infected surfaces. Lloydia. 15, 39-39 (1952).
  6. Evancho, G. M., Sveum, W. H., Moberg, L. J., Frank, J. F. Microbiological monitoring of the food processing environment. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. Pouch Downes, F., Ito, K. 4th edition, American Public Health Association. Washington, D.C. (2001).
  7. Fung, D. Y. C., Lee, C. Y., Kastner, C. L. Adhesive tape method for estimating microbial load on meat surfaces. J. Food. Prot. 43, 295-297 (1980).
  8. Kutter, S., Hartmann, A., Schmid, M. Colonization of barley (Hordeum vulgare) with Salmonella enterica and Listeria spp. FEMS Microbiol. Ecol. 56, 262-271 (2006).
  9. La Cono, V., Urz, C. Fluorescent in situ hybridization applied on samples taken with adhesive tape strips. J. Microbiol. Meth. 55, 65-71 (2003).
  10. Lakshmanan, C., Schaffner, D. W. Understanding and controlling microbiological contamination of beverage dispensers in university foodservice operations. Food Prot. Trends. 26, 27-31 (2005).
  11. Langvad, F. A simple and rapid method for qualitative and quantitative study of the fungal flora of leaves. Can. J. Microbiol. 26, 666-670 (1980).
  12. Nordentoft, S., Christensen, H., Wegener, H. C. Evaluation of a fluorescence-labelled oligonucleotide probe targeting 23S rRNA for in situ detection of Salmonella serovars in paraffin-embedded tissue sections and their rapid identification in bacterial smears. J. Clin. Microbiol. 35, 2642-2648 (1997).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics