流式细胞仪定量测定GLUT4转位到质膜

Published 11/07/2010
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Biology
 

Summary

该协议描述了一种快速的技术量化从细胞质GLUT4转位的流式细胞仪检测细胞质膜。

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Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (45), e2429, doi:10.3791/2429 (2010).

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Abstract

葡萄糖是身体能量的主要来源,因此需要不断调节其血药浓度。胰岛素由胰腺释放诱导胰岛素敏感的组织中,最引人注目的是大脑,骨骼肌和脂肪细胞对葡萄糖的摄取。患有2型糖尿病和/或肥胖的患者往往胰岛素抵抗和无法控制自己的血糖平衡。进入新的见解胰岛素抵抗的机制,可能为2型糖尿病提供新的治疗策略。

过剩的葡萄糖转运家族由十三名成员,分布在不同的组织遍布全身 1 。胰岛素敏感组织,如骨骼肌介导的葡萄糖摄取葡萄糖转运子4(GLUT4)是主要的转运。胰岛素与其受体的结合后,囊泡含有GLUT4的易位从细胞质到质膜,诱导葡萄糖的摄取。降低GLUT4转位是在2型糖尿病2,3中的胰岛素抵抗的原因之一。

从细胞质到质膜的GLUT4转位可通过免疫组织化学显示,使用荧光标记的GLUT4的特异性抗体。

在这里,我们描述了一个量化的GLUT4转位的总金额在选定的时间细胞质膜的技术,用流式细胞仪检测。此协议是快速(不少于4小时,包括孵化与胰岛素),并允许少3000细胞,或在一次实验中多达1万个条件细胞的分析。它依赖于外部抗原表位的转运反GLUT4的抗体绑定到它,因为它是暴露后易位到质膜的细胞外介质尽快。

Protocol

1。细胞染色

  1. 准备细胞。同时,仍在积极成长(60 - 80%汇合),应采用细胞。血清的细胞饿死在一夜之间,在0.5毫升血清在24孔板和孵化器的媒介,每口井0.1万盘他们的细胞(37℃,5%的CO 2)为30分钟- 2小时恢复从胰蛋白酶。
  2. 混合小学和中学的抗体。混合(5μL的主要反GLUT4的抗体与1μL,中学鸡抗山羊IgG抗体结合AlexaFluor 488)x水井数。孵育10分钟在室温下,在黑暗中。
  3. 准备培养基中稀释的胰岛素2X工作股票。
  4. 检查,如果细胞已加入或不。
  5. 轻轻加入6μL抗体混合胰岛素2X工作股票和0.5毫升含有细胞的井。避免任何介质的动荡。孵育(37 ° C,5%的CO 2)为30分钟,在黑暗中。
  6. 每孔加入0.5 mL的PBS + 1%PFA无晃动的细胞,修复细胞。孵育20分钟在室温下,在黑暗中。
  7. 如果你的细胞一直坚持到井,轻轻抬起一个细胞起苗。转移到适合您的流式细胞仪,离心沉淀细胞管细胞(共1毫升)。
  8. 洗为0.4 mL PBS用1 mL PBS和重新悬浮颗粒的两倍+ 1%的煤灰。此时,细胞可在铝箔包裹,并储存在冰箱中(4-8 ° C),或采取即时数据采集的流式细胞仪。

2。数据采集

  1. 设置一个广泛的门,围绕在侧散射(SSC)与前向散射(FCS)的面板的活细胞。使用负管(不与胰岛素或细胞“染色”的同型对照治疗的细胞),设置FL1参数。确保您的高峰期是在面板上,而不是完全切下侧。
  2. 至少10000个管细胞获取数据。

3。数据分析

  1. 在SSC和FSC面板(图1A)活细胞周围绘制一个门。 AlexaFluor 488荧光强度与的活细胞门内的细胞(图1B)数绘制的直方图。您可以覆盖不同的直方图,直观的差异,但定量分析,确定每个单元的人口的平均数和中位数的荧光强度,并使用这些数字,你的比较(图1C)。
  2. 规范化数据在胰岛素的情况下得到的数值,在图1C和1D所示。

4。代表性的成果

从一个健康的人(无胰岛素抵抗)中分离出的成肌细胞,胰岛素诱导的GLUT4从质膜的细胞质中(图1,左)的剂量依赖性易位。与此相反,胰岛素不诱导GLUT4转位与胰岛素抵抗的患者(图1,右)从孤立的成肌细胞的细胞膜。

图1
图1。染色实验的例子。成肌细胞是从捐助者无胰岛素抵抗(左)与胰岛素抵抗的患者(右)从孤立的,SSC(侧散射)与FCS的(前向散射)情节与门周围的细胞,B细胞,门控一,对外部抗原表位的GLUT4的抗体染色,并留下未刺激(红色)或刺激胰岛素(蓝色)1纳米,10纳米(橙色),或100纳米(绿色)。对于图的清晰度,我们只显示数据没有与100纳米胰岛素与胰岛素抵抗的细胞 C,平均荧光强度(MFI)在B所示的直方图规范化左未刺激细胞的MFI(无胰岛素) 。 研发 ,小额信贷机构的规范化直方图数据的图形显示在B

Discussion

我们已经证明了量化从细胞质流式细胞仪检测细胞质膜的GLUT4转位的快速技术。

GLUT4的是瞬时表达细胞的细胞膜内吞。由于仍然连接到GLUT4的内吞作用,即使在绑定的抗体,荧光信号给总额的GLUT4在细胞膜暴露在胰岛素存在的时间选择在孵化。

这种技术也可以应用于其他蛋白质的研究,从一个细胞内舱质膜的易位,提供了一个很好的向外部利益的蛋白质抗原表位的抗体。例如,一个类似的实验是现在常用的评估细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞脱颗粒率,测量他们质膜4,5 CD107a易位。磷脂酰丝氨酸从质膜的外侧在细胞凋亡或坏死的内侧易位还可以通过流式细胞仪检测,采用荧光标记的Annexin V的6。

除了速度的测定,流式细胞仪提出了允许在混合细胞群的质膜蛋白质易位研究的优势。事实上,我们可以结合染色细胞亚群的标记和感兴趣的蛋白质,多激光流式细胞仪数据采集。

该协议第1.2段中抗体的金额起点,我们建议你与你的细胞滴定的抗体,以确定最低的抗体浓度,为您提供了最大的信号。一个很好的起点主抗人GLUT4的抗体,我们这里使用的范围,将1-10μL每管(即0.2-2微克每管抗体),每管含有不超过1亿个细胞。对于其他的主要抗体,是指供应商的指示。

细胞自体荧光会有所不同从捐助者,捐助者和实验,实验数据的规范化是必要的的。

Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgements

从夫人祈福长老白格雷厄姆的赠款支持这项工作是由资助研究基金和美国国立卫生研究院(AR059838)CB,由美国国立卫生研究院(AR052791,AR044387复苏法案,NS063298)LTT和贝勒医学院医学流式细胞仪和细胞分选的资金来自美国国立卫生研究院(NCRR S10RR024574,NIAID的AI036211,美国国立癌症研究所P30CA125123)的核心。内容完全是作者的责任,并不一定代表美国国立卫生研究院的官方意见。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-human GLUT4 antibodies Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-1606 Against an external epitope of GLUT4
Chicken anti-goat IgG conjugated to AlexaFluor 488 Invitrogen A-21467
Recombinant human insulin Sigma-Aldrich I2643
Cell lifters VWR international 29942-118 Cut to fit the wells
5 ml tubes for FACS VWR international 60819-138 Fit all BD machines

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References

  1. Zhao, F. Q., Keating, A. F. Functional properties and genomics of glucose transporters. Curr. Genomics. 8, 113-128 (2007).
  2. Karnieli, E., Armoni, M. Transcriptional regulation of the insulin-responsive glucose transporter GLUT4 gene: from physiology to pathology. Am. J. Endocrinol. Metab. 295, 38-45 (2008).
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  5. Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutellingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V. J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).
  6. Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry A. 77, 705-713 (2010).

Comments

1 Comment

  1. I am interested with with this method. Thank you very much for very interesting protocol.
    Currently I work with 3T3-L1 adipose cell line to investigate adipogenesis and insulin resistance for my research project. I am planning to do Glut4 translocation assessment in mature adipose cell line culture.
    I am wondering if this method can be used for glut4 translocation assesment in 3T3 adipocyte mature cells since in this case, I have to wait until the cells reach 100% confluency and the lipid droplet accumulation occurred after 4-8 days post confluence. Is it possible to use this protocol? If possible, could you give me suggestion how to do it?
    I am looking forward to your response. Thank you for your help.

    Reply
    Posted by: afiat b.
    July 18, 2013 - 3:52 AM

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