该协议描述了一种快速的技术量化从细胞质GLUT4转位的流式细胞仪检测细胞质膜。
葡萄糖是身体能量的主要来源,因此需要不断调节其血药浓度。胰岛素由胰腺释放诱导胰岛素敏感的组织中,最引人注目的是大脑,骨骼肌和脂肪细胞对葡萄糖的摄取。患有2型糖尿病和/或肥胖的患者往往胰岛素抵抗和无法控制自己的血糖平衡。进入新的见解胰岛素抵抗的机制,可能为2型糖尿病提供新的治疗策略。
过剩的葡萄糖转运家族由十三名成员,分布在不同的组织遍布全身 1 。胰岛素敏感组织,如骨骼肌介导的葡萄糖摄取葡萄糖转运子4(GLUT4)是主要的转运。胰岛素与其受体的结合后,囊泡含有GLUT4的易位从细胞质到质膜,诱导葡萄糖的摄取。降低GLUT4转位是在2型糖尿病2,3中的胰岛素抵抗的原因之一。
从细胞质到质膜的GLUT4转位可通过免疫组织化学显示,使用荧光标记的GLUT4的特异性抗体。
在这里,我们描述了一个量化的GLUT4转位的总金额在选定的时间细胞质膜的技术,用流式细胞仪检测。此协议是快速(不少于4小时,包括孵化与胰岛素),并允许少3000细胞,或在一次实验中多达1万个条件细胞的分析。它依赖于外部抗原表位的转运反GLUT4的抗体绑定到它,因为它是暴露后易位到质膜的细胞外介质尽快。
我们已经证明了量化从细胞质流式细胞仪检测细胞质膜的GLUT4转位的快速技术。
GLUT4的是瞬时表达细胞的细胞膜内吞。由于仍然连接到GLUT4的内吞作用,即使在绑定的抗体,荧光信号给总额的GLUT4在细胞膜暴露在胰岛素存在的时间选择在孵化。
这种技术也可以应用于其他蛋白质的研究,从一个细胞内舱质膜的易位,提供了一个很好的向外部利益的蛋白质抗原表位的抗体。例如,一个类似的实验是现在常用的评估细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞脱颗粒率,测量他们的质膜4,5 CD107a易位。磷脂酰丝氨酸从质膜的外侧在细胞凋亡或坏死的内侧易位还可以通过流式细胞仪检测,采用荧光标记的Annexin V的6。
除了速度的测定,流式细胞仪提出了允许在混合细胞群的质膜蛋白质易位研究的优势。事实上,我们可以结合染色细胞亚群的标记和感兴趣的蛋白质,多激光流式细胞仪数据采集。
该协议第1.2段中抗体的金额起点,我们建议你与你的细胞滴定的抗体,以确定最低的抗体浓度,为您提供了最大的信号。一个很好的起点主抗人GLUT4的抗体,我们这里使用的范围,将1-10μL每管(即0.2-2微克每管抗体),每管含有不超过1亿个细胞。对于其他的主要抗体,是指供应商的指示。
细胞自体荧光会有所不同从捐助者,捐助者和实验,实验数据的规范化是必要的的。
The authors have nothing to disclose.
从夫人祈福长老白格雷厄姆的赠款支持这项工作是由资助研究基金和美国国立卫生研究院(AR059838)CB,由美国国立卫生研究院(AR052791,AR044387复苏法案,NS063298)LTT和贝勒医学院医学流式细胞仪和细胞分选的资金来自美国国立卫生研究院(NCRR S10RR024574,NIAID的AI036211,美国国立癌症研究所P30CA125123)的核心。内容完全是作者的责任,并不一定代表美国国立卫生研究院的官方意见。