Nanoformulated Antiretroviral 약물의 혈액 본 대식 세포 캐리지를위한 방법 개발

* These authors contributed equally
Bioengineering
 

Summary

indinavir, ritonavir, efavirenz 및 atazanavir의 Nanoparticles 야한 밀링, 균질화 및 ultrasonication를 사용하여 제조되었습니다. 이러한 nanoformulations, 집합 대식 세포 기반 약물 전달을 평가 antiretroviral 치료 (nanoART)를 nanoformulated 칭했다. 단핵구 - 대식 세포의 파생 nanoART의 이해, 유지 및 지속적인 릴리스가 결정됩니다. 이러한 예비 연구 임상 사용 nanoART의 가능성을 제안한다.

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Balkundi, S., Nowacek, A. S., Roy, U., Martinez-Skinner, A., McMillan, J., Gendelman, H. E. Methods Development for Blood Borne Macrophage Carriage of Nanoformulated Antiretroviral Drugs. J. Vis. Exp. (46), e2460, doi:10.3791/2460 (2010).

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Abstract

antiretroviral (ART) 약물에 대한 약물 toxicities을 줄이기 위해 또한 제공하면서 Nanoformulated 약물 pharmacodynamics와 생체 이용률을 향상시킬 수 있습니다. 이를 위해, 저희 연구실 예술의 regimens을 단순화하는 nanomedicine의 원칙을 적용하고 준수 및 약물 pharmacokinetics을 개선하면서 같은 toxicities을 줄일 수 있습니다. 제조 nanoformulated ART (nanoART)에 대한 간단하고 신뢰할 수있는 방법이 표시됩니다. 순수한 약물의 입자 계면 활성제의 지질 코팅의 얇은 층에 의해 캡슐과 서부 유럽 표준시 밀링 또는 고압 균질에 의해 작은 것들로 큰 약물 결정 fractionating에 의해 생산됩니다. 다른 방법으로 무료로 약물은 고분자의 비말에서 일시 중지되었습니다. 본, 마약은 개별 nanosized 방울이 형성되기 전까지는 다음 ultrasonication에 의해 흥분 폴리머 내에 해산합니다. 동적 광 산란 및 현미경 검사는 입자 (입자 크기, 요금과 모양)의 물리적 특성을 특징. 그들의 생물 학적 속성 (세포 이해 및 유지, 세포 독성 및 antiretroviral 효능)이 인간 단핵구 파생 macrophages (MDM)로 결정됩니다. MDM은 정화를위한 원심 elutriation를 사용 leukopacks에서 분리된 인간의 말초 혈액 monocytes에서 파생됩니다. 이러한 혈액을 매개로 macrophages 인간 면역 결핍 바이러스에 nanoART 배포 (HIV)에 감염된 장기 세포 전송기로 사용할 수 있습니다. HIV - 1 치료에 대한 임상 nanoparticles로 사용할 수 antiretroviral 약물의 repackaging하는 준수를 개선하고 적극적으로 질병 결과에 영향을 미칠 수있는 것을 우리는 멋부리다.

Protocol

NanoART 제조

1. NETZSCH MicroCer 방법으로 습식 밀링 NanoART

  1. 분석 균형을 사용하여 nanoformulations을 10 MM의 Hepes 버퍼, 완전히 분산된까지 T - 18 Ultraturrax 믹서를 사용하여 pH를 7.8으로 그들을 혼합하는 데 사용됩니다 마약 결정 및 각종 계면 활성제의 무게를. 2퍼센트 - 배합에있는 약물의 비율은 1 사이 여야합니다.
  2. 연속 밀링 들어, 냉각기와 압축기가 켜져 있는지 확인합니다. 콘센트 압력 밀 샘플를 시작하기 전에 100 PSI 주위해야합니다.
  3. 제어 장치의 전원을 켜고 연삭 미디어가 탱크에 로드할 수 있도록 연삭 탱크를 돌린다.
  4. 깔때기를 사용하여 분쇄 실로 구슬 50 ML을 추가합니다. 기계 밀봉의 누수를 방지하기 위해 연삭 챔버 밖의 스레드 또는 어디에 비즈가 없는지 확인합니다.
  5. O - 링은 밀링 챔버에 그 자리에 있는지 확인합니다. 적절한 화면 메쉬 크기를 선택하고 적절한 덮개 어셈블리를 사용하여 너트를 조이고하여 뚜껑을 확보. 화면 메쉬 크기는 구슬의 절반 이상 크기는되어야합니다. 연속 밀링 동안 필터를 막히는에서 제품을 피하기 위해 대형 스크린 메쉬 크기를 사용합니다.
  6. 챔버의 상단에 제공하는 노브를 사용하여 수평하고 있는지 확인하기 위해 연삭 챔버 로우어 그 수집 용기에 제품 아울렛 튜브하라.
  7. 제품 입구에 계면 활성제의 다양한 양의와 약물 중지를 추가합니다. 정지의 최소 부피는 100 ML해야합니다. 이것은 과열에서 밀링 챔버를 방지하고 또한 인해 부품에 덜 입고 비드 오염을 방지합니다
  8. 제어 장치를 사용하여 펌프를 시작합니다. 유속이 같은 제제 (- 150 ML / 분 ~ 50)에 필요한 다양한 수 있습니다.
  9. 에 교반기를 켜고 제어 장치의 속도를 조정합니다. 속도는 620 RPM에서 MicroCer에서 4320 RPM을 증가 수 있습니다. 분쇄 챔버의 상단에 부착되며 과열 없다는 것을 확인하는 온도 게이지를 사용하여 온도를 모니터링합니다.
  10. 다양한 속도 및 유량 밀 앳 샘플과 회절 광 산란 브룩 헤 이븐 Zetasizer (표 1)을 사용하여 크기와 비용 측정을위한 배합의 작은 aliquots (~ 1 ML)을 데리고 나가.
  11. 원하는 크기를 얻을되면 제어 장치를 사용하여 밀링를 중지합니다. 아직도 펌프로 플라스크에 샘플을 수집합니다. 마약 완전히 샘플 수집 플라스크에 유출하도록 허용합니다.
  12. 펌프를 전환합니다. 구슬을 제거하려면, 장치 아래 컬렉션 트레이를 놓으십시오. 덮개 어셈블리의 전면 판에있는 너트를 풀어 트레이에서 비즈를 수집합니다. 전면 플레이트를 벗고 트레이에 비즈를 씻어 탈이온수 병을 사용합니다.
  13. 50 ML의 원심 분리기 튜브로 가공된 정지를 전송하고 30 분 10,000 RPM (10,174 RCF)로 원심을 설정합니다. 원심주기 완료되면 뜨는의 양을 측정하고 신선한 계면 활성제 솔루션의 동일한 금액과 바꿉니다.
  14. resuspension가 완료되면, 밀링 챔버 10 분 공장에 현탁액을 전송하기만하면됩니다. 나누어지는를 (~ 1mL) 가지고 Zetasizer (표 1)를 사용하여 다시 표본의 크기와 요금을 측정합니다.
  15. 탈이온수 및 70 % 에탄올을 사용하여 MicroCer의 게시물을 사용 청소를 수행합니다.
  16. HPLC를 사용하여 nanoART 공법의 농도를 측정합니다. 우리의 경우에는 우리는에 의해 샘플이 C8 가드 카트리지와 YMC Octyl C8 컬럼 (워터스 주식 회사, 밀퍼드, MA)에 세중의 20 μL 주사를 사용하여 위상 HPLC를 반대로 평가. 48%의 acetonitrile / 52% 25mM KH 2 PO 4, pH를 4.15로 구성된 모바일 단계는 272 nm의에서 UV / 비스 감지 0.4 ML / 분 펌프 있습니다. 모든 약물 측정, quantitation는 메탄올에서 준비 각각 무료로 약물 (0.025-100 μg / ML)의 표준 곡선과 비교에 의해 결정됩니다.

2. Avestin EmulsiFlex C5를 사용하여 NanoART의 균질화

  1. 분석 균형을 사용하여 nanoformulations을 10 MM의 Hepes 버퍼, 완전한 분산을 얻을 수있는 T - 18 Ultraturrax 믹서를 사용하여 pH를 7.8으로 그들을 혼합하는 데 사용됩니다 마약 결정 및 각종 계면 활성제를 측정합니다.
  2. homogenizing 선박에 정지를 전송하고 재순환을 시작합니다. 냉각기 전에 샘플을 균질 시작에 있는지 확인
  3. m는 20,000 ± 2,000 PSI를 읽고 대상 입자 크기를 얻을 때까지 균질 계속 점차 때까지 압력을 높이십시오. 60분 - 이것은 보통 45 사이에 걸립니다. 주기적으로 나누어지는를 (~ 1mL) 타고 Zetasizer (표 1)를 사용하여 샘​​플의 크기와 요금을 측정합니다.
  4. 50 ML의 원심 분리기 튜브로 균질 화기의 균질 현탁액을 전송하고 30 분 10,000 RPM (10,174 RCF)로 원심을 설정합니다. 완료되면원심주기, 뜨는의 양을 측정하고 신선한 계면 활성제 솔루션의 동일한 볼륨으로 바꿉니다.
  5. resuspension 후, C5 균 질기에 현탁액을 전송하기만하면됩니다. 순환을 다시 시작하고 20,000 ± 2,000 PSI에 homogenizing 압력을 반환하고 30 분 균질. Zetasizer (표 1)를 사용하여 수립의 크기와 요금을 측정합니다.
  6. 용매로 탈이온수 및 에탄올과 함께 기기의 게시물 청소를 수행합니다.
  7. HPLC를 사용하여 샘​​플의 농도를 측정합니다.

3. 콜 파머 초음파 프로세서를 사용하여 Sonication

  1. 유리 비커에 dichloromethane 50 ML을 측정합니다. 전체 해산이 관찰 때까지 분석 밸런스를 사용하는 폴리의 측정 6g (락트 - 공동 glycolic의 산성) (PLGA)는 dichloromethane에 추가하고 섞는다.
  2. 약물 결정의 1.25 g을 측정하고 dichloromethane / PLGA 솔루션에 추가할 수 있습니다. 전체 해체를 얻기 위해 섞는다.
  3. 1 % 폴리비닐 알코올 (PVA) 계면 활성제 솔루션을 만들어 얼음 욕조를 사용하여 냉각. 계면 활성제 용액은 물에 약품을 포함하는 유기 용액의 추가되기 전에 냉각되었는지 확인합니다.
  4. 1퍼센트 PVA 계면 활성제 용액에 약물 솔루션을 붓고 50 %의 진폭에서 ultrasonicator를 시작합니다. 계면 활성제 솔루션 얼음 욕조에 배치되었는지 확인합니다. sonicator의 진폭은 샘플의 작은 배치를위한 ~ 30 %의 진폭을 줄일 수 있습니다. 10 분 동안 샘플을 Sonicate.
  5. 입자 크기 분석 (표 1)을위한 작은 나누어지는 (~ 1 ML)를 꺼내주세요. 입자의 크기가 1.5 μm의보다 큰 경우, 총 16분 최대까지 2 분 간격으로 샘플을 sonicate. 20x 및 문서 관측 (그림 1A)에서 현미경으로 표본을 관찰합니다.
  6. 나머지 정지에 대한 적절한 소용돌이를 만들고 실온에서 하룻밤 믹싱 계속 저어 접시를 사용합니다.
  7. 플라스크에 8g mannitol의 무게를 80 ML의 RO 물을 추가합니다. 전체 해산이 관찰 때까지 섞어 실온에서 저장합니다. 샘플은 동결 건조된해야하는 경우이 원심 분리 후 resuspension에 사용됩니다.
  8. 24 시간 후에 정지를 수집 50 ML의 원심 분리기 튜브에 부어. 5 20 분 동안 8,000 RPM의 속도로 샘플을 원심 ° C. 필터링 역방향 삼투 (RO) 물 0.5 % cetyl trimethylammonium의 브로마이드 (CTAB) 계면 활성제의 75 ML에있는 다른 반쪽의 75 ML에 뜨는 및 resuspend 절반 샘플을 가만히 따르다.
  9. 5 ° C에서 20 분 동안 8,000 RPM의 속도로 다시 샘플을 원심 분리기 20 ML mannitol 용액의 총 알약 각각 resuspend.
  10. 두 번째 resuspension 후, Zetasizer (표 1)를 사용하여 입자의 크기를 측정합니다.
  11. 나머지 정지를 전송하고 lyophilizer에 그들을 배치 적합한 튜브를 사용하십시오.
  12. HPLC를 사용하여 샘​​플의 농도를 측정합니다.

4. NanoART의 형태론

  1. nanoART 서스펜션을 가지고 간략하게 sonication 프로브 5 초 동안 20 %의 진폭에 sonicate. 1.7 ML의 microcentrifuge 관 10 초 와동 내에 RO 물 1.5 ML로 정지 10 μL을 전송합니다.
  2. 물 nanoART 솔루션과 0.2 μm의 폴리 카보 네이트 막 여과 (Nuclepore 트랙 새기)과 조립 Swinnex 13 폴리 프로필렌 필터 홀더로 구성된 여과 장치로 전송 50 μL 샘플을 가져가라. 여과 장치는 전에 희석 약물 중단의 추가에 증류수를 필터링 50 μL 0.2μm로 준비하는 것입니다. 전체 솔루션 볼륨이 완전히 여과 막 과거 뽑아 때까지 진공은 다음 장치에 적용됩니다.
  3. 멤브레인가 건조되면, 그것은 두 스틱 도전성 카본 테이프를 사용하여 알루미늄 핀 스텁에 부착된하고 팔라듐과 코팅 스퍼터. 표본 스텁은 다음의 경우, JEOL JSM6300F 낮은 전압, 전계 방출 주사 전자 현미경 (그림 2)에서 사용 군데 있습니다.

5. NanoART 시각화

  1. 준비 nanoART의 suspensions를 타고 sonication 프로브와 함께 20 % 진폭에서 10 초 동안 그들을 sonicate.
  2. 실수로 거꾸로 현미경에 배치 현미경 슬라이드 커버를 가져가라. 커버 슬립에 인산염의 100 μL와 nanoART 정지 중 15 μL가 생리 버퍼링 (PBS)와 여러 번을 pipetting 아래로 혼합 섞는다. 20x 목표 (그림 3)를 사용하여 nanoparticles를 떠올.

nanoART의 생물학

6. 혈액 단핵구와 단핵구 본 파생 Macrophages (MDM)의 분리 및 준비

  1. HIV - 1과 간염 seronegative의 기증자로부터 leukapheresis로 인간 monocytes을 확보하고 카운터 전류 원심 elutriation하여 세포를 정화. 안티 CD68 (클론 KP와 immunolabeling하여 세포 순도를 평가라이트 묻은 cytospins 1 -1).
  2. DMEM 문화 정화 monocytes는 1x10의 농도에서 10 %의 열 inactivated 풀링된 인간의 묘약, 1 %의 글루타민, 50 μg / ML gentamicin 10 μg / ML * 시프 로플 록 사신 1000 U / ML 재조합 인간 세포 대식 세포 콜로니 자극 인자 (MCSF)와 보충 37 6 세포 / ML ° 5% CO 2 humidified 분위기에서 C. 순서에 7 일 동안 6 잘 접시와 문화 세포에서 잘 당 플레이트 2x10 6 전지는 monocytes가 macrophages 1로 차별화 수 있습니다. (그림 3A)

7. 세포 이해와 수집

  1. 100 μm의의 최종 농도 문화 미디어 nanoART을 (MCSF없이) 혼합 각 잘하는 치료 매체 1 ML를 추가합니다.
  2. 에서 시점, 또는 언제 세포가 완전히 nanoART (그림 2)와 함께 로드된를 원하는 모든 치료 매체를 제거하고 세포에서 찍은되지 않은 입자를 제거 1 ML PBS로 세포에게 3 회 씻는다. PBS 1 ML에서 셀 리프터를 사용하여 우물의 바닥에서 자기편 세포를 제거하고 1.7 ML의 microcentrifuge 관 2-4으로 그들을 놓으십시오.
  3. 4 천 RCF에서 세포를 원심 ° C 10 분. 뜨는를 제거하고 100 % 메탄올 200 μL를 추가합니다. 세포를 Lyse 20 %의 진폭에서 sonicating 프로브와 펠렛을 sonicating (2~5초) 짧게하여 nanoART을 풀다. -80의 상점 샘플 ° C 약물 내용을 분석하는 준비까지.

8. NanoART의 세포내 유지

  1. 으로 7.1에서 설명한 MDM을 처리합니다.
  2. 원하는 시점에로 7.2에 설명된 세포를 씻고, 대신 즉시 세포를 근근이 살아가고의 0.1 M 인산 완충액 (산도 7.4)의 3 % 글루 타 알데히드의 용액에 실온에서 15 분에 대한 세포를 수정하고 추가로 10을 수정 0.1 M 인산 완충액 (pH는 7.4)에 1 % 오스뮴의 tetroxide로 분.
  3. 으로 7.2에서 설명한 1 ML PBS에 정착액 및 다쳤고, 세포를 제거합니다. 또한, 수집 및 7.2에 설명된 것과 같이 세포를 원심 분리기, 대신 펠렛에 메탄올을 추가, 글루 타 알데히드 정착액 솔루션 200 μL를 추가합니다.
  4. 마이크로톰로 얇은 (8​​0 NM) 섹션으로 세포 펠릿 컷. uranyl 아세테이트와 리드 구연 산염으로 섹션을 얼룩. 전송 전자 현미경 (그림 4)를 사용하여 스테인드 섹션을 관찰.

9. ART 릴리스

  1. 7.1-7.2에서 설명한대로 세포를 치료하지만, 대신 세탁 후 세포를 수집, MCSF없이 nanoART없이 두 ML의 세포 배양 매체와 PBS를 교체하십시오.
  2. 표시 일, 또는 매체의 노란색, 교환 절반을 돌려 세포 배양 매체에 의해 지적했다.
  3. 원하는 하루로 7.2-7.3에 설명된 복제 세포와 함께 세포 매체 1 ML를 수집합니다.
  4. 프로세스 세포는 7.3에서 설명한. 10 초 동안 최대 속도 100 %의 메탄올과 와동 1 ML 중간 샘플 150 μL를 추가하여 프로세스 매체. 그런 다음 10 분 21,000 RCF에서 샘플을 원심 분리기. 뜨는을 제거하고 새 튜브로 전송할 수 있습니다. 진공 원심 분리기와 메탄올을 증발, 이것은 1에서 샘플에 따라 4 시간 걸릴 수 있습니다. -80 ° C에서 약물 분석을위한 준비까지 매장 샘플.

10. 공촛점 현미경으로 NanoART의 실시간 이해

  1. 단계 6.2 및 레이블에서 성숙 MDM을 가지고 제조의 지시 아래 Vybrant 세포 라벨링 솔루션과 같은 세포 라벨링 솔루션을 사용하여 셀. 세포에게 초과 염료를 제거하는 문화 매체 1 ML을 사용하여 3 번 린스.
  2. 찬란 분류 nanoART를 사용하는 단계 7.1에서와 같이 배지와 nanoART를 섞습니다.
  3. 공촛점 현미경으로 영상을 바로 전에 표시된 nanoART 치료 매체를 추가합니다. 이미지에게 60x 목표 5 (동영상 1 & 2)를 사용하여 4 시간 동안 30 초마다를 캡처합니다.

HIV - 1 감염과 감염의 Assays

11. HIV - 1 감염 ADA

  1. 로 9.1-9.3에서 설명하는 세포를 처리합니다.
  2. 0.01 바이러스성 입자 / 24 시간 1을위한 세포 및 부화의 감염의 다중성에서 HIV - 1 맥도날드를 포함, MCSF없이 원하는 일, 모든 매체를 제거하고 매체 교체하십시오. 바이러스 매체를 제거하고 신선한, 바이러스 무료 미디어 바꿉니다. 10 일간 문화 전지는 매일 절반 매체를 교환하거나 6 (그림 5) 세포를 살아있는 유지하는 필요한.
  3. 열흘 후 감염 96 - 웰 플레이트에 각 자, 장소에서 중간 10 μL를 수집하고, -80 ° C에서 저장 retroviral (역방향) transcriptase 분석을 수행하기 위해 준비까지.

12. 리버스 Transcriptase (RT) 어세이

  1. 단계 11.3에서 각 10 μL 샘플, 100 MM 트리스 - HCL (산도 7.9), 300 MM KCl, 10 MM DTT, 0.1 % nonyl phenoxylpolyethoxylethanol - 40 (NP - 40) 및 물을 포함하는 솔루션을 10 μL를 섞는다. 37 ° C 7 15 분 동안이 혼합물을 품어.
  2. i>을 다음 50 MM 트리스 - HCL (산도 7.9), 150 MM KCl, 5 MM DTT, 15 MM MgCl 2, 0.05 % NP - 40, 10 μg / ML 폴리 (A), 0.250을 포함하는 솔루션을 25 μL를 추가 37 U / ML oligo D (T) 12-18, 각 잘하고 품어 10 μCi / ML 3 H ​​- TTP ° 18시간 7 C.
  3. 부화 다음 각 잘하는 얼음처럼 차가운 10% trichloroacetic 산 (TCA) 50 μL를 추가합니다. 유리 섬유 필터에 우물을 수확하고, β - 섬광 분광 7 H - TTP의 설립에 대한 필터를 평가합니다.

13. HIV - 1p24의 탐지

  1. retroviral transcriptase 매체 샘플은 PBS 3 회 중 1 ML과 rinsing하여 단계 11.3에서 제거하는 복제 세포를 씻으십시오.
  2. 4 밤새 4 % paraformaldehyde로 세포를 고정 ° C. 다음날 아침은 PBS로 세포를 3 번​​ 씻어.
  3. HIV 감염을 시각화 (1시 10분, Dako, 카핀테리아, CA) HIV - 1 p24 단클론 항체에 마우스를 사용합니다. 40x 목표 (그림 6)를 사용 명시야 아래의 이미지 세포.

14. 대표 결과 :

마약 크기
(NM)
PDI 요금
(MV)
계면 활성제
IDV 1052 0.286 -24.58 0.5 % P188, 5.0 % SDS, 9.25 %의 자당
RTV 233 0.273 -7.47 0.5 % P188, 9.25 %의 자당
ATZ 840 0.192 25.47 0.5 % P188, 0.1 % MPEG 2000 DSPE, 1.0 %의 DOTAP, 9.25 %의 자당
EFV 347 0.235 -13.52 1.0 % PVA

nanoART 표 1. 물리적 특성
테이블 nanoART 공법의 물리적 특성에 대한 잠재적인 대표 값이 지정된 계면 활성제를 사용하여 제조가 표시됩니다. 값이 흩어져 빛의 강도, polydispersity 지수 (PDI, 입자 크기 분포의 추정), 그리고 다양한 nanoformulation 샘플 얻은 제타 전위 값에 따라 평균 직경을 포함합니다. 테이블에서 사용되는 약어 : IDV : indinavir; RTV : ritonavir, ATV : atazanavir, EFV : effavirenz, PVA : polyvinylalcohol, SDS 나트륨 dodecyl 황산, P188 : poloxamer 188 (또한 Pluronic F68 칭했다), MPEG 2000 DSPE : 메틸 폴리 (에틸렌 - 글리콜) 1,2 - distearoyl - phosphatidyl - ethanolamine; DOTAP : (1 oleoyl - 2 - [6 - [(7 - 니트로 - 2-1 ,3 - benzoxadiazol - 4 - yl) 아미노] hexanoyl] - 3 trimethylammonium 프로판.

그림 1
그림 1. nanoART을 제조하는 데 사용되는 다양한 방법을 요약 플로우 차트.
그림 1은 nanoART를 제조하는 데 사용되는 다양한 방법을 요약한 것입니다. 흐름도는 해당 방법의 중요한 단계마다 시간을 할당 예상이 포함되어 있습니다.

그림 2
그림 2. 바람직하지과 바람직하지 NanoART의 형태의 대표 이미지를 표시합니다. RTV nanoART의 전자 현미경 분석 (배율 15,000 X)를 검사하는 것은 균질화, 젖은 밀링, 그리고 0.2 μm의 폴리 카보 네이트 여과 막 위에 sonication하여 생산. 측정 막대는 모든 프레임에서 2.0 μm의 같습니다. 바람직한 nanoART은 동일하거나 유사한 모양을 가지고하는 경향이 부드러운 가장자리와 작은 (≤ 2 μm의) 자체에 포함된 입자의 평균 구성됩니다. 바람직하지 nanoART 크기와 모양 모두에서 크게 다를 수 있으며 서로 및 / 또는 막대기를 융합 수 있습니다.

그림 3
그림 3. 바람직 nanoART 솔루션과 MDM은 nanoART을 복용 이미지. 균질 RTV - NP 및 MDM의 명시야 현미경 이미지 (모든 20x 목표를 사용하여 인수) nanoART을 복용. 유리 커버 슬립 위에 PBS의 100 μL와 RTV - NP 솔루션 10 μL을 결합한 후, 입자가 표시되고 (A) 개별적으로 식별되는보다 큰 입자의 몇과 모래를 닮은. 이미지 완전히 차별과 nanoART 치료 (B) 전 스핀들 모양의 MDM. 세포 nanoART을 촬영한 후, 그들은 어두운되어 그들의 핵은 nanoART의 perinuclear 배포로 인해 더 명백한되고 있지만, 그들은 여전히​​ 자신의 스핀들 모양의 세포 본문 (C)를 유지합니다. 일단 세포가 nanoART, 드러나지 된 핵을 과대 평가되고, 그리고 세포가 둥글게되고, 그들의 스핀들 모양의 구조를 잃고 잠재적으로 (D) 우물의 바닥에서 분리.

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그림 4. MDM에 nanoART의 세포 정관의 확인. 전송 전자 현미경 (배율 15,000 X)는 서부 유럽 표준시 밀링 (B), sonication (C)에서 RTV - NP, 그리고 치료 세포 (D에서 균질 (A), RTV - NP에서 RTV - NP에 노출 MDM에 nanoART의 이해를 보여줍니다 ). 세포 내에서 nanoART들은 기하학적인 모양에 의해 쉽게 식별되어야합니다. 컨트롤 셀 (D)에 명확 기하학적인 구조의 부족을 확인합니다. 각 입자의 예제는 설명되었습니다 : 균질 위해 빨간색 (A), 젖은 밀링 (B), sonication 녹색 (C)에 대한 파란색. 입자 구조는 SEM을 사용하여 볼 수되었던 것을 유사해야합니다. 측정 막대는 모든 프레임에서 5.0 μm의 같습니다.

그림 5
그림 5. nanoART의 antiretroviral 효능을 테스트하기위한 방법의 다이어그램. HIV - 1 ADA에 노출 후 바이러스성 복제 MDM 처음 nanoART로 치료해야 억제하고 nanoART의 능력을 테스트하기 위해서는. 아트 릴리스 연구와 마찬가지로, MDM은 nanoART와 함께 로드된 후 internalized되지 않은 입자를 제거 씻어 수 있습니다. NanoART 라덴 MDM 그 다음 매일 절반 매체 교환 십오일 최대 양식입니다. 이 시간 (일반적으로 일 1, 5, 10 및 15) 동안 MDM은 HIV - 1 ADA와 도전을하고 있습니다. 각 바이러스성 노출 세포는 감염이 진행 수 있도록 또 다른 10 일 동안 교양 후. 일 10 이후 감염 미디어 샘플 RT 분석 및 고정 및 p24 항원에 대한 스테인드 세포에 대해 수집하고 있습니다. 비 nanoART 처리 MDM, 감염과 감염되지 않은 모두도 병렬로 교양과 p24 항원 및 RT 활동의 존재에 대해 테스트합니다.

그림 6
그림 6. p24 염색법에 의해 HIV - 1 감염 MDM에 nanoART 효능 테스트. RTV - NP의 명시야 이미지 (20x 목적) 십일 HIV - 1 ADA와 도전 후 MDM 치료. 세포 virus1 일 후 nanoART 처리 (A)와 도전했을 때 아무도 감염이 존재했다 없으며 대부분의 세포 (삽입된 페이지는 화살표로 표시)의 세포질 내에서 NP의 존재를 확인합니다. 일부 세포 (삽입된 페이지 B는 화살표로 표시)에서 NP의 유지 존재를 참고하지만, 감염 세포가 십일 nanoART 처리 (B) 이후 바이러스에 노출되었을 때 훨씬 덜 너무 nanoART 취급하지 세포보다 (D)이지만, 선물로받은 1 일 이후 nanoART 트리 트먼트 (삽입된 페이지)에서보다 적게. 역시 nanoART이나 감염 (C)로 치료되지 않았습니다 세포의 이미지, 세포 세포질 내에 NP의 참고 부족 (C 삽입된 페이지). nanoART 취급하지만, HIV - 1 ADA (D)에 노출되지 않은 세포의 이미지.

비디오 1. MDM으로 가난한 RTV - NP의 이해의 세포 공촛점 현미경을 살고 있습니다. MDM의 형광 현미경은 Vybrant DIO 셀 라벨 솔루션으로 녹색 레이블과 RTV - NP 빨간 표시로 치료. 하나의 이미지는 60x 확대 4 시간 동안 매 30 초 촬영했습니다. 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오

비디오 2. MDM에 의해 성공적으로 RTV - NP의 이해의 세포 공촛점 현미경을 살고 있습니다. MDM의 형광 현미경은 Vybrant DIO 셀 라벨 솔루션으로 녹색 레이블과 RTV - NP 빨간 표시로 치료. 하나의 이미지는 60x 확대 4 시간 동안 매 30 초 촬영했습니다. 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오

Discussion

NanoART는 HIV - 1 치료제를 개선하기 위해 설계되었습니다. 우리는 임상 사용하기 위해 이러한 기술을 개발하는 첫 단계로서 nanoformulated 약물 개발을위한 실험실 테스트 시스템으로 단핵구 - 대식 세포 기반 약물 전달 시스템을 제안합니다. 우리의 과거 작품은 시스템이 그러한 응용 프로그램 5,6를위한 실용적입니다 것으로 나타났습니다.

현재 보고서에서, 우리는 일반적으로 사용되는 HIV - 1 치료 (; ritonovir, RTV, efavirenz, EFV 및 atazanavir, ATV indinavir, IDV)의 NP를 합성하는 방법을 그림 있습니다. 이것은 서부 유럽 표준시 밀링, 균질화 및 ultrasonication에 의해 달성되었다. 중요한 것은, 우리의 접근 방법은 크기, 모양 및 충전 5,6 등 nanoART 물리적 특성의 변경을 허용합니다. 계면 활성제의주의를 선택함으로써, 하나는 매우 긍정으로 중립에 매우 부정에서 입자의 요금을 제어할 수 있습니다. 처리 시간과 강도를 변경하여, 하나는 크기를 제어하고 ≥ 3 μm의 한 ≤ 200 nm의 작은 또는 큰 입자를 렌더링 수 있습니다. 입자의 모양도 있지만, 다른 물리적 특성을보다 낮은 범위를 조절할 수 있습니다. 멀티 양면 기하학적 형태가 서부 유럽 표준시 밀링 또는 균질 통해 생산 수 있지만 예를 들어, 구형 입자는 고분자와 sonication을 통해 만들 수 있습니다. 습식 밀링 및 균질 다르게 모양의 입자를 생산하지만,이 프로세스는 분류 방법에 의존하고 직접에 대해 제어할 수 없습니다. 제조 방법의 이러한 특성은 연구가 쉽게 정확한 설계 사양에 nanoART 생산 설정할 수 있습니다. nanoART의 물리 특성들이 안정성 모두에 강력한 영향을 어떻게 그들이 세포와 상호 작용 때문에 이것은 극히 중요합니다. 예를 들어, 크기가 약 1 μm의 아르 nanoART은 강한 긍정적인 요금을 가지고 있고, multisided 기하학적인 형태가 더 빠르게 한 번 세포 내부에는 더 안정 macrophages, 의해 촬영, 그리​​고 오랜 기간 동안 출시되는 것으로 나타났습니다 시간 6.

테스트 nanoART하는 방법은 최대 이동하는 입자 '능력의 간단한 검사를 허용하는 개발 보존하고, 바이러스 복제를 억제하기 위해 용량 이외에, macrophages, HIV - 1의 원칙 대상 세포 중 하나에 의해 발표되었습니다. 이것은 하나가 쉽게 실적을 기반으로 nanoART 차별화 인간 사용 nanoART을 개발의 효율성과 속도를 모두 증가, 따라서, 생체내 모델의 성공의 가장 좋은 기회를 이들을 확인하실 수 있습니다.

이것은 마우스 골수 macrophages가 nanoART와 전 생체내 장전해서 adoptively 인간화 HIV - 1 감염 생쥐의 중추 신경계를 포함한 활성 감염의 사이트에 여행, 및 릴리스 약물 최대를 위해 할 수 이주로 정맥 주사에 의해 양도 때 표시되었습니다 바이러스성 복제에게 2-4 억제합니다. 또한, 이러한 nanoART로드 세포는 또한 효과적으로 플라즈마에서 바이러스에 감염된 세포의 숫자를 줄일 수 있었다뿐 아니라 CD4 + 세포 2 보호 등 임파선, 비장, 간, 폐. 이러한 연구는 예비 있지만, 셀 중재 nanoART 전달 시스템은 혈액과 감염된 조직 모두에게 약물의 임상 상당한 금액을 배포할 수있다는 것을 보여준다. 때문에 HIV - 1 감염 마우스 연구에서 고무적인 예비 결과, 우리는 현재 추가 임상 사용을위한 nanoART의 잠재력을 테스트하는 유인원 단백질 결핍 바이러스에 감염된 짧은 꼬리 원숭이 모델을 개발하고 있습니다.

Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

작품은 국립 보건원에서 보조금 1P01DA028555 - 01A1, 2R01 NS034239, 2R37 NS36126, P01 NS31492, P20RR 15635, P01MH64570 및 P01 NS43985 (HEG)을 지원했다. 저자는 원고와 뛰어난 그래픽과 문학 지원 중요한 읽기위한 양 로빈 테일러 감사합니다. 우리는 그의 축축한 밀링 전문 스티브 Grzelak 감사하고 싶습니다. 우리는 또한 검사 및 전송 전자 현미경 이미지를 공급 네브라스카 - 링컨 전자 현미경의 핵심 시설의 대학의 박사 한 첸 감사하고 싶습니다. 마지막으로, 우리는 살아 공촛점 현미경을 사용하여 그녀의 전문 메간 말쿼트 감사하고 싶습니다.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
nanoART Manufacture
Indinavir sulfate Reagent Longshem Co., Shanghai, China Cas # 157810-81-6
Ritonavir Reagent China Shengda Pharmaceutical Company, China Cas # 155213-67-5
Atazanavir sulfate Reagent Gyma Laboratories of America INC Cas # 198904-31-3
Effavirenz Reagent Hetero Labs LTD, India Cas # 154598-52-4
PVA Reagent Sigma-Aldrich P 8136
SDS Reagent Bio-Rad 161-0301
Sucrose Reagent Fluka 84097
P188 Reagent Sigma-Aldrich P 1300
mPEG 2000-DSPE Reagent Genzyme LP-R4-039
Dotap Reagent Avanti Polar Lipid, Inc 890890 P
Hepes Reagent Sigma-Aldrich 83264
PLGA 75:25 Reagent Sigma-Aldrich P1941
Dichloromethane Reagent Acros Organics 75-09-2
Mannitol Reagent Sigma-Aldrich M9546
CTAB Reagent Sigma-Aldrich H 9151
Analytical Balance Tool Denver Instrument
T-18 Mixer Tool IKA
Ultra Sonicator Tool Cole-Parmer
Wet milling, MicroCer Tool Netzsch Fine Particle Technology, LLC
Homogenizer, EmulsiFlex-C5 Tool Avestin, Inc.
Zetapotentiometer Tool Malvern Instruments
Gas Manifold System Tool Victor Technologies
In Vitro Testing
DMEM Reagent Mediatech, Inc. 10-013-CV
Gentamicin Reagent Invitrogen 15710-064
Ciprofloxin Reagent Sigma-Aldrich 17850
Human MCSF Reagent Miltenyi Biotec 130-093-964
Pooled normal human serum Reagent Cole-Parmer WU-88061-68
6-well tissue culture plates Tool Corning 3524
Methanol (HPLC Grade) Reagent Fisher Scientific A452SK-4
1.7 ml microcentrifuge tubes Tool National Scientific Company CN1700GT
Glutaraldehyde solution Reagent Sigma-Aldrich 49632
Osmium tetroxide solution Reagent Sigma-Aldrich 75632
Centrifuge 5417R Tool Eppendorf 022621807
F-45-30-11 fixed angle rotor Tool Eppendorf 022636006
HIV-1ADA Reagent
HIV-1 p24 mouse monoclonal antibody Reagent Dako M0857
Microscope slide cover slips Tool Fisher Scientific 12-548-5P

Abbreviations used in the table: IDV: indinavir; RTV: ritonavir; ATV: atazanavir; EFV: effavirenz; PVA: polyvinylalcohol; SDS sodium dodecyl sulfate; P188: poloxamer 188 (also termed Pluronic F68); mPEG 2000-DSPE: methyl-poly(ethylene-glycol)1,2-distearoyl-phosphatidyl-ethanolamine; DOTAP: (1-oleoyl-2-[6-[(7-nitro-2–1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]hexanoyl]-3-trimethylammonium propane); PLGA: poly(lactic-co-glycolic acid); CTAB: cetyltrimethyl ammonium bromide; DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle Medium; MCSF: Macrophage Colony-Stimulating Factor; HPLC: high-pressure liquid chromatography; HIV-1: Human Immunodeficiency Virus-1

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References

  1. Gendelman, H. E. Efficient isolation and propagation of human immunodeficiency virus on recombinant colony-stimulating factor 1-treated monocytes. J Exp Med. 167, (4), 1428-1441 (1988).
  2. Dou, H. Development of a macrophage-based nanoparticle platform for antiretroviral drug delivery. Blood. 108, (8), 2827-2835 (2006).
  3. Dou, H. Laboratory investigations for the morphologic, pharmacokinetic, and anti-retroviral properties of indinavir nanoparticles in human monocyte-derived macrophages. Virology. 358, 148-158 (2007).
  4. Dou, H. Macrophage delivery of nanoformulated antiretroviral drug to the brain in a murine model of neuroAIDS. J Immunol. 183, (1), 661-669 (2009).
  5. Nowacek, A. S. Nanoformulated Antiretroviral Drug Combinations Extend Drug Release and Antiretroviral Responses in HIV-1-Infected Macrophages: Implications for NeuroAIDS Therapeutics. J Neuroimmune Pharmacol. (2010).
  6. Nowacek, A. S. NanoART synthesis, characterization, uptake, release and toxicology for human monocyte-macrophage drug delivery. Nanomed. 4, (8), 903-917 (2009).
  7. Kalter, D. C. Enhanced HIV replication in macrophage colony-stimulating factor-treated monocytes. J Immunol. 146, (1), 298-306 (1991).

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