Akustik Membran mikropartikül Teknoloji Geliştirme Özel Çin Hamsteri Yumurtalık-host Hücre Proteini Tahliller

Bioengineering
 

Summary

ViBE karmaşık matrisler daha hassas, tekrarlanabilir, otomatik sonuçlar için platform üzerinde özel testlerinin geliştirilmesi açıklanmıştır. Evrensel kartuşu testleri özel testlerin kullanım için kolayca adapte edilmelidir sağlar. Bu çok yönlülük, roman deneyleri ya da bu video örneklediği mevcut manuel testleri otomatik sürümleri, hızlı geliştirme ve doğrulama sağlar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Dickerson, M., Leong, K., Sheldon, K., Madison, L. Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology. J. Vis. Exp. (48), e2493, doi:10.3791/2493 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Özel testlerin benzersiz proteinler için genellikle zaman alıcı manuel algılama ve ELISA veya alternatif platformları üzerinde geliştirme karmaşıklığı nedeniyle Western blot gibi kantitatif teknikleri ile sınırlıdır. BioScale tescilli Akustik Membran mikropartikül (AMMP) teknolojisi daha iyi bir hassasiyet, tekrarlanabilirlik ve otomatik kullanım sağlayan, sandviç immunoassay kolay ViBE platform üzerinde kullanım için geliştirilmiş olmasını sağlar. Bir örnek olarak verilmiştir, bu protokol, özel bir Çin Hamsteri Yumurtalık-Host Hücre Proteini (CHO-OP) tahlil geliştirmek için prosedür özetlenmektedir. Burada özetlenen immun geniş bir yelpazede gelişmesi için genel ilkeler takip edilebilir.

Hesaplamak için sensör yüzeye mikro bağlama kaynaklanan salınım frekans değişiklikleri ölçerek bir AMMP tahlil önlemleri antijen konsantrasyonu. Bu dört ana bileşenden oluşur: (1) Fonksiyonlu sekiz sensör çipi içeren bir kartuş, (2) antikor etiketli manyetik mikro Fonksiyonlu yonganın yüzey antijeni içeren örnekler (4) bağlanır (3) hapten etiketli antikor ilgi. BioScale Kullanıcı biyosensör, sekiz ayrı akışkan yolları ile bireysel membranlar içeren bir rezonans bir cihazdır. Membranlar kütlesi yüzeyde biriken ve bu frekans değişikliği eklendi kütle miktarını ölçmek için kullanılır yanıt salınım frekansını değiştirmek.

Sensörü anti-hapten antikor ile işlevselleştirildiyse immunoassay geniş bir yelpazede kullanım kolaylaştırmak için. Testi spesifik antikorların tek bir antikor ve diğer biotin hapten etiketi kovalent konjugasyon ile modifiye edilmiştir. Biotin etiketi hapten etiketli antikor ile birlikte, bir sandviç analit yakalamak için kullanılan, çiftli manyetik boncuk streptavidin antikor bağlamak için kullanılır. Kompleks anti-hapten/hapten etkileşim yoluyla çip bağlanır. Her testin sonunda sensörleri 96-plaka sıralı sütun analizi sağlayan bir seyreltik asit ile temizlenir çalıştırın.

Burada, biyoproses geliştirme için özel bir CHO-OP AMMP testi geliştirmek için yöntemi mevcut. AMMP testlerin geliştirilmesi veya AMMP testleri mevcut testlerin değiştirerek karmaşık örnekleri ve azaltılmış operatörü saati (tekrarlanabilirlik, hassasiyet) daha iyi performans sağlayabilir. Protokol, kalkınma için adımlar gösterir ve tartışma bölümüne temsilcisi sonuçlarının gözden geçirilmesi. BioScale tahlil optimizasyon ve özelleştirme parametreleri hakkında daha ayrıntılı bir açıklama için başvurun. Bu kit Artık Protein A, Ürün titre ve CHO-OP gibi genel biyoproses geliştirme testleri sunuyor.

Protocol

1. Mikropartikül Hazırlık

  1. Biotin NHS Kimya kullanarak Etiket Antikorlar
  2. Biyotinilasyon Derece belirlenmesi
  3. Biotinlenmiş Antikor Konjugat Streptavidin Boncuk
    1. 1-2 dakika karıştırın orijinal flakon boncuk süspanse edin
    2. Bir mikrosantrifüj tüp içine boncuk istenen birimde kısım
    3. Boncuk PBST ile 3 kere yıkayın:
      1. 2 dakika boyunca boncuk mıknatıs içeren tüp Yeri
      2. Mıknatıs tüp ile aspirasyon ile süpernatantı çıkarın. Boncuklar bozmak için dikkatli olun
      3. Mıknatıs tüp çıkarın ve 1 ml PBST ekleyin
      4. Boncuklar tekrar süspansiyon için 20 saniye boyunca Vortex
      5. Boncuk kapağı kaldırmak için 5 saniye boyunca santrifüjleyin
      6. Iki kez daha 2.3.1-2.3.5 tekrarlayın.
    4. Mıknatıs üçüncü yıkama yeri tüp sonra PBST aspirat
    5. Boncuk biotinlenmiş antikor ekleyin ve tekrar süspansiyon
    6. Gerekirse PBS ile 300 mcL biotinlenmiş antikor ses getirmek. Antikor hacmi ise 300 mcL daha herhangi bir PBS katmayan
    7. Vorteks çalkalayıcı veya tüp rotator, RT 30 dakika boncuk / antikor süspansiyon inkübe
    8. 3. adımda PBST ile 3 kere yıkayın.
    9. Biotinlenmiş BSA ile boncuk Blok
      1. 300 mcL üçüncü yıkama 10 mikrogram / mg biotinlenmiş BSA ekledikten sonra, PBS gerekirse ile ses seviyesini ayarlamak ve ajitasyon ile 30 dakika inkübe
    10. 3. adımda PBST ile 3 kere yıkayın
    11. PBS/0.05% BSA 100 mcL boncuk süspanse edin. Sodyum azid, uzun süreli depolama için eklenebilir
  4. Standart NHS Floresein protokolleri kullanarak, dedektör antikor fluoresceinate
  5. Fluorescination, Derece belirleyin

2. OP - Geliştirme

  1. Çalışma çözümler hazırlayın:
    1. Floresein etiketli Antikor (Fl-Ab): En CHO-HCP testlerin son bir 400 ng / ml konsantrasyonda Fl-Ab kullanın. Fl-Ab nihai tahlil hacminin ¼ 'ü olarak eklenir, bu nedenle çalışma çözeltisi konsantrasyonu 1.6 mg / ml. Flab stok BioScale Boncuk / flab Dilüent ile seyreltilmesi ile bu çözüm hazırlayın.
    2. Boncuk: En CHO-HCP Testler 2x10 5 boncuk / mL nihai konsantrasyonda boncuk kullanmayın. Boncuk reaktif son tahlil hacminin ¼ 'ünü oluşturmaktadır, bu nedenle çalışma çözeltisi konsantrasyonu 5 boncuk / ml 8x10 konumundadır . Boncuk stok BioScale Boncuk / flab Dilüent ile seyreltilmesi ile bu çözüm hazırlayın. Vorteks, tüm boncuk yapmak için boncuk hisse senedi, bir kısım çıkarmadan önce süspansiyon vardır.
    3. Tampon Koşu: tampon kompozisyon ancak birkaç CHO HCP deneyleri 10 mM HEPES tamponu,% 1 Tween, pH 7.5 kullanılarak geliştirilmiş olan testin geliştirilmesi için kullanılabilir antikorlar için optimize edilmesi gerekebilir. BioScale için bir katkı maddesi kullanmadan önce% 1 'lik bir konsantrasyon tampona eklenen çalışan tamponu (geliştirme kiti ile birlikte) geliştirmiştir.
  2. BioScale Sample Diluent kalibratörler ve örnekler sulandırınız.

3. ViBE Sistemi Kurma

  1. Üzerinde ViBE Workstation açın
  2. Connect sistem kaynağı ve atık
  3. Başbakan sistem
  4. ViBE Kartuş Ekle
  5. ROUTE tüpler
  6. "Örnek Setup" etiketli sac doldurarak tahlil şablon hazırlayın. BioScale her ViBE İş İstasyonu tahlil için bir test şablonu vardır yeteneği sağlar. Bu kullanıcı, farklı deneyleri, deney tam bir kaydını tutmak için şablon "Notlar" sayfasında özel notlar düzenlemek ve kaydetmek için izin verir.
  7. İlk tahlil şablonu kurdu: "Örnek Setup" sayfasında tayininde standartlarının konsantrasyon aralığı tablo (sol üst köşe) doldurarak başlayın.
  8. Sonra, uzun örnekleri inkübe için ne ViBE İş İstasyonu talimat standartları (Basit Sütun Kurulum Oku, Bir Reaktif ekle ve İki Reaktif Ekle kurulumları) sağ tabloda ek bilgileri girin, ne kadar reaktif hacmi aktarılacak. Örnek birikimi gereken ne kadar uzun ve sensör klima ve probları ve kartuş dekontaminasyon gerekli olup olmadığını, vb.
  9. Plaka düzeni doldurun.
  10. Plakalar halinde numune / reaktifler yükleyin. ViBE reaktif plaka için gerekli hacim sağlayacaktır. Örnek hacmi değişir, ancak toplam 120 mcL tahlil hacminin yarısını iyi bir başlangıç ​​yeridir.
  11. Plakası örtüleri uygulayın. Iş istasyonu güverte üzerine tabak yükleyin.
  12. Testin başlangıç ​​sihirbazı çalıştırın, sihirbaz üzerinden gidin ve tahlil başlatmak.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1
Şekil 1: AMMP Sandviç İmmünoassay ViBE İş İstasyonu, bir AMMP test antijen konsantrasyonu ölçer. Sinyal boncuk-antijen-hapten antikor hapten / anti-hapten etkileşimi aracılığıyla sensör bağlanır ölçülür. Yenileme bağışıklık kompleksleri çıkarmadan, başlangıç ​​durumuna geri sensör getirir.

Şekil 2
Şekil 2: CHO-OP AMMP Testi kalibrasyon eğrisi

CHO OP AMMP Testi kalibrasyon eğrisi Şekil 2 yukarıdaki bir örnek. Bu örneklerin analizi de dahil olmak üzere, yüksek hassasiyet ve tekrarlanabilirlik ile reaktör arıtma akışı genelinde yapılabilir.

Şekil 3
Şekil 3: Protein AMMP Testi kalibrasyon eğrisi

Şekil 3 VIBE Artık Protein A Testi Kiti ile yapılan bir Kalıntı Protein AMMP Testi için bir kalibrasyon eğrisi. Aynı kiti bir 30 dakikalık inkübasyon dönemi ile bir hızlı tahlil, için ya da genellikle eşdeğer ELISA Kullanıcı kullanıcıları daha iyi olan, her ikisi de hassas ya da doğruluk kaybı olmadan bir daha uzun kuluçka dönemi, daha hassas sonuçlar ve geniş dinamik aralık için kullanılan olabilir. ' eller

Şekil 4
Şekil 4: Ürün titresi AMMP Testi

ViBE İş İstasyonu Ürün titresi tahlil, şekil 4'deki sonuçlar için de kullanılabilir. Diğer AMMP Tahliller farklı seslendirilen bu testte basit seyreltme veya boncuk daha örnek tedavi gerektirmeyen, ve kantitatif canlılığında geniş bir yelpazede üzerinde 10 milyondan fazla hücre içeren "spin" örnekleri onaylandı.

Şekil 5
Şekil 5: GST-Gadd34 biyomarker tahlil için AMMP Testi standart eğri

Şekil 5 ViBE BioAnalyzer (Panel A) veya rekombinant GST-Gadd34 AlphaScreen Teknolojisi kullanılarak elde edilen sinyal standart bir eğri gösterilmiştir. ViBE platformu Sonuçlar aynı antikorları kullanarak daha duyarlı yaklaşık bir günlük. AMMP henüz az büyük parçacıkları hala çözüm faz yakalama ve algılama kompleks oluşum faydaları ölçümü yararlanır.

Şekil 6
Şekil 6: tümör örnek GST-Gadd34 AMMP Testi standart eğri

Şekil 6, CWR22 xenografts Gadd34 indüksiyonu ViBE BioAnalyzer (Panel A) veya AlphaScreen (B Paneli) veya analiz gibi bir boronate proteazom inhibitörü varlığı ya da yokluğu test edildi. ViBE platformu AlphaScreen sinyali ise in vivo tümör xenografts artan protein mikrogram ile söndürülür hassas ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek mümkün oldu.

Bu örnek, son derece karmaşık örnekler AMMP teknolojinin gücünü gösterir. Yongaları yakın mıknatıs hassas algılama yongası ve yüksek verimlilik nedeniyle, az sayıda manyetik mikro, verimli ve tekrarlanabilir parçalanmış hücresel (lizis reaktifler de dahil olmak üzere) ve kan enkaz karmaşıklığı ortasında düşük bolluk hedef için scavenge.

Discussion

Yukarıdaki örnekler, karmaşık örneklerinde AMMP son derece duyarlı kantitatif sonuçlar göstermektedir. Bu performans, kolaylık ve kontrol sistemi içine reaktifler biçimlendirme ile teslim çeşitli uygulamalar için sağlıyor. Bu uygulamalar tümör Gadd34 gibi bir hedef için özel ya da konak hücre proteini tespit ve kantitatif arıtma akışı çapraz örneklerinde olduğu gibi hedeflerin bir spektrum için genel olabilir. Son derece esnek AMMP ile birlikte düşük yükü ViBE platformu kritik testleri sunmak için güçlü bir araç sağlar.

Disclosures

Bu makalenin yazarları, bu yazıda kullanılan bazı araçlar ve reaktifler üretir Bioscale, Inc tarafından istihdam edilmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NHS-Chromogenic-biotin or NHS-Chromogenic Biotin Labeling kit
If NHS-Chromogenic-biotin is purchased as a reagent the following additional materials will be required
Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF)
Phosphate buffered saline (PBS) or other amine free buffer (pH 7 – 9)
Desalting columns or dialysis units for buffer exchange
Spectrophotometer able to measure 354 and 280 nm – for measuring protein and biotin concentrations
Biotinylated antibody (2-5 biotins/Ab)
Streptavidin magnetic beads BioScale (10 mg/mL) ~108 beads/mg
Magnet for microcentrifuge tubes New England Biolabs cat # S1510S
Biotinylated BSA for blocking
Phosphate buffered saline (PBS)
PBS 0.1% Tween 20
Vortex
Microcentrifuge holder for Vortex or tube rotator
Antibody or protein to be labeled
NHS-Fluorescein or NHS-Fluorescein Labeling kit
If NHS-Fluorescein is purchased as a reagent the following additional materials will be required
Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF)
50 mM borate, pH 8.5 or other amine free buffer (pH 7 – 9)
Desalting columns or dialysis units for buffer exchange
Measurement of protein and fluorescein concentrations requires a spectrophotometer able to measure 493 and 280 nm.
Diluent BioScale to dilute beads and FlAb
Sample Diluent BioScale to dilute samples and calibrators
Running Buffer Additive BioScale

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics