NanoDrop microvolume Kwantificering van nucleïnezuren

Biology
 

Summary

Het gebruik van NanoDrop microvolume systemen als praktische en efficiënte alternatieven voor de traditionele nucleïnezuur kwantificatie methode wordt beschreven door de demonstratie van twee microvolume nucleïnezuur kwantificatie protocollen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (45), e2565, doi:10.3791/2565 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Biomoleculaire tests worden voortdurend ontwikkeld, die gebruik maken van steeds kleinere hoeveelheden materiaal, vaak zich verzet tegen het gebruik van conventionele kuvet-gebaseerde instrumenten voor nucleïnezuur kwantificering voor degenen die microvolume kwantificatie kan uitvoeren.

De NanoDrop microvolume monster retentie systeem (Thermo Scientific NanoDrop Products) functies door de combinatie van glasvezel technologie en natuurlijke oppervlaktespanning eigenschappen vast te leggen en te behouden minieme hoeveelheden van het monster los van de traditionele containment apparaten zoals cuvettes of haarvaten. Bovendien is het systeem maakt gebruik van kortere weglengte, die resulteren in een breed scala aan nucleïnezuur concentratiemetingen in wezen waardoor de noodzaak om verdunningen uit te voeren. Vermindering van het volume van het monster nodig voor spectroscopische analyse ook vergemakkelijkt de opname van extra kwaliteitscontrole stappen heel veel moleculaire workflows, het verhogen van de efficiëntie en uiteindelijk leidt tot meer vertrouwen in downstream resultaten.

De noodzaak voor hoge gevoeligheid fluorescerende analyse van de beperkte massa is ook naar voren gekomen met de recente experimentele ontwikkelingen. Met dezelfde microvolume monster retentie-technologie, kan TL-metingen worden uitgevoerd met 2 pl van materiaal, waardoor tl-assays volume eisen aanzienlijk worden verminderd. Dergelijke microreactions van 10 pi of minder zijn nu mogelijk met behulp van een speciale microvolume fluorospectrometer.

Twee microvolume nucleïnezuur kwantificatie protocollen zal worden aangetoond dat het gebruik geïntegreerde monster retentie systemen als praktische alternatieven voor de traditionele kuvet-gebaseerde protocollen. Eerst wordt een directe A260 absorptie methode met behulp van een spectrofotometer microvolume beschreven. Dit wordt gevolgd door een demonstratie van een fluorescentie-gebaseerde methode die minder volume fluorescentie reacties mogelijk maakt met een microvolume fluorospectrometer. Deze nieuwe technieken kunnen worden beoordeeld van nucleïnezuur concentraties variërend van 1 pg / ul tot 15.000 ng / ul met een minimaal verbruik van het monster.

Protocol

1. Microvolume Nucleic Acid Kwantificering Met behulp van een NanoDrop 2000c Spectrofotometer

  1. Om te beginnen, het reinigen van de bovenste en onderste optische oppervlakken van de microvolume spectrofotometer monster retentie systeem door pipetteren 2-3 ul van schoon gedeïoniseerd water op de onderste optisch oppervlak.
  2. Sluit de hendel, ervoor te zorgen dat de bovenste voetstuk in contact komt met het gedeïoniseerd water. Til de hendel arm en veeg zowel optische oppervlakken met een schone, droge, pluisvrije lab te vegen.
  3. Open de NanoDrop software en selecteer de Nucleic Acid toepassing. Gebruik een klein volume, gekalibreerde pipet met een blanco meting uit te voeren door de uitgifte een ul buffer op de lagere optisch oppervlak. Laat de hendel arm en selecteer "Blanco" in het nucleïnezuur toepassing.
  4. Zodra de blanco meting is voltooid, schoon zowel optische oppervlakken met een schone, droge, pluisvrije lab te vegen.
  5. Kies de juiste constante voor het monster dat moet worden gemeten.
    Sample Type Selecteert u Optie Constant gebruikt om de concentratie berekenen
    dsDNA DNA-50 50
    ssDNA DNA-33 33
    RNA RNA-40 40
    Oligo Gewoonte 15-150
    Tabel 1. Typische nucleïnezuur concentratiebereiken voor directe A280 absorptie metingen met behulp van een NanoDrop microvolume spectrofotometer, een traditionele kuvet-based spectrofotometer gebruikt met een TrayCell microcell kuvet, en een microvolume NanoDrop fluorospectrometer in combinatie met de PicoGreen test.
  6. Doseer een pi van nucleïnezuurmonster op de lagere optische voetstuk en sluit de hefboom arm. Omdat de meting is het volume onafhankelijk, het monster hoeft alleen maar de kloof tussen de twee optische oppervlakken voor een meting worden gedaan.
  7. Selecteer "Measure" in de applicatie software. De software berekent automatisch het nucleïnezuur concentratie en zuiverheid ratio's. Volgende voorbeeld van de meting, toetsing van de spectrale output.
  8. De software berekent automatisch het nucleïnezuur concentratie en zuiverheid ratio's. Volgende voorbeeld van de meting, toetsing de spectrale afbeelding om te proeven kwaliteit te beoordelen.
  9. Een typische nucleïnezuurmonster zal een zeer karakteristieke profiel.
    Figuur 1
    Figuur 1. Een typisch nucleïnezuurmonster zal een zeer karakteristieke profiel.
  10. Gemeenschappelijke bronnen van verontreinigingen in verband met specifieke nucleïnezuur isolatie technieken zijn Fenol / TRIzol en kolom extractie. In het geval van Fenol / TRIzol extractie, kan resterende reagens verontreiniging worden aangegeven door abnormale spectra tussen 220-240 nm en door verschuivingen in de 260 tot 280 nm regio. Omgekeerd kan resterende guanidine van kolom extractie bij te dragen tot een piek bij 230 nm en een verschuiving in de trog van 230 nm tot ongeveer 240 nm.
    Figuur 2
    Figuur 2. De verschuivingen in de pieken en dalen van de monsters B en C ten opzichte van monster A illustreren hoe verontreinigingen kunnen de spectra van nucleïnezuur monsters beïnvloeden.
  11. Nauwkeurig te kunnen beoordelen monster kwaliteit, moet 260/280 of 260/230 ratio's worden geanalyseerd in combinatie met de algemene spectrale kwaliteit. Pure nucleïnezuren levert doorgaans een 260/280 verhouding van ~ 1,8 en een 260/280 verhouding van ~ 2.0 voor DNA en RNA, respectievelijk. Deze verhouding is afhankelijk van de pH en ionische sterkte van de buffer wordt gebruikt om de blanco en monster metingen te verrichten. Zure oplossingen zullen onder-vertegenwoordigen de verhouding van 0,2-0,3, terwijl een fundamentele oplossing zal de verhouding tussen over-vertegenwoordigen 0,2-0,3. Significant verschillend zuiverheid verhoudingen kunnen wijzen op de aanwezigheid van eiwit, fenol of andere verontreinigingen die sterk absorberen in of bij 280 nm. De 260/230 zuiverheid ratio is een tweede maatregel van de DNA zuiverheid met waarden voor een "zuivere" nucleïnezuur gewoonlijk in het bereik van 1,8-2,2. Zuiverheid ratio's die zijn aanzienlijk lager dan de verwachte waarden kunnen wijzen op de gebruikte isolatie techniek kan verdere optimalisatie nodig is.
  12. NanoDrop spectrofotometers kan ook worden gebruikt om de eiwitten met behulp van directe absorptie of door eiwitten colorimetrische assays kwantificeren. Om ervoor te zorgen de juiste kolom vorming en reproduceerbaarheid, zijn 2-ul monsters geadviseerd voor eiwit monsters. Raadpleeg de volgende Jove video: microvolume eiwitconcentratie Bepaling Met behulp van de NanoDrop Spectrophotometer http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610

  1. Om aan te tonen hoge gevoeligheid microvolume nucleïnezuur kwantificeren met behulp van de NanoDrop 3300, is een PicoGreen fluorescentie-kit gebruikt. Om te beginnen, evenwicht de kit normen en alle nucleïnezuur monsters op kamertemperatuur. TL-monsters zijn lichtgevoelig en dient te worden bewaard in oranje of aluminium omwikkeld buizen.
  2. Bereid genoeg 1x TE-buffer voor alle normen en monsters zo goed zijn zoals gemeten voor de PicoGreen werkende oplossing die nodig zullen zijn. Bereid 1xTE buffer door verdunning van de verstrekte 20x TE-buffer met nuclease-vrij water per protocol van de fabrikant. Reactie volumes kan variëren van 200 pi tot zo weinig als 10 ul. In dit voorbeeld wordt 10 pi reactie volumes worden voorbereid.
  3. Bereid serieel verdund dsDNA normen op 2x de uiteindelijke gewenste concentratie in nuclease-vrije flesjes of tubes. Overdracht 5 pi van elk van de verdunde dsDNA normen in een individueel label nuclease-vrij amber of folie bedekte buis.
  4. Aliquot 5 pi van elk monster dsDNA van belang in het gepaste label nuclease-vrij amber of folie bedekte buizen.
  5. Bereid PicoGreen werkende oplossing volgens protocol van de fabrikant. Overdracht een gelijk volume van de PicoGreen werkende oplossing voor elk buisje met daarin een standaard of monster van belang (5 pi in dit voorbeeld).
  6. Combineer gelijke volumes 1x TE-buffer en PicoGreen werkende oplossing voor de negatieve controle, die dient als een referentie-oplossing te bereiden.
  7. Meng de inhoud van elke reactie buisje door zachte pipetteren en incubeer de reacties bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Alle normen en de monsters moeten worden in evenwicht gebracht om dezelfde temperatuur voor de meting als fluorescentie-signaal wordt beïnvloed door de temperatuur.
  8. Ter voorbereiding van het instrument en het uitvoeren van metingen, eerst schoon de onderste en bovenste oppervlak van het monster retentie systeem. Pipet 2-3 ul van gedeïoniseerd water op de onderste optisch oppervlak, sluit vervolgens de hendel arm open, en dep de bovenste en onderste sokkels met een schone, niet-pluizende, laboratorium te vegen. Zorg ervoor dat de oppervlakken zijn vrij van pluizen voordat je verder gaat als pluis kan fluorescentie vertonen in de aanwezigheid van een excitatie bron en kunnen interfereren met de meting.
  9. Open het instrument software, kies de "Nucleic Acids" applicatie, en selecteer de "PicoGreen-dsDNA" optie.
  10. Om lege het instrument, voeg 2 ul 1x TE naar de lagere sokkel, sluit de arm, en selecteer "Blanco" in het instrument gebied van software. Eenmaal leeg is voltooid, vlek uit de blanco-oplossing van beide oppervlakken van het monster retentie systeem.
  11. Meng de referentie-oplossing door zachte pipetteren. Met behulp van een lage retentie tips, pipetteer 2 pl op de lagere voetstuk en sluit de arm.
  12. Selecteer de "Reference" in de meting, selecteer de gewenste eenheden. Klik op "Measure" om de meetcyclus te starten.
  13. Wanneer de meting cyclus is voltooid, opent u de arm en grondig blot uit de steekproef bevestigingssysteem oppervlakken. Meet tot vijf herhalingen van de referentie, met behulp van een verse hoeveelheid voor elke repliceren.
  14. Herhaal dit proces voor de extra normen om een ​​standaardcurve te bouwen. Tot zeven normen kunnen worden gebruikt. De software is ontworpen om maximaal vijf replica voor elke standaard. Replicaten van de normen worden gemiddeld op een standaard curve waarvan de gemeten concentraties worden automatisch bepaald genereren.
  15. Zodra de norm curve is voltooid, selecteert u het "Samples" tab, voert u de desbetreffende monster ID-informatie en meten elk onbekend monster.

Discussion

De kwantificatie protocollen hier zijn gebaseerd op de meest geaccepteerde microvolume systemen. Dergelijke systemen bieden praktische alternatieven voor de traditionele nucleïnezuur kwantificatie methode, die afhankelijk zijn van een grotere steekproef volumes en het gebruik van containment apparatuur.

NanoDrop microvolume technologie maakt gebruik van een sample retentie systeem dat is gebaseerd op de oppervlaktespanning eigenschappen van het monster wordt gemeten tot een vloeistofkolom vorm. Het is essentieel dat de steekproef contact maakt met de bovenste en onderste optische meting oppervlakken voor een goede column vorming. Als op enig moment van de meetresultaten lijken onjuiste of niet reproduceerbaar, het is waarschijnlijk het resultaat van de steekproef heterogeniteit of vloeibare kolom breuk.

Wasmiddelen en isopropyl alcohol worden niet aanbevolen schoonmaakmiddelen want deze kunnen deconditioneren het voetstuk meting oppervlakken. Een onvoorwaardelijke voetstuk treedt op wanneer de hydrofobe oppervlakte-eigenschappen van de sokkel zijn aangetast, wat resulteert in een afvlakking van het monster druppel. Ongeconditioneerde voetstukken kan leiden tot breuk van de vloeistof kolom tijdens de meting.

Figuur 3
Figuur 3. Ongeconditioneerd oppervlak wordt gekenmerkt door een afvlakking van een waterdruppel.

Uncondtioned voetstuk oppervlakken kunnen worden gereconditioneerd met behulp van NanoDrop Pedestal Reconditionering Compound (PR-1, Thermo Scientific NanoDrop Products). Een dunne laag van reconditionering verbinding wordt toegepast op de bovenste en onderste voetstuk oppervlakken, laten drogen voor ~ 30 seconden, daarna wreef uitschakelen met behulp van een schone, droge, pluisvrije lab te vegen. Een succesvol gereviseerde toestand wordt gekenmerkt door een waterdruppel parelen wanneer toegepast op de bodem voetstuk oppervlak.

Figuur 4
Figuur 4. Een gereviseerde oppervlak wordt gekenmerkt door een kralen van een waterdruppel.

Microvolume kwantificatie systemen sterk verminderen monster verbruik en drastisch verhogen de concentratie range in vergelijking met meer traditionele kwantificering systemen. Hoewel microvolume kwantificatie vaak uitgegroeid tot een enabling technology voor omstandigheden met betrekking tot beperkte celmassa, zoals de naald biopsieën en laser-capture microdissectie, de efficiëntie en gemak van het gebruik van deze methodologie heeft ervoor gezorgd dat een algemeen aanvaarde alternatief voor de traditionele nucleïnezuur kwantificatie methode zelfs wanneer monster is er in overvloed.

Disclosures

Philippe Desjardins en Debra Conklin zijn in dienst van Thermo Scientific NanoDrop Products, Inc dat de instrumenten gebruikt in dit artikel oplevert.

Acknowledgments

Richard W. Beringer en David L. Ash, Applications Wetenschappers, Thermo Scientific NanoDrop producten, voor technische bijstand en filmen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NanoDrop 2000c Thermo Fisher Scientific, Inc. ND-2000C
NanoDrop 3300 Thermo Fisher Scientific, Inc. ND-3300

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity. BioTechniques. 22, 474-481 (1997).
  2. Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., Huber, A. Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer. Implen Applications Note. Munich, Germany. (2006).
  3. Jr, I. ngle, D, J., Crouch, S. R. Spectrochemical analysis. Prentice Hall. Englewood Cliffs, NJ. XV-590 (1988).
  4. Van Lancker, M., Gheyssens, L. C. A comparison of four frequently used assays for quantitative determination of DNA. Anal. Lett. 19, 615-623 (1986).

Comments

4 Comments

  1. Por favor, estoy muy interesada en el nanodrop, necesitaria que me enviaran esta pagina traducida al espa&#²41;ol. MUCHAS GRACIAS

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 15, 2011 - 3:56 AM
  2. Hola Conchi,

    Lo sentimos pero no ofrecemos traducciones al texto de nuestros articulos en este momento. Podemos darte un link con una traduccion hecha por Google, http://translate.googleusercontent.com/translate_c?act=url&hl=en&ie=UTF8&prev=_t&rurl=translate.google.com&sl=en&tl=es&twu=1&u=http://www.jove.com/details.php%3Fid%3D²565&usg=ALkJrhg4rISg8npshQi-1l4URzWgN1xnAg y afortunadamente para este video ofrecemos varios idiomas incluyendo español http://www.jove.com/details.php?ID=²894
    -Chris

    Reply
    Posted by: Chris M.
    April 15, 2011 - 8:43 AM
  3. Which buffer is recommended to be used in this system?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 8, 2011 - 4:58 AM
  4. hello, i am using nanodrop for measure seweeds DNA, in all samples 260/230 ratio is lower than 1! this means my sample are very dirty? should i need an extra purification of my samples? thanks

    Reply
    Posted by: clementina p.
    September 4, 2013 - 12:48 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics