इम्यून प्रतिक्रियाएँ इंजीनियर हार्ट ऊतक के आरोपण के बाद एसेसमेंट (EHT) के लिए bioluminescence इमेजिंग

Bioengineering

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Conradi, L., Pahrmann, C., Schmidt, S., Deuse, T., Hansen, A., Eder, A., Reichenspurner, H., Robbins, R. C., Eschenhagen, T., Schrepfer, S. Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT). J. Vis. Exp. (52), e2605, doi:10.3791/2605 (2011).

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Abstract

हृदय ऊतक इंजीनियरिंग की विभिन्न तकनीकों मचान या तो देशी या bioartificial पाड़ सामग्री, जैसे आतंच या कोलेजन hydrogels में हृदय myocytes की फंसाने और myocyte 1 monolayers के stacking का उपयोग रणनीतियों सहित पिछले दशकों में किया गया जारी है. समझौता हृदय समारोह (जैसे रोधगलन के बाद) की बहाली पर या प्रयोगात्मक मॉडल (जैसे पेशीनगोई विष विज्ञान और पदार्थ स्क्रीनिंग या रोग मॉडलिंग) के रूप में इन अवधारणाओं के उद्देश्य. इंजीनियर हृदय के ऊतकों (EHT) के आरोपण के बाद सेल अस्तित्व के सटीक निगरानी अब संभव हो गया है bioluminescence इमेजिंग (BLI) 2 तकनीकों में vivo में उपयोग. यहाँ हम जुगनू luciferase (; 3 रोज़ा / luciferase ल्यू टीजी) के सर्वव्यापी अभिव्यक्ति के साथ एक ट्रांसजेनिक चूहा तनाव से आतंच आधारित EHT की पीढ़ी का वर्णन . आरोपण अलग चूहा उपभेदों के अधिक से अधिक omentum EHT आरोपण के बाद प्राप्तकर्ता जीव की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का आकलन में किया जाता है. BLI और एनजाइम लिंक्ड इम्यूनो स्पॉट (ELISPOT) तकनीक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के मूल्यांकन के लिए BLI के प्रयोज्य की पुष्टि द्वारा उत्पन्न परिणामों की तुलना.

Protocol

1. EHT पीढ़ी और संस्कृति स्थितियां

आतंच आधारित EHT के विनिर्माण प्रदर्शन किया गया था के रूप में कहीं 4 वर्णित है. संक्षेप में, आरोपण प्रयोजनों के लिए आतंच आधारित EHT उत्पन्न करने के लिए, एक मास्टर नवजात रोज़ा / luciferase ल्यू ट्रांसजेनिक चूहा दिल, गोजातीय फाइब्रिनोजेन और Matrigel से अलग कक्षों वाले मिश्रण तैयार किया गया था. Agarose molds कास्टिंग Teflon spacers 6 अच्छी तरह से संस्कृति बर्तन में रखा का उपयोग कर तैयार थे. Agarose के solidification के बाद, spacers हटा दिया गया और सिलिकॉन पोस्ट रैक संस्कृति बर्तन पर molds में पहुंचने पदों के साथ रखा गया है. EHT उत्पन्न करने के लिए, mastermix संक्षिप्त थ्रोम्बिन की गणना राशि के साथ मिलाया गया था और मोल्ड में pipetted. फाइब्रिनोजेन के polymerisation के बाद, पोस्ट का पालन EHTs साथ सिलिकॉन रैक धीरे agarose molds कास्टिंग, 6 अच्छी तरह से सेल संस्कृति व्यंजन नई स्थानांतरित और एक 37 डिग्री सेल्सियस, 7% सीओ 2 सेल संस्कृति इन्क्यूबेटर में रखा से हटा दिया गया कस्टम बनाया का उपयोग सेल संस्कृति माध्यम.

EHT सेल संस्कृति शर्तों के तहत दस दिन तक रखा गया था. इस समय अवधि के दौरान, नवजात चूहे हृदय कोशिकाओं लम्बी आपस में शुरू किया और सिलिकॉन पोस्ट के बीच में बल लाइनों के साथ संरेखित करें. आरोपण के समय में, सहज सुसंगत संकुचन मनाया गया, सिलिकॉन प्रविष्टियाँ deflecting.

2. EHT आरोपण

EHT आरोपण या तो असुरक्षित ब्राउन नॉर्वे (बी एन) चूहों, या immunodeficient नग्न चूहों में प्रदर्शन किया था allogeneic प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की जाँच. बीएन और नंगा 100 चूहों वजन - 150 ग्राम चार्ल्स नदी जर्मनी (Sandhofer Weg 7, डी - Sulzfeld 97,633) से खरीदे गए थे और पारंपरिक स्थितियों, खिलाया मानक चूहे चाउ और पानी विज्ञापन libidum के तहत रखे. Immunodeficient चूहों बाँझ बिस्तर, पिंजरों, और निष्फल पानी प्रयोग किया जाता है में रखे जाते हैं. जर्मन नैतिक समीक्षा समिति की समीक्षा और जानवर प्रक्रियाओं मंजूरी दे दी है. सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों से पहले निष्फल कर रहे हैं उपयोग करने के लिए.

आरोपण की प्रक्रिया निम्नानुसार प्रदर्शन कर रहे हैं:

चूहा (2.5-3%) isoflurane एक प्रेरण कक्ष का उपयोग के साथ anesthesized हैं. Isoflurane के लिए मानव जोखिम डाउनड्राफ्ट तालिका या गैर recirculating हुड में काम करके कम किया जा सकता है. शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के दौरान शरीर का तापमान बनाए रखा है.

  1. उदर क्षेत्र दाढ़ी और आँख मरहम लागू करने के लिए संज्ञाहरण के दौरान सुखाने से आंखों को रोकने के.
  2. चूहे को अपनी पीठ पर प्लेस और अपनी नाक और मुँह पर एक facemask जगह संज्ञाहरण रखने.
  3. पेट क्षेत्र का उपयोग और फिर 80% इथेनॉल Betadine कीटाणुरहित. स्वच्छ से गंदा मुंडा क्षेत्र के केंद्र से, झाड़ू से साफ़ करना जावक चलती बालों क्षेत्र की ओर.
  4. पिछले पैर pinching लगता है कि चूहे पर्याप्त anesthetized है सजगता की जाँच करें.
  5. पशु कपड़ा और एक midline पेट चीरा और दो चरणों में त्वचा और मांसपेशियों को अलग पेट खोलने प्रदर्शन. गरम मनका नसबंदी त्वचा और मांसपेशियों के उद्घाटन के बीच किया जाता है.
  6. एक गरम खारा moisturized पाउडर मुक्त दस्ताने में आंतों रखें. आंतों के आसपास दस्ताने नमी की हानि को रोकने के मोड़ो.
  7. फैटी ऊतक निकालें और तिल्ली बेनकाब.
  8. कल्पना और संदंश के साथ अधिक से अधिक omentum फैल गया.
  9. ध्यान अधिक से अधिक omentum पर सिलिकॉन पोस्ट और हस्तांतरण को निलंबित करने से EHT काटा.
  10. EHT आसपास अधिक से अधिक omentus लपेटें और दो सिंगल 7-0 prolene sutures का उपयोग कर ठीक (Ethicon, Norderstedt, जर्मनी)
  11. अगला आंतों को वापस ले जाने के पेट में.
  12. Prewarmed बाँझ खारा के साथ पेट फ्लश.
  13. पेट की दीवार का उपयोग कर 6-0 prolene चल sutures (Ethicon, Norderstedt, जर्मनी) की मांसपेशी परत बंद.
  14. 5-0 (Ethicon, Norderstedt, जर्मनी) prolene sutures के चलाने के लिए त्वचा बंद का उपयोग करें.
  15. जबकि चूहे संज्ञाहरण में अभी भी है, 5 Carprofen मिग्रा / किग्रा subcutaneously इंजेक्षन.
  16. प्रक्रिया के इस प्रकार, एक एनाल्जेसिक (जैसे Metamizol के रूप में) 3 दिनों के बाद प्रत्यारोपण के लिए दर्द दवा के लिए पीने के पानी (50 मिलीग्राम प्रति 100 मिलीलीटर Metamizol) जोड़ा जाता है के लिए पर्याप्त analgesia प्रदान करते हैं.

3. EHT बाद आरोपण के bioluminescence इमेजिंग

IVIS bioimaging मंच (Xenogen, Alameda, CA, संयुक्त राज्य अमरीका) vivo में गैर इनवेसिव bioluminescence इमेजिंग के लिए प्रयोग किया जाता है और परिणाम IVIS लिविंग (Xenogen) छवि सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं. इमेजिंग दैनिक 2 घंटे postoperatively के शुरू करने के लिए किया जाता है.

एक प्रेरण कक्ष का उपयोग कर - isoflurane (3% 2.5) के साथ चूहे anesthetize.

  1. पेट और वक्ष क्षेत्र व्यापक रूप से Provo-आयोडीन, अगले 80% इथेनॉल का उपयोग, इस कदम तीन बार दोहराने का उपयोग कीटाणुरहित.
  2. आईपी ​​(375 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन Xenogen घ) Luciferin इंजेक्षन
  3. IVIS इमेजिंग कक्ष (अप करने के लिए 4 चूहों को एक ही समय में विश्लेषण किया जा सकता है है) में anaesthetized चूहों रखें.
  4. एल के संकेत तीव्रता का आकलनUC + EHT अंदर फोटॉनों / / सेक 2 सेमी / ब्याज के क्षेत्र (आरओआई) (आरोपण के बाद 120 मिनट) आधारभूत पर steridianin की इकाइयों में और 1 दिन, 2, 3, 5, 7, 10 पर, और 2 सप्ताह में कोशिकाओं, 3 और 4. चोटी संकेत (घ - Luciferin इंजेक्शन के बाद 20 मिनट के आसपास दिखाई देता है) नोट.

एक ग्राफ (एक्सेल) समय पर संकेत तीव्रता दिखा बनाएँ.

4. BLI परिणाम के सहसंबंध और ELISPOT

असुरक्षित बीएन और immunodeficient नग्न चूहों में सेलुलर में vivo प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया EHT प्रत्यारोपण के बाद अध्ययन किया गया . प्राप्तकर्ता जानवरों की तिल्ली 5 दिनों के बाद EHT प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ता splenocytes को अलग करने के लिए काटा गया था. Elispot assays का उपयोग कर के रूप में उत्तेजक औधधि और x10 5 6 प्राप्तकर्ता splenocytes EHTs (सिग्मा Aldrich, सेंट लुइस, MO, संयुक्त राज्य अमेरिका) mitomycin हिचकते प्रत्युत्तर कोशिकाओं के रूप में निर्माता प्रोटोकॉल (बी बायोसाइंसेज) IFN-γ और आईएल-4 लेपित का उपयोग करने के लिए अनुसार प्रदर्शन किया गया जांच करने के लिए प्लेटें TH1, और TH2 प्रतिक्रिया क्रमशः. IFN-γ और आईएल-4 स्पॉट immunodeficient मॉडल की तुलना में काफी असुरक्षित मॉडल में उच्च थे (IFN-γ: पी = .001, आईएल-4: पी = .023; छात्र के टी - परीक्षण).

5. प्रतिनिधि परिणाम:

चित्रा 1
चित्रा 1. BLI परिणाम और ELISPOT के सहसंबंध) असुरक्षित ब्राउन नॉर्वे और immunodeficient नग्न चूहों में vivo प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में सेलुलर EHT आरोपण के बाद अध्ययन किया गया. प्राप्तकर्ता splenocytes 5 दिनों EHT आरोपण के बाद काटा गया. IFN? और आईएल-4 अभिव्यक्ति ELISpot और प्रत्युत्तर कोशिकाओं के रूप में stimulators 5x106 प्राप्तकर्ता splenocytes रूप mitomycin हिचकते EHT का उपयोग assays के द्वारा मूल्यांकन किया गया था. TH1 और Th2 प्रतिक्रियाओं असुरक्षित मॉडल में immunodeficient मॉडल IFNγ - और उत्पादन-4 आईएल क्रमशः द्वारा evidenced के रूप में की तुलना में काफी अधिक थे. ख) ल्यूक + EHTs या तो असुरक्षित बीएन चूहों या immunodeficient नग्न चूहों की अधिक से अधिक omentus में प्रत्यारोपित किया गया. सेल अस्तित्व longitudinally BLI द्वारा पीछा किया गया था. पशुओं की दर है कि प्रतिरोपित EHTs खारिज कर दिया प्रस्तुत किया है. सभी बीएन चूहों तेजी से EHT प्रत्यारोपण खारिज कर दिया, जबकि कोशिकाओं टी सेल की कमी चूहों में बच गया.

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Discussion

हृदय की मरम्मत के लिए EHT प्रौद्योगिकी के नैदानिक ​​कार्यान्वयन के पहले, दोनों सेलुलर और मैट्रिक्स घटकों या भ्रष्टाचार अस्तित्व के आरोपण के बाद प्रतिरक्षाजनकता के रूप में मौलिक सवालों के प्रयोगात्मक मॉडल में मूल्यांकन किया जा में इन विवो bioluminescence इमेजिंग की जरूरत प्रत्यारोपण के बाद एक उपयोगी निगरानी सेल अस्तित्व के लिए नई तकनीक का प्रतिनिधित्व करता है. . हम सफलतापूर्वक आतंच आधारित EHT उत्पन्न युक्त luciferase सकारात्मक (ल्यूक +) हृदय कोशिकाओं का एक स्थापित प्रोटोकॉल 4 के अनुकूलन द्वारा . ये EHT प्राप्तकर्ता चूहों की अधिक से अधिक omentum में प्रत्यारोपित किया गया. विशिष्ट सब्सट्रेट (घ Luciferin) के Intraperitoneal इंजेक्शन संकेत है कि IVIS bioimaging मंच (Xenogen) का उपयोग detectable थे उत्पन्न करता है. आधारभूत पर सिग्नल तीव्रता (आरोपण के बाद 120 मिनट) फोटॉनों / / सेक 2 सेमी / steridian grafted EHTs अंदर कोशिकाओं की संख्या के लिए एक किराए की पैरामीटर के रूप में सेवा में मापा जाता है . रोज़ माप गैर इनवेसिव भ्रष्टाचार अस्तित्व के अनुदैर्ध्य assessement के लिए अनुमति दी. एक अस्वीकृति मॉडल में, समय पर संकेत तीव्रता के गिरावट अलग चूहा उपभेदों में तीव्रता और तीव्र अस्वीकृति के कैनेटीक्स के साथ सहसंबद्ध था.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

सोनिया Schrepfer, Lenard Conradi और Arne Hansen ड्यूश Forschungsgemeinschaft (; SCHR992/3-1, SCHR992/4-1, सीओ 858/1-1, 3423/3-1 हा DFG) से धन प्राप्त किया. काम भी यूरोपीय संघ से थॉमस Eschenhagen (EUGeneHeart और Angioscaff) अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

  • LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor-luc)11Jmsk rats (NBPR rat number 0299, http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/)
  • Bovine fibrinogen (stock solution: 200 mg/ml plus aprotinin 5 μg/ml fibrinogen in NaCl 0.9%, Sigma F4753)
  • Matrigel (BD Bioscience 356235)
  • DMEM (Biochrome F0415)
  • Horse serum (Gibco 26050)
  • Penicillin/streptomycin (Gibco 15140)
  • Insulin (Sigma-Aldrich I9278)
  • Aprotinin (Sigma Aldrich A1153)
  • d-Luciferin (Biosynth L-8220)
  • Enzyme-linked immunosorbent spot (ELISpot) assay plates (Hassa Laborbedarf, S2EM004M99)

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References

  1. Eschenhagen, T., Zimmermann, W. H. Engineering myocardial tissue. Circ Res. 97, 1220-1231 (2005).
  2. van der Bogt, K. E., Schrepfer, S., Yu, J. Comparison of transplantation of adipose tissue- and bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the infarcted heart. Transplantation. 87, 642-652 (2009).
  3. Hakamata, Y., Murakami, T., Kobayashi, E. "Firefly rats" as an organ/cellular source for long-term in vivo bioluminescent imaging. Transplantation. 81, 1179-1184 (2006).
  4. Hansen, A., Eder, A. Development of a Drug Screening Platform Based on Engineered Heart Tissue. Circ Res. (2010).

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