ترنسفكأيشن من خلايا الشبكية بواسطة الماوس العقدة في الجسم الحي Electroporation

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

علينا إثبات وجود

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Dhande, O. S., Crair, M. C. Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation. J. Vis. Exp. (50), e2678, doi:10.3791/2678 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

استهداف وتنقيح التوقعات RGC إلى الدماغ المتوسط ​​هو نظام النموذج الشعبي وقوية لدراسة أنماط كيفية الربط الدقيق لشكل العصبية خلال التنمية. في الفئران ، ويتم ترتيب التوقعات retinofugal بطريقة الطبوغرافية وشكل العين طبقات معينة في النواة الركبية الجانبية (dLGN) من المهاد وأكيمة فخمة (SC). وعادة ما يتم وضع هذه الأنماط دقيقة من الإسقاطات التي يدرسها retinofugal وسم سكان RGCs مع الأصباغ الفلورية واستشفاف ، مثل الفجل البيروكسيداز 1-4. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب الخشنة جدا لتوفير نظرة ثاقبة التغييرات التنموية في التشكل الفردية RGC محواري الشجرة التي هي أساس تشكيل الخريطة شبكي التوضع. كما أنها لا تسمح للتلاعب الجيني للRGCs.

في الآونة الأخيرة ، أصبح electroporation وسيلة فعالة لتوفير تحكم دقيق المكاني والزماني للتسليم من الجزيئات المشحونة في شبكية العين 11/05. البروتوكولات الشبكية الحالية electroporation لا تسمح للتلاعب الجيني وتتبع التوقعات retinofugal من كتلة واحدة أو قليل من RGCs في الفئران بعد الولادة. فقد قيل أن في فترة ما بعد الولادة electroporation فيفو ليست طريقة سليمة للtransfecting RGCs منذ كفاءة منخفضة للغاية وضع العلامات ، وبالتالي يتطلب تستهدف الأعمار الجنينية عند الأسلاف RGC تشهد التمايز والانتشار 6.

في هذا الفيديو تصف لنا في بروتوكول electroporation فيفو لتسليم المستهدفة من الجينات ، shRNA وdextrans الفلورسنت لRGCs الفئران بعد الولادة. هذا الأسلوب يوفر فعالة من حيث التكلفة وسريعة وسهلة نسبيا منصة لفحص كفاءة المرشحين من الجينات تشارك في العديد من جوانب التنمية بما في ذلك تراجع المحوار العصبية ، المتفرعة ، التصفيح ، وتجديد وتشكيل المشبك في مراحل مختلفة من التطوير الدائرة. باختصار نحن هنا وصف أداة قيمة التي ستوفر مزيدا من الإيضاحات عن الآليات الجزيئية الكامنة وراء الحسي التنمية الخريطة.

Protocol

1. معدات لانشاء Electroporation

  1. الأقطاب : نحن دومون تعديل رقم 5 لاستخدام الملقط والأقطاب الكهربائية.
    1. منفصلة وتحطيم ملقط.
    2. سلك لحام في نهاية كل أوسع الشق. التفاف الأسلاك المرفقة وشوكات مع الشريط العازل ترك ما يقرب من 25-30 ملم من غيض من شوكات المكشوفة.
    3. تعديل وضع ملقط معا مرة أخرى مع أي هل البلاستيك المناسبة (مثل زر) بين اثنين إلى توفير شوكات عمل الربيع.
  2. المعدات الكهربائية : نحن نستخدم مشجعا الكهربائية لإيصال النبضات الحالية لelectroporation ورصد الذبذبات الصوتية لتأكيد والموجي وعدد من البقول التي يجري تسليمها.
    1. بتوصيل سلك من الشق من ملقط لدواسة القدم التي ترتبط أيضا في سلسلة مع منشط. على دواسة القدم بمثابة التبديل. الاكتئاب عند اكتمال الدائرة انها لelectroporation.
    2. بتوصيل سلك من الشق الآخر في مشجعا الكهربائية.
    3. توصيل منشط للورصد الذبذبات الصوتية.
  3. Micropipette حاقن وانشاء : نحن نستخدم الزجاج الحادة ماصات سحبت ونظام Nanoinject حاقن الثاني لحقن كميات صغيرة جدا من الحمض النووي أو حل صبغة مباشرة في شبكية العين.
    1. جبل حاقن النظام على micromanipulator من 3 محاور.
    2. سحب ماصات زجاجية مع تفتق طويل وطرف صغير.
    3. اعادة ملء ماصة انسحب مع الزيوت المعدنية وآمنة لحاقن (لمزيد من التفاصيل انظر Nanoinect دليل التعليمات الثاني).
    4. باستخدام مقص حاد microdissecting قطع غيض من ماصة ، وخلق فتحة صغيرة (~ 2-3 ميكرومتر).
    5. ملء ماصة مع المبلغ المطلوب من خلال حقن محلول غيض من ماصة. طالما ان سلامة يحمل الطرف ، ويمكن استخدامه لحقن متعددة والحيوانات.
      ملاحظة : ط) ضمان أن يتم تحميل ما يكفي من الحقن في حل مثل هذه النصائح التي لم تحقن ردم الزيوت المعدنية في العين. ب) والثاني Nanoinject النظام والمعدات الالكترونية المستخدمة محددة في هذا الفيديو ليست مهمة لتحقيق النجاح في وضع العلامات RGCs. ويمكن أيضا حقن مصنوعة من الأجهزة الأخرى مثل picospritzer وelectroporation مع التحفيز والتشجيع مشتركة أخرى يمكن استخدامها لRGCs التسمية.

2. البلازميد حلول لوصفها RGC

  1. لوصفها مجموعات صغيرة من RGCs : نحن نستخدم بناء EGFP الترميز (~ 2-3 ميكروغرام / ميكرولتر) تعزيز البروتين الفلوري الأخضر) الخاضعة لسيطرة أحد المروجين CAG (دجاج β - أكتين المروج مع محسن CMV الفورية المبكرة). غير الموسومة EGFP مع تسلسل palmitoylation 43 - GAP (نمو بروتين يرتبط - 43) استهداف لغشاء الخلية (mut4EGFP) 12. هذا ويشار إلى أنه بناء pCAG - gapEGFP.
  2. لوصفها خلية واحدة : نحن نستخدم مزيج من اثنين من بنيات. الموجه الأول هو مروج CAG الدافعة لجنة المساواة العرقية recombinase (pCAG - لجنة المساواة العرقية ، Addgene [كامبريدج ، MA] البلازميد 13775) (13) والثاني يحتوي على ناقلات الكاسيت STOP floxed تليها غشاء استهدفت EGFP (pCAG - LNL - gapEGFP). يستخدم pCAG - لجنة المساواة العرقية (~ 0.15-ng/μL) في تركيز حوالي 1،000-10،000 أضعاف أقل من pCAG - LNL - gapEGFP (~ μgμL 1-2) ، حصر قوية التعبير EGFP على عدد صغير من الخلايا (بحكم المنخفض نسبيا ، لجنة المساواة العرقية pCAG التركيز).

3. حقن في شبكية العين والبروتوكول Electroporation

  1. يوم بعد الولادة 0 (P0) لالجراء P5 هي تخدير بواسطة حرارة الجسم ، في حين أن الفئران الأكبر سنا من P5 هي حقنة تخدير مع داخل الصفاق (0.7 مل / كغ) من مزيج من الكيتامين (4.28 ملغ / مل) ، زيلازين (0.82 ملغ / مل) وآسيبرومازين (0.07mg/ml) 14.
  2. تعقيم جميع الأدوات الجراحية ونصائح الكهربائي في حبة تعقيم الساخنة. بارد في وقت لاحق سواء في المياه المالحة عقيمة قبل استخدامها لتجنب الضرر الحراري للعين.
  3. الماوس مكان تحت نطاق تشريح وموقف حاقن.
  4. بالنسبة للفئران أصغر سنا من P14 (قبل فتح العين) ، وفتح الجفن جراحيا عن طريق قطع على طول الجفن من فتح في المستقبل مع مقص تشريح الدقيقة الربيع ب.
  5. جعل مقلة العين تبرز جزئيا عن طريق تطبيق الضغط بلطف حول العين مع نصائح من ملقط ج.
  6. عقد في عين المكان بواسطة معسر برفق الجلد حول مقلة العين.
  7. ضبط وتحقيق micromanipulator ماصة على مقربة من مقلة العين.
  8. اضغط على دواسة القدم ، والتي يتم توصيلها إلى نظام Nanoinject الثاني ، لطرد بضع قطرات من محلول الحقن ، وبالتالي تحقق من عدم انسداد ماصة.
  9. مع من ناحية الاستقرار في مقلة العين ، نقل micromanipulator ان هذه غيض من الزجاج ماصة تخترق الظهارة الصبغية الشبكية ويدخل في شبكية العين.
  10. حقن قصرIRED مبلغ حل عن طريق الضغط على دواسة القدم لنظام Nanoinject الثاني. على سبيل المثال ، لتسمية واحدة RGCs نجعل حقنة واحدة من 4.6nL - 2.3.
  11. التراجع عن ماصة والمكان بعناية نصائح الكهربائي مباشرة عبر موقع الحقن وخفض دواسة القدم لمشجعا لاستكمال الدائرة وelectroporate العين. نحن عادة استخدام النبضات مربع مع ضبط قوة 25V ، 50msec المدة ، 1sec إربا. وتطبق 10 البقول (5 نبضات من كل الاقطاب) ليتم تطبيقها الفئران الأكبر سنا من البقول وP4 6 (3 نبضات من كل الاقطاب) لP0 على الفئران P3.
  12. دفع برفق مقلة العين مرة أخرى إلى مأخذ وتطبيق مرهم عيني عقيم حول خفض الجفون.
  13. الحيوانات مكان على منصة الحرارة درجة الحرارة للرقابة وعلى الانتعاش الكامل ، بما في ذلك إعادة التدفئة الكافية والتنقل ، والعودة إلى الحيوانية والدتهما.
  14. رصد الحيوانات كل 12 ساعة لتوقيع أي ضائقة أو ألم أو انزعاج ، مثل فقدان الحركة ، وموقف غير طبيعي أو عدم العريس. لا ينبغي أن الجولات المتكررة من الحقن والتخدير وelectroporation سيتم تنفيذه على نفس الحيوان.

4. تلاحظ

  1. طريقة الحقن وصفها في هذا الفيديو هو "أعمى" الحقن. فمن الممكن تصور حجم ومكان الحقن عند العمل مع الفئران البيضاء والحلول الملونة (الجاذبة أو حل البلازميد مع كميات ضئيلة من اللون الأزرق بسرعة). ومع ذلك ، مع سلالات الفئران يمكن المصطبغة موقع الحقن لا يمكن تصور مباشرة ، وبالتالي فمن الصعب وصف ما إذا كان أحد لفظيا وصلت الى المكان المقصود في شبكية العين أو إلى أي مدى ينبغي لأحد أن نقل ماصة لاستهداف طبقة RGC على وجه التحديد. لذا ، فإننا ننصح بشدة المستخدمين الجدد للبدء أولا حقن الفئران البيضاء الجاذبة في هذه الحقن منذ يمكن تصور على الفور في شبكية العين ، ويمكن استخدامها بوضع العلامات على إسقاطات RGC لشبكية العين والدماغ لتقييم نوعية الحقن. إعداد صلاح الغيدان 10 ٪ في N ، N - ثنائي ميثيل الفورماميد (100 ٪) لحقن التنسيق. يجب على المستخدمين بمجرد يتقن هذا الإجراء تكون قادرة على استهداف RGCs باستمرار مع حلول الحمض النووي البلازميد واضحة في الفئران مصطبغة.
  2. ويمكن استخدام طريقة الحقن وصفها في هذا الفيديو لجعل التنسيق الحقن الجاذبة لتسمية المجموعات الصغيرة من الخلايا لدراسة retinotopy (4.6nL التسميات بضع مئات RGCS) 14 وRGCs التسمية بالجملة مع fluorophores (Alexa555 ، 488 الخ) لمترافق باء الكوليرا الوحيدات السم لدراسة العين محددة العزل ، باستثناء الخطوة electroporation في # 10 أعلاه. ينصح أقصى حجم حقن مجموع 3uL - 2 لكبار السن من الفئران P14 و 1 2uL مقابل أقل من الفئران P14 من أي حل.
  3. يمكن ردم ماصات مع الحلول ليتم حقنه تليها الردم مع الزيوت المعدنية قبل تركيب ماصة على حاقن وكسر الحافة. هذا مفيد خصوصا عند استخدام تركيز عالية حلول الحمض النووي (~ 6ug/uL) ، والتي هي عامة لزجة وصعبة جدا لتحميل من غيض من ماصة.
  4. إذا كان انسداد ماصة الزجاج ، بعناية يمسح غيض ماصة مع مسحة القطن المنقوعة في الماء لحلول الحمض النووي والإيثانول (100 ٪) عن حلول (صلاح الغيدان) صباغة.
  5. بعد الحقن في العين ، والتراجع عن الحافة ماصة من مقلة العين واضغط على دواسة القدم لحقن مرة أخرى. هذا هو لتأكيد أن لا يحصل انسداد تلميح أثناء عملية الحقن. إذا تم الاستغناء عن أي حل ، فمن المرجح تماما أن الحقن لم يكن ناجحا. ومع ذلك ، لا ينبغي أن تؤخذ على أنها علامة المطلق بأن الحقن لم يكن ناجحا. قد المجرب حقن نفسه مرة أخرى إذا كان العين هو المطلوب مواقع متعددة الحقن ووضع العلامات على عدد أكبر من الخلايا.
  6. لوصفها RGCs واحد ، تعيين سرعة الحقن البطيء في خانة السيطرة Nanoinject. هذا أيضا يقلل من كمية من محلول يحقن في شبكية العين والنظام وقتا أكثر في هذا الإعداد إلى الاستغناء عن الحل بينما يتم في الوقت نفسه تراجع غيض من الماصات الزجاج بسرعة من مقلة العين.
  7. Electroporation من اليوم بعد الولادة 0-3 (P0 الى P3) الفئران يتطلب عناية إضافية نظرا لأنه من السهل جدا أن تلف العين (وهذا يصبح واضحا بعد بضعة أيام من التعافي ، وعندما عين واضح هو أصغر من المعتاد). خفض عدد من البقول والجهد لتطبيقها ينصح الفئران حديثي الولادة المبكرة. بعد P4 ، ومقل العيون هي أكثر مقاومة للضرر من electroporation.
  8. في إصدارات لدينا خبرة موجهة من الغشاء EGFP أو RFP ('gapEGFP" ، راجع 12) هي أفضل بكثير من GFP معدلة لدراسة التوقعات retinofugal إلى الدماغ. ومع ذلك ، pCAG - tdTomato ، التي تفتقر إلى غشاء استهداف التعديل ، كما تعمل بشكل جيد (الشكل 1E). بالإضافة ، يمكن أيضا الأصباغ الفلورية ديكستران مترافق يمكن استخدامها لتسمية RGCs باستخدام بروتوكول electroporation المذكورة أعلاه.
  9. عادة ، فإن 9 من كل 10 الحقن يؤدي إلى RGCs المسمى ، على الرغم من فقط حوالي 15 ٪ من عمليات الحقن مع النهج المزدوج سوف البلازميدالنتيجة في RGC واحد فقط وصمها. ويمكن زيادة عدد الحالات الناجحة عن طريق حقن الحمض النووي في مواقع متعددة في عين واحدة أو عن طريق حقن البلازميدات ترميز البروتينات الفلورية مختلفة في كل عين.

5. ممثل النتائج

ولوحظ RGC الوسم في جميع الأعمار ، بدءا من P2 إلى P25 ، مع وضع العلامات في EGFP RGCs بواسطة 24hrs بعد electroporation التعبير والحفاظ عليها لثلاثة أسابيع على الأقل بعد ترنسفكأيشن.

يمكن التشعبات fluorescently المسمى (الشكل 1A ، B) والعرش محواري (الشكل 1F) من RGCs احد يمكن تصور واضح وإعادة بنائها.

وبصرف النظر عن RGCs ، يمكن استخدام هذه التقنية لتسمية أنواع أخرى مثل خلايا الشبكية الخلايا الأفقية ، وخلايا بين القطبين ، ومختلف أنواع فرعية عديم الاستطالات الخلية (الشكل 1C)

هذا الأسلوب لا تتداخل مع دوام العادي من الصقل خريطة البصرية كما يتضح من retinotopy العادية في SC (الشكل 1E).

في جميع الأعمار ، وأدى حوالي 90 ٪ من الحالات ، وهي الحقن ذات الحجم الصغير (~ 2.3 4.6nL) من pCAG - gapEGFP التعبير في RGCs قليلة (1D الشكل).

في حوالي 15 ٪ من التجارب باستخدام حقنة واحدة من لجنة المساواة العرقية ، وpCAG البلازميدات تركيبة pCAG - LNL - gapEGFP للحيوان الواحد ، أدت إلى واحد بما في ذلك وضع العلامات العصبية في الشبكية RGCs (الشكل 1A ، B ، D) وغيرها من أنواع الخلايا مثل عديم الاستطالات الخلايا (الشكل 1C).

الشكل 1
الشكل 1 -- ألف ، باء المسمى أمثلة من واحد EGFP خلايا الشبكية العقدة (رئيس السهم مشيرا الى محور عصبي) في شبكية العين شقة في جبل ما بعد الولادة لمدة 14 يوما (P14) جيم مثال واحد من الخلية عديم الاستطالات النجمي في P8 د. وتم electroporated كتلة من الخلايا العصبية للشبكية EGFP المسمى بما RGCs عديم الاستطالات وخلايا الشبكية في شقة في جبل P14 RGCs هاء. الظهرية والبطنية في العين اليمنى والمسمى مع EGFP RGCs والزمانية وبطني في العين اليسرى وكان مطلي المسمى مع tdTomato في P1. ويمكن رؤية المناطق المستهدفة (النجمة) التي شكلتها RGCs المسمى في موقعها الصحيح في الطوبوغرافي SC في P9 (جبل بأكمله ، مخطط بيضاء). F. مثال واحد من EGFP المسمى RGC الشجرة (2 - D الإسقاط) في مقطع سهمي (250 ميكرون سميكة) من اتفاقية استكهولم (الخط المنقط). من أجل الوضوح والصور في (D) و (F) قد تم تحويلها إلى الرمادي والمقلوب. أشرطة النطاق (ميكرومتر) : (أ) -- (D) ، (F) : 100 ؛ (E) : 500

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا الفيديو إثبات وجود لنا في بروتوكول electroporation المجراة أن النتائج في مجموعات واحدة من العلامات أو صغيرة من الخلايا العصبية للشبكية في الفئران بعد الولادة مع الحمض النووي الترميز يبني البروتينات الفلورية. مستنسخة مجموعات صغيرة من إسقاطات RGC fluorescently المسمى إلى dLGN وSC أنماط مماثلة لإسقاط الدراسات السابقة باستخدام العلامات RGC مع الأصباغ محبة للدهون ، مشيرا إلى أن electroporation لم تتدخل العادي RGC صقل جذع محور عصبي. وقد استخدمت ونحن على هذا البروتوكول لتحليل خريطة شبكي التوضع على مستوى كل واحد ومجموعات RGCs في نماذج مختلفة مع الماوس العادي الخرائط البصرية وتعطلت.

نتائجنا تظهر ان الخلايا العصبية يمكن أن تكون متباينة في شبكية العين شبكية العين بعد الولادة transfected موثوق به في electroporation الجسم الحي. ووصف ما بعد الولادة في الجسم الحي electroporation بروتوكول يسمح هنا لوصفها في وقت واحد والتلاعب الجيني للRGCs بطريقة محدودة زمنيا ومكانيا. نظهر توسيم الخلايا العصبية للشبكية باستخدام مزيج من لجنة المساواة العرقية البلازميدات recombinase الترميز ومراسل الفلورسنت يسبقه تسلسل STOP floxed. ويتحقق متسقة ترنسفكأيشن عصبون واحد باستخدام تركيز منخفض للغاية لجنة المساواة العرقية البلازميد النسبي لمراسل البلازميد. بالمقارنة مع electroporation في الرحم ، وهذا الأسلوب هو أقل الغازية ، ولا تتداخل مع بداية الأحداث التوجيه محور عصبي مثل عبور الحدود في chiasm البصرية. بالإضافة إلى ذلك ، بالنسبة إلى النهج الفيروسي ، وأنها تتطلب وقتا أقل للتعبير الجينات القوية وأقل سمية. توفر هذه الأداة وسيلة فعالة وسريعة لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية التوسط في صقل ونضج retinofugal التوقعات سواء على المستوى الإجمالي الهيكلي ومتشابك من خلال misexpression أو نهدم من الجينات المرشحة في الجسم الحي مع استهداف RGCs تسمية فلوري أيضا يمكن استخدامها لفي الجسم الحي اثنين الفوتون التصوير ديناميات محوار RGC وخصائصها الفسيولوجية. وباختصار ، فإن القدرة على استهداف وراثيا ووضع تصور لRGCs في الجسم الحي بعد الولادة ، سوف تساعد في الكشف عن مزيد من الآليات الخلوية والجزيئية التي تنظم دائرة التنمية في النظام ماوس بصرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

كان البلازميد pCAG - gapEGFP هدية من الدكتور س. ماكونيل (ستانفورد ، كاليفورنيا). وكان pCAG - tdTomato البلازميد هدية من الدكتور محمد فيلر (بيركلي ، كاليفورنيا). نشكر الدكتور إدوارد Ruthazer لاقتراح استخدام استراتيجية ثنائية البلازميد لوصفها خلية واحدة وSchohl آن (مونتريال ، QC) للتثبت من صحة اثنين البلازميد لجنة المساواة العرقية / loxP استراتيجية في الدراسات التجريبية وأفراد المختبر Crair للدعم التقني. بدعم من R01 MH62639 (MC) ، NIH R01 EY015788 (MC) ، والمعاهد الوطنية للصحة P30 EY000785 (MC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20
Electrical Stimulator Grass Technologies Model S4
Oscilloscope Agilent Technologies Model 54621A
Audio monitor Grass Technologies Model AM8B
Puller Sutter Instrument Co. Model P-97
Vannas Scissors a World Precision Instruments, Inc. 14003
Micro Scissors b Ted Pella, Inc. 1347
Dumont AA Forceps c Fine Science Tools 11210-20
Nanoinject II System Drummond Scientific 3-000-204
Glass Pipettes Drummond Scientific 3-000-203-G/X
Foot pedal Drummond Scientific 3-000-026
Mineral Oil Sigma-Aldrich M3516
DiI Invitrogen D-383
N,N-Dimethylformamide Sigma-Aldrich D4551

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huberman, A. D., Feller, M. B., Chapman, B. Mechanisms underlying development of visual maps and receptive fields. Annu Rev Neurosci. 31, 479-509 (2008).
  2. McLaughlin, T., Torborg, C. L., Feller, M. B., O'Leary, D. D. Retinotopic map refinement requires spontaneous retinal waves during a brief critical period of development. Neuron. 40, 1147-1160 (2003).
  3. Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. Prenatal and postnatal development of retinogeniculate and retinocollicular projections in the mouse. J Comp Neurol. 230, 552-575 (1984).
  4. Jaubert-Miazza, L. Structural and functional composition of the developing retinogeniculate pathway in the mouse. Vis Neurosci. 22, 661-676 (2005).
  5. Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation. BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).
  6. Matsuda, T., Cepko, C. L. Analysis of gene function in the retina. Methods Mol Biol. 423, 259-278 (2008).
  7. Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. (2009).
  8. Ishikawa, H. Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode. Gene Ther. 12, 289-298 (2005).
  9. Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J Vis Exp. (2008).
  10. Ruthazer, E. S., Haas, K., Javaherian, A., Jensen, K., Sin, W. C., Cline, H. T. In vivo time- lapse imaging of neuronal development. Imaging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. Yuste, R., Konnerth, A. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 191-204 Forthcoming.
  11. Kachi, S., Oshima, Y., Esumi, N., Kachi, M., Rogers, B., Zack, D. J., Campochiaro, P. A. Nonviral ocular gene transfer. Gene Ther. 12, 843-851 (2005).
  12. Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein. Exp Neurol. 156, 394-406 (1999).
  13. Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1027-1032 (2007).
  14. Plas, D. T. morphogenetic proteins, eye patterning, and retinocollicular map formation in the mouse. J Neurosci. 28, 7057-7067 (2008).

Comments

6 Comments

  1. What type of solder do you recommend?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 29, 2011 - 7:28 PM
  2. This is the solder we used: Rosin Core Solder from Kester (Model 81-4000-0000)

    Reply
    Posted by: Onkar D.
    May 2, 2011 - 11:04 PM
  3. Thanks! I have tried soldiering our inox alloy forceps using a rosin core solder but it has been hard to get the solder to stick. I will give it another shot.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 2, 2011 - 11:14 PM
  4. We sometimes apply superglue on top of the solder to make it stick.

    Reply
    Posted by: Onkar D.
    May 2, 2011 - 11:31 PM
  5. When soldering stainless steel you need to use specific soldering flux that chemically removes oxides from metal surfaces to enable the flow of filler metals on base metals.

    Typically I use a high acid zinc chloride flux.

    I would dip both metal tips in the flux, warm the flux on the metals with the soldering iron, put the metals together, then hot solder the two ends together.

    Super glue sometimes works if the metal is etched and if the superglue base is made from arachidonic acid.
    Good luck!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 3, 2011 - 10:14 AM
  6. Thank you for your JOVE article, very interesting and helpful. Our goal is a little different. We would like to get plasmid expression in as many RGCs as possible, and would like to do the electroporation in adults (rats or mice) if possible. Would you have any suggestions for achieving this goal? Thanks, Don

    Reply
    Posted by: Don Z.
    October 7, 2012 - 11:21 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics