Isolando Nasal Células-Tronco olfativo dos roedores ou humanos

Neuroscience
 

Summary

Descrevemos aqui um método para biopsying mucosa olfativa de ratos e humanos cavidades nasais. Essas biópsias podem ser utilizados tanto para identificar anomalias molecular em doenças cerebrais ou isolar células-tronco adultas multipotentes que podem ser utilizados para o transplante de células em modelos animais de trauma cerebral / doença.

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Girard, S. D., Devéze, A., Nivet, E., Gepner, B., Roman, F. S., Féron, F. Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans. J. Vis. Exp. (54), e2762, doi:10.3791/2762 (2011).

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Abstract

A mucosa olfativa, situado na cavidade nasal, é responsável pela detecção de odores. É também o único tecido nervoso que está exposta ao ambiente externo e de fácil acesso em cada indivíduo vivo. Como resultado, este tecido é única para qualquer pessoa com o objetivo de identificar anomalias molecular no cérebro patológico ou isolar células-tronco adultas para terapia celular.

Anormalidades moleculares em doenças cerebrais são frequentemente estudadas usando amostras de tecido nervoso coletado post-mortem. No entanto, este material tem limitações numerosas. Em contraste, a mucosa olfativa é facilmente acessível e pode ser biopsiados com segurança, sem qualquer perda de sentido do olfacto 1. Assim, a mucosa olfativa fornece uma "janela aberta" no ser humano adulto através da qual se pode estudar de desenvolvimento (por exemplo, autismo, esquizofrenia) 2-4 ou neurodegenerativas (Parkinson, por exemplo, Alzheimer) doenças 4,5. Mucosa olfativa pode ser usado tanto para estudos comparativos molecular 4,6 ou em experimentos in vitro na neurogênese 3,7.

O epitélio olfativo também é um tecido nervoso que produz novos neurônios a cada dia para substituir aqueles que estão danificados pela poluição, bacteriana de infecções virais. Este neurogênese permanente é sustentada pelos progenitores, mas também células-tronco que residem em ambos os compartimentos da mucosa, ou seja, o neuroepitélio e 10/08 lâmina própria subjacente. Recentemente, desenvolveu um método para purificar as células-tronco adultas localizadas na lâmina própria e, depois de ter demonstrado que elas estão intimamente relacionadas com a medula óssea células-tronco mesenquimais (MSC-BM), que nomeou células olfativas ecto-mesenquimais (OE- MSC) 11.

Curiosamente, quando comparado ao BM-MSCs, OE-MSCs exibir uma alta taxa de proliferação, uma clonogenicity elevada e uma inclinação de se diferenciar em células neurais. Aproveitamos essas características para realizar estudos dedicados a desvendar genes novo candidato na esquizofrenia e 4 da doença de Parkinson. Nós e os outros também têm demonstrado que OE-MSCs são promissores candidatos para terapia celular, depois de um trauma na medula espinhal 12,13, a lesão coclear 14 ou em um modelo animal da doença de Parkinson 15 ou amnésia 16.

Neste estudo, apresentamos métodos para biópsia da mucosa olfativa em ratos e seres humanos. Após a coleta, a lâmina própria é enzimaticamente separada do epitélio e as células-tronco são purificados usando um enzimáticos ou um método não-enzimática. Purificada de células-tronco olfativas pode então ser cultivado em grande número e depositado em nitrogênio líquido ou induzido a formar esferas ou diferenciados em células neurais. Essas células-tronco também podem ser usados ​​para omics comparativa (genômica, transcriptomic, epigenômico, proteômica) estudos.

Protocol

1. Coleção de Mucosa olfatória em Ratos

  1. Comece preparando três pratos de 35 milímetros Petri cheia de DMEM / HAM F12 meio de cultura em uma capa cultura limpa.
  2. Qualquer método de eutanásia deve ser previamente aprovado pelo cuidado da instituição animal e comissão de uso e realizado por pessoal qualificado. Depois que o rato entrou anestesia profunda com pentobarbital sódico ou outras formas de anestesia injetável, tais como a cetamina / xilazina, decapitar e remover a pele. Os anestésicos inalantes deve ser evitado. Adequação da anestesia será avaliada por pinch pés antes de decapitação. Remova o maxilar inferior com uma tesoura e com a ajuda de um rongeur, eliminar os músculos faciais de ambos os lados.
  3. A partir da volta dos incisivos, retire com uma rongeur o osso que cobre a cavidade nasal, um lado de cada vez. Cornetos olfativa entram em vista como laranja / marrom órgãos localizados na parte de trás do nariz.
  4. Delicadamente descartar as conchas com uma pinça. Usando uma agulha de calibre 26, isolar a mucosa olfativa deitado no septo, cortando o tecido ao longo de três linhas: o arco da placa perpendicular, lâmina crivosa e teto da cavidade nasal.
  5. Coletar biópsias de ambos os lados e transferi-los em um DMEM / HAM placa de Petri F12-cheia. Este procedimento não deve demorar mais do que 10 minutos do início da eutanásia.
  6. Agora, a fim de remover o muco, a transferência das biópsias duas vezes em pratos de Petri cheia médio.

2. Coleção de Mucosa olfatória em seres humanos

  1. Este procedimento deve ser realizado por um Ouvido, Nariz e Garganta (ENT) cirurgião, de acordo com o comitê de ética local relevante (s), e cada ambulatorial deve assinar um termo de consentimento informado.
  2. Usando um 0 ° ou 30 ° endoscópio rígido (4 mm de diâmetro), inspecionar ambas as fossas nasais e avaliar a presença de pólipos putativa ou qualquer lesão inflamatória. Escolher a melhor cavidade nasal, tendo em conta o desvio do septo.
  3. Usando um aplicador de algodão, aplicar uma anestesia local, como a lidocaína com epinefrina, por 10 minutos.
  4. Com uma pinça throughcut etmóide, coletar uma biópsia dois quadrados milímetros ou na raiz do aspecto medial da concha média ou no septo na área dorsomedial.
  5. A biópsia olfativa é então transferido, usando uma agulha estéril, em um tubo estéril 2 ml preenchida com 1 ml de DMEM / HAM F12. Dica do tubo de cabeça para baixo para se certificar de que a biópsia está imerso em meio de cultura.
  6. Insira o tubo em um recipiente refrigerado e transportá-lo para o laboratório de pesquisa. Nesta fase, a biópsia pode ser usado por si para estudos comparativos molecular focada em doenças específicas do cérebro ou processados ​​para gerar células-tronco.

3. Isolamento de células estaminais da mucosa olfativa Humanos e Rat

  1. Lavar as biópsias em DMEM / HAM F12. Incubar as biópsias em um prato de Petri preenchida com 1 ml de solução dispase II (2,4 UI / ml), por 1 hora a 37 ° C.
  2. Em seguida, sob um microscópio de dissecação com uma luz difratada invertido, o epitélio olfativo é removido da lâmina própria subjacente usando uma espátula de micro.
  3. O epitélio olfativo é mais fino e olha translúcido sobre um fundo preto em comparação com a lâmina própria que é listrada de laranja / marrom. Sobre um fundo branco, o epitélio parece cinza e lâmina própria, marrom.
  4. Uma vez purificado, transferir a lâmina em uma placa de Petri cheia de DMEM / HAM F12.
  5. Se o tecido é de um roedor, em seguida, corte da lâmina própria em pequenos pedaços com duas agulhas 25. Em seguida, transferir as peças para um tubo de 15 ml preenchida com 1 ml de colagenase IA.
  6. No tubo, com uma pipeta de plástico estéril, dissociar o tecido. Então, incubar o tubo por 10 minutos a 37 ° C.
  7. Para terminar a dissociação, agite levemente o tubo e adicionar 9 ml de Ca-Mg-livre e livre PBS e centrifugar a 200 g por 5 minutos.
  8. Ressuspender o pellet celular em DMEM / HAM F12 meio de cultura suplementado com soro bovino fetal a 10%, antibióticos e placa em placas de cultura de plástico.
  9. Agora, se o tecido é humano, então a fatia de lâmina em 3 a 4 peças com uma espessura variando de 200 a 500 mm.
  10. Inserir cada tira em seu prato 2 centímetros de diâmetro própria cultura e cobrir o tecido com 1,3 centímetros de diâmetro estéril lamínulas de vidro.
  11. Então, adicionar 500 mL de meio de cultura (DMEM / HAM F12 suplementado com soro bovino fetal 10% e antibióticos) para cada placa de cultura.
  12. Para qualquer tipo de tecido, renovar o meio de cultura a cada 2 a 3 dias.
  13. Cinco a sete dias após, as células-tronco começará a invadir a placa de cultura e após duas semanas devem ser confluentes. Quando confluência é atingido, a passagem e transferência das células para frascos de cultura.

4. Formação esfera e difere Neuronalntiation de Células-Tronco Olfactory

  1. Para gerar esferas de células-tronco, incubar os frascos por duas horas a 37 ° C com poli-L-lisina. (TEXTO: 5 g/cm2).
  2. Placa as células com uma densidade de 16.000 células por centímetro quadrado nos frascos tratada.
  3. A cada dois dias, alimentar as células com 0,2 ml por centímetro quadrado de meio suplementado (DMEM / HAM F12 suplementado com insulina, transferrina, selênio (ITS-X, 1%), EGF (50 ng / ml) e FGF2 (50 ng / ml)).
  4. Dois a cinco dias depois, recolher as esferas de células de flutuação e ou re-plate ou dissociá-los antes do miocárdio em modelos animais de terapia celular.
  5. Para diferenciar as células-tronco em neurônios olfativos células semelhantes, cultivá-las por 21 dias em meio contendo Neurobasal B-27, a penicilina, estreptomicina glutamina e glutamato.
  6. Em seguida, fazer mudanças de médio a cada 3 dias. Neurônio-como pilhas deve aparecer após 2-3 semanas.

5. Resultados representativos:

Nasal humana explante-outgrowing células-tronco (Figura 2A) estão se dividindo rapidamente e confluência pode ser alcançado dentro de 1-2 semanas. Uma característica chave da stemness, expressão nestina, foi avaliado (Figura 2B). Quando cultivada em poli-L-lisina com um meio de cultura sem soro suplementado com EGF (50 ng / ml) e FGF2 (50 ng / ml), as células-tronco olfativas dar origem a esferas (figura 2C). Quando cultivada em soro contendo meio de cultura recém-esferas banhado dar origem a células que expressam GFAP (~ 50%), tubulina células que expressam (~ 10-15%) e O4 células que expressam (~ 2-5%) 9 (Figuras 2D-F). No entanto, o destino das células-esfera derivada pode ser modificado. Por exemplo, quando cultivada em meio de cultura suplementado com B27 Neurobasal e glutamato, a maioria dos nasal células-tronco em neurônios olfativos semelhantes células expressando β-tubulina III (Figura 2G) e MAP2 (Figura 2H).

Figura 1
Figura 1. Esquema geral do experimento. Biópsias mucosa olfativa são excisadas de rato ou cavidade nasal humana. Explantes podem ser usados ​​por si só para fins comparativos, estudos moleculares visando identificar biomarcadores em doenças cérebro. Para isolar células-tronco olfativas, as interações entre a lâmina própria eo epitélio neuro-são interrompidas com o II dispase enzima e, após 45 minutos, o epitélio é removido com uma espátula micro. Células-tronco de roedores olfativos são mais selecionados por dissociar a lâmina com colagenase IA. Para o tecido humano, pedaços de lâmina olfativa são cultivadas em lamínula de vidro até que as células-tronco outgrowing invadir todo o bem. Depois de proliferação, usando um meio de cultura apropriado, células-tronco olfativas pode gerar esferas ou se diferenciar em neurônio-como pilhas. Células-tronco olfativas pode ser usado para i) doenças reparação cerebral ou trauma ou ii) identificar marcadores moleculares do centro de doenças do sistema nervoso. Ilustrações são feitas com a ajuda de Servier Arte Médica.

Figura 2
Figura 2. Cultura e diferenciação de células-tronco humanas nasal olfativo. Células-tronco humanas crescem fora da lâmina própria explante (A) se dividem rapidamente, quando cultivadas em meio de soro contendo. Células-tronco expressar a stemness marcador nestina (B). Quando semeadas em poli-L-lisina revestido de plástico e cultivadas em meio de cultura sem soro suplementado com EGF e FGF2, células-tronco olfativas gerar esferas (C). Esfera células derivadas, quando banhado no soro contendo meio de cultura, dar origem a células que expressam GFAP (~ 50%), tubulina células que expressam (~ 10-15%) e O4 células que expressam (~ 2-5%) 9 (DF). Quando cultivada em meio de cultura suplementado com B27 Neurobasal e glutamato, que se diferenciar em neurônio-como células que expressam β-tubulina III (G) e MAP2 (H).

Discussion

As técnicas apresentadas aqui fazer o roedor e mucosa olfativa humana um modelo útil para a investigação clínica sobre as causas de doenças neurodegenerativas e do desenvolvimento neurológico, bem como uma ferramenta para reparar o cérebro patológicos ou traumatizados. O protocolo é relativamente simples e pode ser facilmente realizado por um biólogo celular experientes. A taxa de sucesso para as técnicas de biópsia e cultura é alto.

Etapas críticas

  • Para a coleta de mucosa olfativa em roedores, é recomendado não exceder um limite de tempo de 10 minutos entre a eutanásia ea excisão final do tecido olfativo.
  • A dissociação da lâmina própria de roedores olfativa é geralmente obtida após 10 min. incubação em colagenase IA. Se não, recomendamos a recolher no dia seguinte o sobrenadante em que os bits não dissociado do flutuador lâmina própria, centrífuga que em 200 g e mecanicamente dissociar a lâmina flutuante usando uma pipeta Pasteur antes repique as células em um novo poço. O primeiro poço que contém as células já anexado é preenchido com meio de cultura fresco.
  • Para a lâmina própria humana, que é mais compacto que o tecido de roedores, não recomendamos uma dissociação enzimática. O tecido é cortado e cada explante é inserido entre o fundo do prato de plástico e uma lamela de vidro. Culturas bem sucedidas incluem explantes cuja espessura variam de 200 a 500 mm.

Possíveis modificações

  • O protocolo atual pode ser ligeiramente modificada, a fim de gerar neurônios olfativos in vitro. Para esse efeito, o neuro-epitélio não é removido ea mucosa olfativa é todo cortado com um helicóptero McIlwain (200 espessura mm). Cada explante é banhado em um prato, parcialmente secos durante uma hora e depois reidratados com FCS contendo meio de cultura. Durante os primeiros dias pós-revestimento, células epiteliais e mesenquimais crescer fora do explante. Então, progenitores neurônio vai migrar no topo desta camada de células e se diferenciar em neurônios.
  • Purificação de células-tronco olfativas pode ser conseguido usando citometria de fluxo. Marcadores de superfície específicos podem ser recuperadas a partir da lista publicada no jornal caracterização 11.
  • Para experimentos de transplante, é possível usar uma linhagem de ratos cujas olfativa células-tronco são GFP-positivo. Esta cepa de ratos (Sprague Dawley, eGFP conduzido pelo promotor PGK) está disponível em ITERT (Nantes, França). Para inserir o gene GFP em células-tronco olfativas, nós usamos um método baseado na infecção lentivírus.
  • Este trabalho está focado em células olfativas ecto-mesenquimais. No entanto, outro tipo de célula de interesse, as células olfativas ensheathing, pode ser purificado a partir do mesmo tecido. Nós descrevemos um método para a sua recolha e tratamento 1,17 e usamos nasal humana células ensheathing para um ensaio clínico de fase I / IIa clínicos em pacientes paraplégicos 18.
  • Como um membro da superfamília de células-tronco mesenquimais, OE-CTMs são capazes, sob condições de cultivo adequado, para se diferenciar em adipócitos, osteócitos e miócitos 11.

Aplicações futuras

  • Nós já usamos humana biópsias olfativa para estudar anomalias celulares e moleculares em pacientes com autismo, transtorno bipolar, disautonomia familial, doença de Parkinson, doença de Alzheimer e esquizofrenia 2-7. Teoricamente, todas as doenças do cérebro podem ser estudadas usando biópsias nasais ou periférico de células-tronco olfativas.
  • Roedores e humanos nasal células-tronco olfativas já foram enxertados em modelos animais de amnésia, doença de Parkinson, lesão coclear e traumas da medula espinhal 12-16. É concebível para o transplante destas células em modelos animais da doença de Alzheimer, isquemia cerebral, esclerose múltipla.

Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado financeiramente pela ANR (Agence Nationale de la Recherche), AFM (Association Française contre les Miopatias), FEDER em PACA e Irme (Institut de Recherche sur la Moelle épinière et l'Encephale). Nós agradecem Marie Pierre Blanchard (Jean Roche Institute) por sua ajuda eficiente durante a gravação de lapso de tempo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collection of olfactory mucosa in rats
DMEM/HAM F12 Invitrogen 31331-028
Sodium Pentobarbital
Rongeur Fine Science Tools
26 gauge needle Terumo Medical Corp. NN-2613R
Forceps
Collection of olfactory mucosa in humans
Rigid endoscope Karl Storz or Richard Wolf Medical
Lidocaine
Epinephrine
Throughcut ethmoid forceps Karl Storz or Richard Wolf Medical
Isolation of olfactory stem cells
Dispase II Roche Group 10 295 825 001
Dissecting microscope
Micro spatula Fine Science Tools
Collagenase IA Sigma-Aldrich C9891
Ca-free/Mg-free PBS Invitrogen 14190-250
Fetal calf serum Invitrogen 10270098
Glass coverslip Knittel Glaser 001/35
Sphere formation and neuronal differentiation
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P-1274
Insulin transferrin selenium (ITS) Invitrogen 51500056
EGF R&D Systems 236-EG
FGF2 R&D Systems 233-FB
Neurobasal medium Invitrogen 21103-049
B-27 Serum-Free Supplement Invitrogen 17504-044
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15140122
Glutamine Invitrogen 25030024
Glutamate Sigma-Aldrich

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References

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Comments

12 Comments

  1. Hi, firstly I`d like to thank you so much to share this valuable method. I followed your procedure with 8 week old mice and found difficulty with isolation of lamina propria from the epithelium so I skipped that step and seeded whole cells. Is it possible to obtain the stem cell population from mixed cells?

    Reply
    Posted by: Yoojin S.
    January 15, 2013 - 3:05 AM
  2. It's possible to skip the separation step (removal of olfactory epithelium). At the start, you'll get an unpurified culture but olfactory neurons and progenitors will die within the next three or four days. Some basal and supporting cells will remain in your culture but, after passaging, they will disappear and you'll end up with a culture of proliferative stem cells.

    Reply
    Posted by: francois f.
    January 16, 2013 - 4:07 AM
  3. Thank you again!
    I have some more questions about the morphology of ŒSC and subculture step.
    1. In the mixed (un-seperated) culture, I found various cell types and most of them are on the process of death but few cells seem to proliferate in compact manner. They look like pebbles. Are they ŒSCs?
    ². What reagent do I have to use for subculture? (i.e trypsin or accutase....)
    I greatly appreciate for your kindness. Thank you.

    Reply
    Posted by: Yoojin S.
    January 17, 2013 - 5:34 AM
  4. Answers:
    1. All mature neurons (the vast majority of cells within the epithelium) die shortly after plating. Three main cell types survive: ensheathing cells, stem cells (both cell types display an elongated morphology) and horizontal basal cells (they look like cobblestones). Horizontal basal cells will disappear after passaging and stem cells will overwhelm ensheathing cells.
    ². We passage the cells with the usual cocktail trypsin/EDTA (5 minutes at 37°C).

    Overall, human and rat olfactory stem cells are highly proliferative. Mouse olfactory stem cells are in small number and divide less rapidly.

    All the best.

    Reply
    Posted by: francois f.
    January 17, 2013 - 7:31 AM
  5. Thanks a lot. It Did Worked, I think. While I`ve been studying about Œ-MSCs, I`m wondering if these cells can produce OSNs themselves because in my knowledge, OSNs are derived from basal cells in Œ.

    Reply
    Posted by: Yoojin S.
    January 28, 2013 - 8:52 PM
  6. It's good to hear that you succeeded in culturing Œ-MSCs. For sure, you can differentiate these stem cells into neurons but I don't know if these neurons can express olfactory receptors. It's worth a test. Good luck.

    Reply
    Posted by: francois f.
    January 30, 2013 - 9:00 AM
  7. I have one more question. I have a hard time to make healthy spheres...you`ve mentioned that ' To generate stem cell spheres, incubate the flasks for two hours at 37°C with poly-L-lysine' . Could you tell me why we should use the PLL coating dish? In neural stem cell culture, I routinely use non-coating dish to make spheres ( because they will attached to PL coating dish and start to proliferate in attached single cell state).

    Reply
    Posted by: Yoojin S.
    March 28, 2013 - 8:42 PM
  8. The sphere formation process differs from neural stem cells. A single neural stem cell gives rise to a sphere. Instead,ŒMSCs, when plated at the right density on poly-l-lysine, aggregate and, within ²-7 days, form an islet of cells that will ultimately detach from the dish and float in the culture medium. To get spheres, you need to avoid proliferation (serum is eliminated from the culture medium) and use an FGF/EGF-containing culture medium.

    Reply
    Posted by: francois f.
    March 29, 2013 - 5:13 AM
  9. hello, in the last months I have tried to obtain a culture of stem cells from mouse ... but due to my limited experience with this type of tissue, I do not separate the epithelium from the lamina propria, so I decided to do passages... my question is how many passages are enough to have a homogeneous culture and healthy stem cells from mouse???

    Morphological differences exist between mouse or human culture to make passajes?

    Thanks ....

    Reply
    Posted by: IRERI F.
    June 4, 2013 - 2:40 PM
  10. Separating the lamina propria and the epithelium are not compulsory. At the start, you'll get a mixed population of cells but after one passage, epithelial cells will disappear rapidly.
    Overall, mouse cells do not proliferate as well as human cells. In order to keep your mouse stem cells growing, I recommend to keep a 50% level of confluency after passaging. If the cell density is too low, the proliferation rate will be minimal.
    Good luck with your experiments,
    Francois Feron

    Reply
    Posted by: francois f.
    June 5, 2013 - 4:28 AM
  11. Dear Dr. Ferón

    My name is Ireri Franco and I wrote to you before asking about the features of the isolation of Olfactory Stem Cells in mouse...these cells are nestin, sox2 and beta III tubulin inmunopositive, but I have some troubles with the differentiation because I can´t get MAP2 or NeuN inmunopositive cells (antibodies works well).

    Actually I ´m working with cells on passage 1 or 2 but I don´t make the sphere formation before the differentiation, it mean when the culture is confluent, I start with the differentiation protocol ( neurobasal, B271%, glutamine 2mM, glutamate 0.025mM and antibiotic- antimycotic) I change the medium every 3 days until tha 21 day.

    I really hope that you can help me because I don´t know if I´m doing something wrong.

    Thank you.

    PD. I hope that you can understand my poor english

    Reply
    Posted by: IRERI F.
    January 13, 2014 - 2:28 PM
  12. Dear François Féron,

    I have read your insightful protocol, and would like to replicate your procedure, possibly for younger rats. Is it possible to perform this isolation procedure on P0-P2 neonatal rats?

    Also, have you directed the differentiation of the olfactory stem cells into neurons that are bipolar and express markers characteristic of mature olfactory sensory neurons? Specifically, do some of the differentiated neurons express OMP? Have you been able to direct neuron differentiation towards the formation of olfactory sensory neurons?

    Thanks for sharing your expertise.

    ~Kind regards

    Reply
    Posted by: Angela D.
    September 27, 2018 - 9:26 AM

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