Robust Generation of hepatocytter-lignende celler fra humane embryonale Stem Cell pasientgrupper

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne artikkelen vil fokusere på den generasjonen av menneskelig nedsatt endoderm fra humane embryonale stamceller populasjoner.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations. J. Vis. Exp. (56), e2969, doi:10.3791/2969 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Til tross for fremgang i modellering human narkotika toksisitet, mange forbindelser mislykkes i kliniske studier på grunn av uforutsette bivirkninger. Kostnaden for kliniske studier er store, derfor er det viktig at mer prediktiv toksikologi skjermer er utviklet og distribuert tidlig i legemiddelutvikling (Greenhough et al 2010). Humane hepatocytter representerer dagens gullstandarden modell for evaluering av narkotika toksisitet, men er en begrenset ressurs som viser variabel funksjon. Derfor er bruk av foreviget cellelinjer og animalsk vev modeller rutinemessig ansatt på grunn av sin overflod. Mens begge kilder er informative, de er begrenset av dårlig funksjon, arter variabilitet og / eller ustabilitet i kultur (Dalgetty et al 2009). Pluripotent stamceller (PSCs) er et attraktivt alternativ kilde til menneskelig hepatocytter som celler (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs er i stand til selv fornyelse og differensiering for alle somatiske celletyper som finnes i den voksne og dermed representereren potensielt uuttømmelig kilde til differensierte celler. Vi har utviklet en prosedyre som er enkel, svært effektiv, mottagelig for automatisering og gir funksjonell human HLCs (Hay et al 2008; Fletcher et al 2008; Hannoun et al 2010; Payne et al 2011 og Hay et al 2011). Vi tror vår teknologi vil føre til skalerbar produksjon av HLCs for drug discovery, sykdom modellering, bygging av ekstra-corporeal enheter og muligens cellebaserte transplantasjon terapi.

Protocol

1. Initial utarbeidelse av alle kjemiske bestander og belegg av kultur plasticware

Alle trinn skal utføres i en vevskultur hette under aseptiske forhold.

  1. Utarbeidelse av menneskelig grunnleggende fibroblast vekstfaktor (hbFGF)
    1. Forbered 10% BSA løsning i PBS og filtrere gjennom en 0,22 mikrometer filter.
    2. Fra 10% BSA løsning forberede en 0,2% BSA løsning.
    3. Tilsett 10 ml 0,2% BSA solution/100 mikrogram hbFGF.
    4. Pre-vått en 0,22 mikrometer filter ved å filtrere 5 mL 10% BSA løsning gjennom filteret. Kast 10 mL BSA vask.
    5. Filtrer hbFGF gjennom pre-vasket filter.
    6. Delmengde av hbFGF i sterile eppendorfs og oppbevar ved -20 ° C.
  2. Utarbeidelse av Human Activin en stamløsning
    1. Tilsett 1 mL 0,2% BSA i en sprøyte og pre våt filteret.
    2. Fortynne Activin A i 0,2% BSA til et lager konsentrasjon på 100 mikrogram / ml.
    3. Filtrer aktivitetern En løsning og delmengde i sterile eppendorfs, lagre ved -20 ° C.
  3. Utarbeidelse av Mouse Wnt3a Stock Solution
    1. Tilsett 200 mL PBS til en 2 mikrogram hetteglass Wnt3a til et lager konsentrasjon på 10 mikrogram / ml.
    2. Delmengde i sterile eppendorfs og oppbevar ved -20 ° C.
  4. Utarbeidelse av Human HGF Stock Solution (1000x)
    1. Fortynne HGF i PBS til et lager konsentrasjon på 10 mikrogram / ml.
    2. Filtrere HGF løsningen og delmengde i sterile eppendorfs, lagre ved -20 ° C.
  5. Utarbeidelse av Oncostatin M Stock Solution (1000x)
    1. Fortynne OSM i PBS til et lager konsentrasjon på 20 mikrogram / ml.
    2. Filtrere OSM løsningen og delmengde i sterile eppendorfs, lagre ved -20 ° C.
  6. Coating av kultur plasticware med Matrigel
    1. Tin de 10 mL lager flaske Matrigel over natten ved 4 ° C på is og deretter legge til 10 mL av KO-DMEM. Bland godt med kjølt pipetter og lagre enmL alikvoter ved -20 ° C.
    2. Tine en delmengde av Matrigel ved 4 ° C i minst 2 timer eller over natten for å unngå dannelse av en gel.
    3. Tilsett 5 ml av kulde KO-DMEM til matrigel, bland godt med en pipette.
    4. Sminke til 15 mL med kaldt KO-DMEM og bland med en pipette.
    5. Legg matrigel til plate eller kolbe som skal males (tabell (i))
Plate / Flask Volum / Godt eller Flask
12-bra plate 0,5 ml per brønn
6-bra plate 1 ml per brønn
25cm 2 kolbe 2 mL per kolbe

Tabell 1. Anbefalte mengder matrigel for belegg typiske plasticware for hESC kultur.

    1. Inkuber belagt plate eller flaske over natten ved 4 ° C eller romtempature for 1 time før bruk.
    2. Plater eller kolber som har blitt belagt med matrigel kan lagres ved 4 ° C i opptil 1 uke. De bør være tydelig merket med datoen de ble belagt. Kast noen plater eller kolber ikke brukes innen en uke.
      1. Før bruk at coated kultur container for å komme opp til romtemperatur inne i en vev kultur hette.
      2. Umiddelbart før bruk Aspirer matrigel og legge til cellesuspensjon til brønnen eller kolbe.

2. Rutinemessig vedlikehold av hESC kulturer og karakterisering

  1. Gjenoppliving av hESC linjer
    1. Fjern hESCs fra flytende nitrogen lagring og raskt tine på 37 ° C vannbad.
    2. Overfør cellesuspensjon nøye til et sterilt rør som inneholder flere mL av varme medium.
    3. Pellet cellene ved sentrifugering @ lav hastighet i 5min (1000 RPM).
    4. Aspirer av supernatanten og veldig forsiktig resusPend cellene i varme ES medium og plate ut på en MEF mater lag.
    5. Refeed celler daglig med ferske ES medium og på subconfluence, cellene, krever cellene passaging.
  2. Rutinemessig hESC vedlikehold
    ES celler dyrkes i form av plater eller kolber belagt med matrigel. Cellene må undersøkes og matet daglig:
    1. Undersøk under mikroskop for forurensning, celle morfologi og Confluence.
    2. Aspirer brukt medium.
    3. Legg til en passende volum av fersk Mouse Embryonic fibroblast-condition Medium (MEF-CM) + human bFGF (endelig konsentrasjon 4 ng / ml) eller andre serum frie medier 6.
  3. Passaging celler med collagenase
    hESC linjer (H1, H9 og RCM-1) vil nå samløpet hver 5-7 dager etter passaging ved 01:03 split ratio. Tidlig passasje hESCs i nærvær av stroma vokse saktere og tiden på matrigel kan bli en viktig faktor. Menneskelig ESCs bør ikke stå lenger enn 14dager på samme matrigel grunn matrise nedbrytning og i dette tilfellet kan det være nødvendig å passasje cellene i 1:1 eller 1:2 Delingsforholdet hvis cellene er subconfluent.

    Enzyme Inkubasjon
    1. Alle trinn skal utføres i en vevskultur hette under aseptiske forhold.
    2. At det er en ny matrigel belagt parabol eller kolbe utarbeidet som per seksjon 1.6.
    3. Bestem ønsket Delingsforholdet for cellene. En rekke faktorer er involvert i å bestemme Delingsforholdet:
      1. Høy stroma med lavt antall kolonier: kan passaged tilbake til en mindre bra størrelse eller kan passaged 01:01 som vil bli kvitt noen stroma og dermed øke kolonien til stroma ratio, fremme hESC vekst.
      2. Høy stroma med store kolonier, avhengig av antall kolonier kan være passaged 01:01 eller 01:02 hvis det er nok store hESC kolonier.
      3. Typiske voksende hESCs med litt stroma eller ingen stroma og / eller noen differensiering kan være passaged 01:02 eller tre.
      4. Aspirer media fra brønnen eller kolbe.
      5. Vask igjen med 2 MLene PBS (-MgCl 2-CaCl 2).
      6. Legg til en passende mengde collagenase (200 U / ml fortynnes i KO-DMEM) og inkuberes ved 37 ° C i 2-5 min. Fra 2 minutter og utover undersøke regelmessig under mikroskopet (1 minutt intervaller). På det punktet differensierte cellene begynner å løfte av og koloniene begynner å løfte på kanten cellene er klar til å bli passaged.
    Skraping og Pooling den hESCs
      1. Aspirer collagenase.
      2. Vask igjen med 2 MLene PBS (-MgCl 2-CaCl 2).
      3. Legg til en passende mengde MEF-CM avhengig av split ratio, og bruke en celle skrape fysisk fjerne celler fra overflaten av godt eller flasken, så triturate gently ved pipettering opp og ned 2-3 ganger med en 10 mL pipette. Det er viktig at hESCs holdes i klumper av celler og er ikke brutt opp i enkeltceller.
    Replating den hESCs
      1. Replate den resulterende cellesuspensjonen på den nye matrigel belagt kolber eller brønner.
      2. Gjør volumet av MEF-CM opptil 4 ml for en brønn med en 6-godt plate.
      3. Når du plasserer cellene i kuvøse agitate vevet kultur container for å sikre så jevn som mulig en fordeling av kolonier som kolonier en tendens til å bosette seg i sentrum av vevet kultur plate / kolbe påvirker celle replating og differensiering.
  4. Rutinemessig karakterisering av hESC populasjoner av flowcytometri
    1. hESC bestandene er undersøkt via flowcytometri en gang i måneden for stamcelle markører slik som 3 oktober / 4, Tra 10-60 og SSEA-4.
    2. hESCbestandene er fjernet fra underlaget sitt som enkelt celle suspensjoner etter en 5 minutters behandling med trypsin / EDTA (Invitrogen).
    3. Resuspender enkeltceller på 1x10 6 celler / ml i PBS supplert med 0,1% BSA og 0,1% natriumazid.
    4. Inkuber celle forberedelser ved 4 ° C med riktig antistoffer i 40 minutter.
    5. Vask cellene to ganger med PBS supplert med 0,1% BSA og 0,1% natriumazid til å fjerne ubundet antistoff og resuspender til en endelig volum på 100 mL og analysere ved flowcytometri.
    6. Data for 30000-40000 "live" events er anskaffet for hver prøve ved hjelp av en FACS Caliber cytometer utstyrt med en 488-nm laser og analysert ved hjelp CellQuest programvare (Becton Dickinson, San Jose, CA). Unstained celler inngår som kontroller. Dead and apoptotiske celler sammen med vrakrester ble ekskludert fra analyse ved hjelp av en elektronisk lever gate på fremover splitte og side scatter parametere.

3. Differensiertasjon av hESCs til nedsatt endoderm

  1. Utarbeidelse av Media for differensiering av hESCs til nedsatt endoderm. All media forberedelse bør utføres i en vevskultur hette under aseptiske forhold.
    1. Utarbeidelse av RPMI: B27 priming medium for endoderm differensiering
      1. For RPMI-B27 medium, mix RPMI 1640 (500 ml) og B27 (50x, 10 ml)
      2. Swirl å blande komponenter.
      3. Legg til alle komponentene til et filter enhet og filter under vakuum, lagre ved 4 ° C.
    2. Utarbeidelse av SR-DMSO medium for hepatocytter differensiering
      1. For SR-DMSO medium, bland 80% KO-DMEM, 20% KO-SR, 0,5% L-glutamin, 1% ikke-essensielle aminosyrer, 0.1mm β-Mercaptoethanol og 1% DMSO.
      2. Filtrer løsningen under vacum, lagre ved 4 ° C og delmengde og oppbevar ved -20 ° C om nødvendig.
      3. Bruk 4 ml per brønn i en 6-bra plate, og 6 mL per T25 kolbe.
    3. Utarbeidelse av L15 modning medium for hepatocyte modning
      1. For L-15 medium, blande 500 mL Leibovitz L-15 medium, tryptose fosfat kjøttkraft (endelig konsentrasjon 8,3%), varme-inaktivert fosteret bovint serum (endelig konsentrasjon 8,3%), 10 mM hydrokortison 21-hemisuccinate, 1 mM Insulin (storfe bukspyttkjertelen ), 1% L-Glutamine, 0,2% askorbinsyre.
      2. Filtrer løsningen under vacum, lagre ved 4 ° C og delmengde og oppbevar ved -20 ° C om nødvendig.
    4. Utarbeidelse av endelig RPMI: B27 priming medium
      1. Tilsett den nødvendige mengde priming medium for eksperimentet (1 ml per brønn av en 6-brønn plate, og 2 mL per T25 kolbe).
      2. Legg Activin A til en endelig konsentrasjon på 100 ng / ml.
      3. Legg rekombinant Wnt3a til en endelig konsentrasjon på 50 ng / ml.
      4. Bland godt og media er nå klar til bruk.
      5. Denne endelige media bør gjøres opp ferske hver dag.
    5. Utarbeidelse av endelig L-15 modning medium
      1. Tilsett den nødvendigevolum av L-15 medium for eksperimentet (4 ml per brønn av en 6-brønn plate, og 6 mL per T25 kolbe).
      2. Legg HGF til en endelig konsentrasjon på 10 ng / ml.
      3. Legg OSM til en endelig konsentrasjon på 20 ng / ml.
      4. Bland godt og media er nå klar til bruk.
      5. Denne endelige media bør gjøres opp ferske hver dag.
  2. Grunning hESCs til definitive endoderm
    1. Kultur hESCs (H1, H9 og RCM-1) og forplanter på matrigel belagt plater med musen embryonale fibroblast MEF-CM supplert med bFGF.
    2. Initiere nedsatt differensiering når hESCs nå et confluency nivå på ca 30% -60% (avhengig av hESC linje) ved å erstatte MEF-CM med priming medium (RPMI 1640-B27 supplert med 100 ng / mL Activin A og 50 ng / ml Wnt3a.
    3. Cellene dyrkes i priming medium for 3 dager (endring av medium hver 24. time), og endelig priming medium med Activin A og Wnt3a består ferske hver dag.
    4. På dag åtte kultur cellene i modning og vedlikehold medium (L-15) supplert med 10 ng / ml hHGF og 20 ng / ml OSM for 9 dager (skiftende medium hver 48. time). Modning og vedlikehold medium med hHGF og OSM er gjort opp frisk hver dag.
    5. Cellene gradvis utstillingen morfologiske endringer fra en spiky / trekantet form til en karakteristisk lever morfologi viser et mangekantet utseende (Figur 2A).
    6. Skjematisk for Sykdommer-cellulær differensiering:

Fire. Karakterisering av hESC avledet nedsatt endoderm

  1. Farging
    1. Vask hESC avledet HLCs med PBS to ganger, 1 minutt hver vask.
    2. Fest HLCs med 4% PFA i 20 minutter ved romtemperatur, (cellens kan lagres i PBS ved 4 ° C og farget på et senere tidspunkt). Cellene kan også festes med iskald metanol for 10 minutter ved -20 ° C.
    3. Vask cellene to ganger med PBS, 5 minutter hver vask.
    4. Inkuber cellene i 2 minutter i romtemperatur med 100% etanol for nukleær farging (dette trinnet er ikke nødvendig hvis metanol fiksering brukes).
    5. Vask cellene to ganger med PBS, 5 minutter hver vask.
    6. Blokker cellene med PBS / T (0,1% Tween) / 10% BSA i 1 time ved romtemperatur.
    7. Fjern blokkering buffer og legg de respektive primære antistoffet fortynnet i PBS / T (0,1% Tween) / 1% BSA og inkuber i 2 timer i romtemperatur, eller over natten ved 4 ° C med omrøring.
    8. Vask cellene tre ganger med PBS / T (0,1% Tween) / 1% BSA ved romtemperatur, 5 minutter hver vask.
    9. Legg den aktuelle sekundære Alexa Fluor antistoff (1:400) fortynnet i PBS til cellene og inkuber ved romtemperatur i 1 time i mørket med agitasjon. Vask cellene tre ganger med PBS, 5 minutter hver vask.
    10. Mount hver brønn med MOWIOL 4-88 og DAPI (1:1000). Dekk godt med en cover slip, trykke på dekkglass forsiktig for å sikre at alle luftbobler fjernes og oppbevar ved 4 ° C i mørket.
  2. RNA isolering og utvinning
    1. Vask hESC avledet HLCs med PBS og aspirer.
    2. Tilsett 1 mL TRIZOL reagens og inkuber ved romtemperatur i 5 minutter.
    3. Skrap cellene og plasser i en 1,5 mL Eppendorf (lagre ved -80 ° C for senere bruk hvis nødvendig).
    4. Tilsett 0,5 ml kloroform til Eppendorf og bland ved å snu, sørg for at dette blir gjort i et avtrekksskap.
    5. Sentrifuger løsningen på 13000 RPM i 15 minutter ved 4 ° C.
    6. Samle vandige layer og plasser i en ren Eppendorf, sørge for at det ikke er noen forurensning fra grensesnittet.
    7. Tilsett 1 mL av isopropanol og bland ved å snu, la ved romtemperatur i 10 minutter til precipiTate RNA.
    8. Sentrifuger ved 13000 RPM i 10 minutter ved 4 ° C.
    9. Aspirer supernatanten og sørg for ikke å forstyrre RNA pellet. Vask med 0,5 ml 70% etanol og la ved romtemperatur i 5 minutter.
    10. Sentrifuger ved 8000 RPM i 5 minutter ved 4 ° C.
    11. Aspirer etanol og la tørke i romtemperatur i 5-10 minutter.
    12. Når alle etanol har fordampet, resuspender pelleten i 30 mL avionisert vann. Oppbevar RNA ved -80 ° C for senere bruk.
    13. Tallfeste RNA konsentrasjon ved hjelp av en nanodrop.
  3. Revers transkripsjon PCR
    1. Sett opp en reaksjon med tidligere isolert RNA (200 ng), tilfeldig heksamer, nukleotider (10mm) reverstranskriptase og de respektive buffer i et tynnvegget 0,5 ml Eppendorf.
    2. Sett opp en negativ RT, over reaksjonen uten revers transkriptase.
    3. Plasser rørene i en termo cycler, PCR maskin, og sette opp følgende program:
      1. 37 ° C - 5 minutter (en syklus)
      2. 42 ° C - 1 time (en syklus)
      3. 95 ° C - 5 minutter (en syklus)
    4. Oppbevar cDNA ved -20 ° C for senere bruk om nødvendig.
  4. TaqMan kvantitativ revers transkriptase polymerase chain reaction Harvest-cellene ved ulike tidspunkt gjennom differensiering protokollen. Pakk ut RNA og utføre revers transkripsjon qPCR ved hjelp av følgende primere og Assay on demand, (Applied Biosystems) protokoll:
    1. 4 oktober Hs03005111_g1
    2. Nanog Hs02387400_g1
    3. Albumin Hs00910225_m1
    4. Alfaføtoprotein Hs00173490_m1

For RNA isolering og ekstraksjon henvises det til avsnitt 3.3.2

  1. Revers transkripsjon og TaqMan qPCR
    1. Ta 1 mikrogram av RNA og revers transkribere til cDNA ved hjelp av Invitrogen er Hevet III revers transkripsjonkit, som per produsentens instruksjoner.
    2. 1 mL av cDNA som brukes i en 25 mL TaqMan reaksjon bestående av de aktuelle primere fra Applied Biosystems, 18S ribosomal kontroll primere og Invitrogen er 2x platinum qPCR supermix UDG med Rox og en passende mengde vann.
    3. Bland godt og legg 10 mL av hver prøve i to brønner av enten en 96 eller 384 godt qPCR plate.
    4. Når alle prøvene er lastet inn, pluss de aktuelle kontroller), forsegle plate og analysere på Applied Biosystems 7900HT TaqMan maskin.
    5. Resultatene er uttrykt som relative uttrykk over en kontroll prøve.
  1. Funksjonell analyse av hESC Avledet Nedsatt endoderm Cytokrom P450 Assays - http://www.promega.com/tbs/tb325/tb325.pdf
    1. Inkuber dag 17 hESC avledet han med de spesifikke substrat for 5 timer ved 37 ° C (n = 3). Bruk vev kultur media som ennegativ kontroll og Inkuber ved 37 ° C i 5 timer.
    2. Samle supernatants og gjennomføre analysen i henhold til produsentens anvisninger.
    3. Måle relative nivåer av basal aktivitet og normalisere til per mg protein som bestemmes av BCA Assay (http://www.piercenet.com/products/browse.cfm?fldID=02020101).

Merknader

  1. Alle volumer er basert på en 6-brønnen plate format. Juster volum tilsvarende for de nødvendige plate eller kolbe.
  2. All priming, differensiering og modning medium er filtrert under vakuum før bruk.
  3. Grunning, differensiering og modning medium er lagret ved 4 ° C for ikke lenger enn 2 uker. Vurdere hvor mye medium er nødvendig for forsøket og delmengde de resterende media og oppbevar ved -20 ° C for fremtidig bruk.
  4. Matrigel er gjort opp i henhold til produsentens anvisninger, 1 mL alikvoter kan oppbevares ved -20 ° C til bruk.
  5. Growth faktorer gang gjort opp og alikvoteres kan oppbevares ved -20 ° C og når tines kan lagres ved 4 ° C for ikke lenger enn 2 uker.
  6. Primær antistoff vanligvis brukes til å karakterisere hESC avledet HLCs er albumin (1:250, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

5. Representant Resultater:

Karakterisering av hESCs opprettholdes før nedsatt differensiering

For å karakterisere stamcelleforskningen status for H9 hESCs brukt i studien undersøkte vi en rekke parametere. Cellene utstilt hESC morfologi, liten, tett pakket celler som vokser i definerte kolonier (figur 1A) og uttrykte pluripotent stamcelleforskningen genmarkører, Oct-3 / 4 og Nanog (Figur 1B). Vi fant ikke signifikante forskjeller i uttrykket av disse genene i forhold til en H7 hESC linje positiv kontroll. I tillegg ble 90,1% av hESCs befolkningen positive for stamcelleforskningen markør SSEA-4 (figur 1C).

hanSC differensiering til nedsatt endoderm

Humane embryonale stamceller kan være effektivt differensieres til nedsatt endoderm in vitro (Hay et al 2008). På dag 9 av differensiering, var celler høstet og differensiering av hESC til HLCs ble vurdert. Som tidligere rapportert hESCs utstilt en rekke dyptgripende morfologiske endringer, og ved dag 9, viste tidlig hepatocytter morfologi utvikle en polygonal utseende (Figur 2A). Videre ble downregulation av okt-3 / 4 over 9 dagtid selvfølgelig observert (figur 2B). I kontrast, ble det lever utskrifter AFP og albumin oppregulert (Figur 2C) fra dag 7 og utover.

In vitro-modning av Nedsatt endoderm

Nedsatt endoderm ble modnet in vitro bruke de etablerte prosedyren (Hay et al 2008). På den siste dagen av differensiering kulturer var immunostained for human lever markører albumin, AFP og E-cadherin. Utbyttet av HLCs bruker våre Prosedyren er vanligvis 90% (Hay et al 2008; Hanoun et al 2010; Payne et al 2011). HLCs farget positivt for Albumin, Alpha-fetoprotein og E-cadherin (figur 3).

Figur 1
Figur 1. Karakterisering av hESCs brukt i denne studien. (A) Phase kontrast mikroskopi bilder representant hESC morfologi observert i kulturen på 4x og 10x forstørrelse. Bildene ble tatt med et Nikon TE3000 / U invertert mikroskop (B) hESCs cultured er Octamer (okt-3 / 4) positive og Nanog positive. H7 hESCs var bruk som en kontroll for pluripotency genuttrykk nivåer. Relativ uttrykk refererer til folder av induksjon sammenlignet med endogene genet kontroll, β-2-mikroglobulin. (C) FACS tomter show hESC overflate markør uttrykk nivåer, inkludert scene spesifikke embryonale antigener SSEA fire.

69/2969fig2.jpg "/>
Figur 2. (A) Phase kontrast mikroskopi representative bilder av hESC-avledet nedsatt endoderm morfologi i dag 9 av differensiering observert i kulturen, på x4 og x10 forstørrelse. (B) Karakterisering av endringer i genuttrykk. RNA ble ekstrahert og cDNA ble analysert av kvantitative polymerase chain reaction, viser progressive downregulation av udifferensiert celle genuttrykk (okt-3 / 4) og (C) oppregulering av hepatocytter genuttrykk (albumin og α-fetoprotein). Relativ uttrykk refererer til folder av induksjon sammenlignet med endogene genet kontroll, β-2-mikroglobulin på dag 0 av differensiering. P <0,05 betegnes * og P <0,001 betegnes *** målt av studenter t-test i forhold til hESCs på dag 0. Feilfelt representerer ett standardavvik.

Figur 3
Figur 3. Characterisation av hESC-avledet nedsatt endoderm
Immunocytochemistry viser uttrykk for hepatocytter markører, albumin, AFP og E-cadherin i hESC (H9) avledet nedsatt endoderm. Negative kontroller ble utført med tilsvarende immunoglobulin G (IgG) og representanter bildene vises.

Figur 4
Figur 4. HESC (H9) avledet HLCs utstillingen metabolsk aktivitet. På 17 Day, H9 differensiert å HLCs utstilt CYP3A metabolsk aktivitet (n = 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har utviklet et enkelt, homogen og svært reproduserbare in vitro modell for å generere skalerbar nivåer av menneskelige HLCs. Vår modell har blitt validert av en rekke eksterne samarbeidende laboratorier. Vi rutinemessig karakterisere stamceller hentet HLCs bruke vår i huset verktøykasse av utviklingsforstyrrelser markører og lever spesifikke funksjonelle assays (de fleste som er kommersielt tilgjengelig). Den kritiske stadier i prosessen vår er: vedlikehold av stamcelle pluripotency, evnen til direkte stilk cellen differensiering til definitive endoderm, spesifikasjon av homogene kulturer av nedsatt endoderm og evnen til å utlede modne nedsatt endoderm stille bredt spekter funksjon in vitro.

En begrensning til storskala utrulling av stamcelleforskningen avledet HLC teknologien har vært på kort sikt differensiert funksjon av modne nedsatt endoderm i kultur (~ 4 dager på matrigel). Som sådan har vi vist en polymerbibliotek for bio-aktiv og romanen cellulære støtter. Dette har ført til identifisering av en roman støtte som opprettholder nedsatt funksjon i minst 15 dager. Fremtiden retninger for denne teknologien er i utgangspunktet industriell anvendelse i drug discovery prosessen (Hay et al 2011). Mid term gevinster skjemaet er denne teknologien trolig bli humanisert ekstra kroppslige lever støtte enheter for å bygge bro eller behandling av pasienter med leversykdom. Langsiktig gevinst fra denne teknologien kunne i cellebaserte transplantasjon terapi for leversykdom, men de gjeldende dataene viser at denne strategien krever betydelig innsats før den kan trygt brukes i klinikken (Payne et al 2011).

I konklusjonen, er betydningen av vår in vitro teknologi evnen til å generere homogen og ubegrensede kulturer av high fidelity human HLCs for anvendt biologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgements

Dr Hay ble støttet av en RCUK Fellowship, var dr. West støttet av Kirurgisk avdeling, var Dr Medine støttet av et stipend fra BHF Core-fondet, var Mr. Baltasar Lucendo-Villarin støttet av et MRC PhD Studenship. Dr Zhou ble støttet av et stipend fra den kinesiske regjeringen.

Materials

Matrigel coating plates and flasks

  1. Matrigel (10 mL, BD Biosciences, UK); store at -20°C.
  2. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  3. Tissue culture plates (6 well, 12 well, Corning, UK)
  4. Tissue culture flask (25 cm2 vented, Corning, UK)

hESC Maintenance

  1. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA); store at -20°C.
  2. BSA solution (50 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
  3. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.

Passaging hESCs with collagenase

  1. Confluent well or flask of hESCs.
  2. Matrigel coated wells or flasks as appropriate.
  3. Phospate buffered saline (-MgCl2, -CaCl2) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
  4. Collagenase IV (1 g, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  5. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA).
  6. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA).

Differentiation of hESCs to hepatic endoderm

  1. RPMI 1640 (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  2. B27 Supplement (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
  3. Activin A (2 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
  4. Recombinant mouse Wnt3a (2 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
  5. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  6. KO-SR (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
  7. Non-essential amino acids (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  8. β-Mercapt–thanol (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  9. DMSO (Sigma Aldrich, UK); store at room temperature
  10. Leibovitz L-15 culture medium (500 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
  11. Tryptose phosphate broth (100 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
  12. F–tal bovine serum, heat inactivated (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
  13. Hydrocortisone 21-hemisuccinate (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
  14. Insulin (bovine pancreas) (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
  15. L-Glutamine (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
  16. Ascorbic acid (25 g, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
  17. Human HGF (10 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
  18. Recombinant Human Oncostatin M (OSM) (50 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
  19. Syringe driven filter unit 0.22 μm (Millipore, UK)

Characterisation of hESC derived Hepatic Endoderm

Immunostaining

  1. Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
  2. PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20 (Sigma-Aldrich, UK).
  3. Paraformaldehyde (PFA) (Sigma-Aldrich, UK) is made up in PBS, store -20°C.
  4. Glycerol (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
  5. Tris Base (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
  6. Ethanol
  7. Serum (AbD Serotech, UK), store at -20°C.
  8. Secondary Antibody, Alexa Fluorophores (Molecular Probes, Invitrogen, UK).
  9. MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, USA) is made up in Tris HCL and glycerol as per manufacturers instructions. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK) is added to the MOWIOL solution at a 1:1000 dilution.
Primary antibodies
Antigen* Type Supplier Dilution
ALB Mouse Monoclonal Sigma Aldrich 1/500
E-Cadherin Mouse Monoclonal Millipore 1/100
α-fetoprotein Mouse Monoclonal Sigma 1/500
SSEA-4 FITC Mouse Monoclonal Biolegend 1/100
IgG Mouse Monoclonal DAKO 1/500
Secondary antibodies
Anti-mouse FITC conjugate Goat Monoclonal Invitrogen 1/400

Table 2. The antibodies used for hESC derived hepatic endoderm immunostaining, the concentrations used, the species developed in and the companies they are purchased from.

Functional Analysis of Hepatic Endoderm and Normalisation (per mg protein)

Cytochrome P450 Assays

  1. p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kits and luminometer (Promega, USA).
  2. White flat bottom 96 well assay plate (BD Biosciences, UK).
  3. BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK).
  4. Transparent 96 well assay plate (IWAKI, UK)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Asgari, S., Pournasr, B., Salekdeh, G. H., Ghodsizadeh, A., Ott, M., Baharvand, H. Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology. J. Hepatol. 53, 738-751 (2010).
  2. Hay, D. C., Pernagallo, S., Diaz-Mochon, J. J., Medine, C. N., Greenhough, S., Hannoun, Z., Schrader, J., Black, J. R., Fletcher, J., Dalgetty, D. Unbiased Screening of Polymer Libraries to Define Novel Substrates for Functional Hepatocytes with Inducible Drug Metabolism. Stem Cell Research. 6, 92-101 (2011).
  3. Payne, C. M., Samuel, K., Pryde, A., King, J., Brownstein, D., Schrader, J., Medine, C. N., Forbes, S. J., Iredale, J. P., Newsome, P. N. Persistence of Functional Hepatocyte Like Cells in Immune Compromised Mice. Liver International. 31, 254-262 (2011).
  4. Greenhough, S., Medine, C., Hay, D. C. Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocyte Like Cells and their Potential in Toxicity Screening. Toxicology. 278, 250-255 (2010).
  5. Medine, C. N., Greenhough, S., Hay, D. C. The Role of Stem Cell Derived Hepatic Endoderm in Human Drug Discovery. Biochemical Society Transactions. 38, 1033-1036 (2010).
  6. Hannoun, Z., Fletcher, J., Greenhough, S., Medine, C. N., Samuel, K., Sharma, R., Pryde, A., Black, J. R., Ross, J. A., Wilmut, I., Iredale, J. P., Hay, D. C. The Comparison between Conditioned Media and Serum Free Media in Human Embryonic Stem Cell Culture and Differentiation. Cellular Reprogramming. 12, 133-140 (2010).
  7. Dalgetty, D. M., Medine, C., Iredale, J. P., Hay, D. C. Progress and Future Challenges in Stem Cell-Derived Liver Technologies. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, 241-248 (2009).
  8. Hay, D. C., Fletcher, J., Payne, C., Terrace, J. D., Gallagher, R. C. J., Snoeys, J., Black, J., Wojtacha, D., Samuel, K., Hannoun, Z., Pryde, A. Highly Efficient Differentiation of hESCs to Functional Hepatic Endoderm Requires ActivinA and Wnt3a Signalling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 12301-12306 (2008).
  9. Fletcher, J., Cui, W., Samuels, K., Black, J. R., Currie, I. S., Terrace, J. D., Payne, C., Filippi, C., Newsome, P., Forbes, S. J., Ross, J. A., Iredale, J. P., Hay, D. C. The Inhibitory Role of Stromal Cell Mesenchyme on Human Embryonic Stem Cell Hepatocyte Differentiation is Overcome by Wnt3a Treatment. Cloning and Stem Cells. 10, 331-340 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics