히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 환경 바이러스성 커뮤니티에서 단일 좌초 DNA, 더블 좌초된 DNA와 RNA의 분리

Immunology and Infection

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Summary

우리는 환경 바이러스성 사회에서 단일 좌초 DNA를 두 번 좌초 DNA와 RNA 분자를 분리하는 효율적인 방법을 설명합니다. 핵산은 인산 함유 버퍼의 농도 증가와 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 fractionated 있습니다. 이 방법은 환경 시료에서 바이러스 핵산 형식의 절연을 허용합니다.

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Fadrosh, D. W., Andrews-Pfannkoch, C., Williamson, S. J. Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography. J. Vis. Exp. (55), e3146, doi:10.3791/3146 (2011).

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Abstract

바이러스, 특히 bacteriophages은 (phages), 지구 1,2에서 가장 많은 생물 학적 실체입니다. 바이러스가 숙주 세포의 풍요로움과 다양성을 조절, 영양분의 순환에 기여, 세포 표현형를 호스팅 변경, 그리고 유전자 3의 측면 전송을 통해 숙주 세포와 바이러스 모두 지역 사회의 진화에 영향을 미칩니다. 많은 연구는 바이러스 및 자연 환경의 다양한 기능들이 잠재력의 압도적인 유전적 다양성을 강조했습니다.

Metagenomic 기술은 taxonomic의 다양성과 회원 단일 좌초된 DNA (ssDNA), 두 번 좌초 DNA (dsDNA)와 RNA의 genotypes 4-9를 포함하는 복잡한 바이러스 assemblages의 기능 잠재력을 연구하는 데 사용되었습니다. 환경 DNA 함유 바이러스를하거나 RNA 함유를 연구하는 데 사용되는 현재 도서관 건설 프로토콜 nontargeted 템플릿 10을 제거하기 위해 초기 nuclease 치료를 필요로합니다. 그러나, 바이러스 지역 사회와 바이러스의 다양성의 집단 유전자 보완의 포괄적인 이해 관계 게놈 구성의 모든 구성원에 대한 지식이 필요합니다. 핵산 subtypes을 정화의 분류는 지역 사회의 유전자 서명의 일부를 희생하지 않고도 바이러스 assemblages을 연구하는 효과적인 메커니즘을 제공합니다.

히드록 시아파 타이트, 인산 칼슘의 결정 형태는 1960 년대 11 일 이후, 핵산의 분리뿐만 아니라 단백질과 미생물에서 채용되었습니다. 긍정적 - 충전 칼슘 2 사이 충전 상호 작용을 이용하여 + 히드록 시아파 타이트와 핵산 subtypes의 부정 청구 인산염 백본의 이온은, 그것이 우선적으로 다른 독립적인 각각의 핵산 subtype을 elute 수 있습니다. 우리는 최근에 DNA 시퀀싱 12 준비 ssDNA, dsDNA와 RNA 함유 바이러스 독립적으로 분류 genomes이 전략을 고용. 여기, 우리는 히드록 시아파 타이트 chromotography를 사용하여 혼합 바이러스 assemblages에서 ssDNA, dsDNA와 RNA 바이러스 핵산의 분류 및 복구를위한 방법을 제시한다.

Protocol

1. 솔루션의 준비

히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 수행하기 전에, 인산 버퍼가 준비되어야하며 히드록 시아파 타이트가 제대로 수산화해야합니다.

  1. 1M 인산 솔루션, 산도 6.8가 : 1L 플라스크에 살균, DEPC - H 2 O. 처리 중 1L의 나트륨 인산염 일염기의의 119.98g 디졸브 무균, DEPC - H 2 O. 처리 중 1L의 나트륨 인산염 이염의 141.96g를 용해하여 1L 플라스크에 1M 인산 나트륨 이염 솔루션을 준비 1시 1분의 비율로 모노 및 디 - 솔루션을 결합합니다. 저어 플레이트와 자기 볶음 막대를 사용하여 혼합에 장소 술병. 수산화 나트륨 (산도를 증가) 또는 인산을 (산도를 감소)을 추가하여 6.8으로 산도를 조정합니다.
  2. 0.12M 인산염 버퍼 : 500ml 플라스크에 1M 인산 솔루션 10 % 나트륨 dodecyl 황산염 (SDS)의 산도 6.8, 2.5ml, 그리고 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 5ml 30ml의 결합. 225ml의 볼륨 살균, DEPC - 처리 H2O를 추가합니다. 6.8으로 산도를 조정합니다. 250ml에 무균, DEPC - 처리 H2O를 추가합니다. 압력솥.
  3. 0.18M 인산염 버퍼 : 500ml 플라스크에 1M 인산 솔루션 10 % 나트륨 dodecyl 황산염 (SDS)의 산도 6.8, 2.5ml, 그리고 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 5ml 45ml의 결합. 225ml의 볼륨 살균, DEPC - 처리된 H 2 O를 추가합니다. 6.8으로 산도를 조정합니다. 250ml에 무균, DEPC - 처리된 H 2 O를 추가합니다. 압력솥.
  4. 0.20M 인산염 버퍼 : 500ml 플라스크에 1M 인산 솔루션 10 % 나트륨 dodecyl 황산염 (SDS)의 산도 6.8, 2.5ml, 그리고 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 5ml에 50ml을 결합. 225ml의 볼륨 살균, DEPC - 처리된 H 2 O를 추가합니다. 6.8으로 산도를 조정합니다. 250ml에 무균, DEPC - 처리된 H 2 O를 추가합니다. 압력솥.
  5. 0.40 M 인산 버퍼 : 500ml 플라스크에 1M 인산 솔루션 10 % 나트륨 dodecyl 황산염 (SDS)의 산도 6.8, 2.5ml, 그리고 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 5ml 100ml의 결합. 225ml의 볼륨 살균, DEPC - 처리된 H 2 O를 추가합니다. 6.8으로 산도를 조정합니다. 250ml에 무균, DEPC - 처리된 H 2 O를 추가합니다. 압력솥.
  6. "1.00M 인산 버퍼는"(이 용액에 인산염의 실제 농도가 0.91 M입니다) : 500ml 플라스크에 10 % 나트륨 dodecyl 황산염 (SDS)의 1M 인산 솔루션, pH6.8, 2.5ml의 30ml 결합하고, 5ml의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 0.5M. 225ml의 볼륨 살균, DEPC - 처리 H2O를 추가합니다. 6.8으로 산도를 조정합니다. 250ml에 무균, DEPC - 처리된 H 2 O를 추가합니다. 압력솥.
  7. 히드록 시아파 타이트 수화 : 히드록 시아파 타이트의 1g 밖에 무게와 50ml 튜브에 추가할 수 있습니다. 히드록 시아파 타이트에 0.12M 인산염 버퍼 6ml를 추가하고 섞어 반전. 이전 60 온도를 가져다 사용하는 ° C와 철저히 섞는다. 4 장시간 보관 ° C.
  8. 사용하기 전에, 60 ° C. 모든 인산염 버퍼 및 수산화 히드록 시아파 타이트를 평형

2. 이코노 - 열 준비

  1. 꼭지를 닫습니다. 반복 반전 열의와 decanting로 deionized H 2 O와 열을 여러 번 씻어.
  2. 이코노 열에서 꼭지를 제거하고 소독하는 열을 압력솥.
  3. 교체 및 꼭지를 닫습니다. 이코노 열 살균와 코트 모든 유리 표면에 Sigmacote의 1ml을 추가합니다. 꼭지와 가만히 따르다를 엽니다.
  4. 순환 물 목욕으로 컬럼을 첨부하고 60 온도를 설정할 ° C. 이러한 알루미늄 호일이나 발포 파이프 단열재로 단열 대리인의 컬럼을 포장 열 전체 열 손실의 최소 금액을 einsure하기 위해하는 것은 권장합니다.
  5. 무균, RNase - 무료 0.12M 인산염 버퍼로 두 번 누른 다음 멸균, RNase 무료 H 2 O와 두 번 이코노 - 컬럼을 씻어.

3. Hydroxypaptite의 Chromotography

  1. 확실히 만드는 것은 꼭지가 닫혀 천천히 살균 2ml serological 피펫을 사용하여 이코노 - 칼럼의 맨 아래에 미리 준비 resuspended 히드록 시아파 타이트의 2ml 추가합니다.
  2. 히드록 시아파 타이트가 30 분 동안 중력에 따라 해결하도록 허용합니다.
  3. 열에 가까이 꼭지에서 버퍼를 드레인. 60 ° 열 블록이나 물을 욕조에 10 분 C. 500 μl와 부화의 최종 볼륨 0.12M 인산염 버퍼와 핵산을 결합
  4. 신속하게 열을 방해하지 않도록하는 2ml serological 피펫을 사용하여 히드록 시아파 타이트에 0.12M 인산염 버퍼 준비 핵산을 적용합니다.
  5. 핵산 30 분 동안 히드록 시아파 타이트에 바인딩을 허용합니다.
  6. 열 아래 15ml 튜브를 삽입, 꼭지를 열고 ssDNA를 포함하는 초기 샘플을 수집합니다. 꼭지를 닫습니다.
  7. , 컬럼 방해 꼭지를 열고 이전 단계에서 15ml 튜브 단일 좌초된 DNA를 수집하지 않도록하는 히드록 시아파 타이트에 0.12M 인산염 버퍼 6ml를 추가합니다. 꼭지를 닫습니다.
  8. 클로로포름 : 페놀 1 볼륨을 추가 isoamyl 알코올 (25:25:1 V / V / V) 튜브에 솔루션을 적극적으로 섞어 15 분 3,500 XG에 원심 분리기. 새로운 15ml 튜브에 뜨는 포함 ssDNA를 전송합니다.
  9. 전자에 0.20M 인산염 버퍼 6ml를 사용하여 3.76와 3.87를 반복칼럼에서 류트와 정화 RNA는 컬렉션에 대한 새 15ml 튜브를 사용해야하고.
  10. 컬렉션에 대한 새 15ml 튜브를 사용해야하는 컬럼의 dsDNA를 elute 및 정화 0.40M 인산염 버퍼 6ml를 사용하여 3.76와 3.87를 반복합니다.
  11. 컬렉션에 대한 새 15ml 튜브를 사용해야하고 잔여 dsDNA의 열을 제거하기 위해서 1.00M 인산염 버퍼 6ml를 사용하여 3.76와 3.87를 반복합니다.

4. 핵산 샘플을 탈염

  1. 샘플의 양도 4 - 5ml Amicon 울트라 - 4 Ultracel 막 잘라 30,000 분자량과 함께 장착된 필터 원심 장치.
  2. 6000 XG, 30 회전에 의해 <500μl에 샘플을 집중 ° C, 고정 앵글 로터 5 분 (또는 농축 볼륨을 얻을 때까지). 을 통해 흐름을 폐기하십시오.
  3. Amicon 울트라 - 4 원심 필터 장치 샘플 (들)의 나머지 부분을 추가하고 Rnase 무료 1X TE 버퍼와 함께 4 - 5ml에 볼륨을 가져.
  4. 6000 XG, 30 회전에 의해 <500μl에 샘플을 집중 ° C, 고정 앵글 로터 5 분 (또는 농축 볼륨을 얻을 때까지). 을 통해 흐름을 폐기하십시오.
  5. Amicon 울트라 - 4 원심 필터 장치에 Rnase 무료 1X TE 버퍼 4 - 5ml를 추가합니다. 6000 XG, 30 centrifuging에 의해 <500μl에 샘플을 집중 ° C, 고정 앵글 로터 5 분 (또는 농축 볼륨을 얻을 때까지). 을 통해 흐름을 폐기하십시오.
  6. 완전히 핵산 샘플 (들) 탈염하다 단계 4.5에게 추가 5 회 반복합니다.
  7. 멸균 1.7ml eppendorf 튜브에 남은 샘플 (들)을 전송합니다. 1/10th 볼륨 3M의 아세트산 나트륨, 산도 7.0, 100 % 에탄올 두 권, 그리고 Glycoblue의 1μl를 추가합니다. vortexing하여 잘 섞는다.
  8. 28,000 XG, 4 ° C, 60 분 원심 분리기. 가만히 따르다는 펠렛을 방해하지 않도록하고. 70 % 에탄올의 300μl를 추가합니다. 10 분 28,000 XG, 상온에서 스핀. , 가만히 따르다 건조하고 Rnase없는 TE 버퍼의 적절한 볼륨의 각 부분을 resuspend.

5. 대표 결과 :

그림 1은 혼합 바이러스 조립에서 분류 ssDNA, dsDNA와 RNA 핵산에 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하는 제시 방법을 요약한 것입니다. 이 방법은 핵산의 부정 청구 인산염 백본과 긍정적인 요금 칼슘이 사이의 요금 상호 작용을 악용 + 이온은 히드록 시아파 타이트에있는 증가 인산염 버퍼 농도와 핵산 subtypes의 효율적인 분류 (ssDNA, dsDNA와 RNA)를 허용 12.

알려진 ssDNA (M13mp18), dsDNA (람다)와 RNA의 체외 "커뮤니티"에의 히드록 시아파 타이트 분류는 (MS2 및 phi6) 바이러스 genomes은 그림 2에서 보여주고있다. 핵산은 동일한 농도에서 결합 히드록 시아파 타이트 컬럼에 적용 인산염 버퍼의 증가 농도를 사용 eluted 하였다. 각 핵산 subtype 미만 9%는 다음 한 분수에서 - 이월와 다른 독립 elutes.

체사피크 베이에서 수집한 바이러스 공동체로부터 격리 핵산이 기술의 응용 프로그램은 그림 3에 표시됩니다. 정화 바이러스로부터 격리 총 핵산 수율이 히드록 시아파 타이트 컬럼에 적용되었다. ssDNA, RNA 및 dsDNA 구성된 게놈 자료는 독립적으로 각각 0.12M, 0.20M 및 인산 버퍼의 0.40M/1.00M 농도와 eluted했다. 두 번 좌초 DNA가 0.40M 및 1.00M의 인산 농도에 eluted이 경우, ssDNA와 RNA genotypes에 비해이 바이러스 공동체를 지배합니다. 이 관찰 복구할 핵산의 대부분 dsDNA 13아르 예상 바이러스 해양의 지역 사회 조성과 estuarine 환경과 일치합니다.

그림 1
핵산의 분류에 대한 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피 방법을 그림 1. 흐름 다이어그램. 0.12M 인산염 버퍼 준비 ssDNA, dsDNA와 RNA의 혼합물은 60 ° C로 가열하여 일정한 60 유지 히드록 시아파 타이트 컬럼에 적용되는 ° C 순환 물 목욕을 사용합니다. 핵산 (ssDNA, RNA 및 dsDNA)은 인산염 함유 버퍼의 농도 증가와 히드록 시아파 타이트에서 eluted 있습니다. 이 수치는 미생물학의 미국 사회의 허가를 재현되었으며 원래 앤드류스 - Pfannkoch 외에 실렸었습니다. 2010 12.

그림 2
그림 2. 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 알려진 바이러스 핵산의 분리. M13mp18 ssDNA, ssRNA MS2, phi6 dsRNA 및 람다 dsDNA (각각 2-5 차선)의 동일한 농도는 결합 (레인 6)와 히드록 시아파 타이트 컬럼에 적용되었습니다. SinglE - 좌초된 DNA (M13mp18), RNA (MS2/phi6)와 dsDNA (람다)가 독립적으로 0.12M (레인 8), 0.18M (레인 9)와 0.40M/1.00M (레인 10)를 사용하여 히드록 시아파 타이트 칼럼에서 eluted되었습니다 . 1킬로바이트 사다리 (레인 1, 7) 게놈 크기를 확인하는 데 사용되었다. 이 수치는 미생물학의 미국 사회의 허가를 재현되었으며 원래 앤드류스 - Pfannkoch 외에 실렸었습니다. 2010 12.

그림 3
그림 3. 체사피크 베이 내에서 지역 사회에서 격리 바이러스 핵산의 분리. 핵산은 고립과 히드록 시아파 타이트 컬럼에 적용되었습니다. ssDNA (레인 0.12M), RNA (레인 0.20M)와 dsDNA는 (차선 0.40M/1.0M) 독립적으로 각각 0.12M, 0.20M 및 0.40M/1.00M의 인산염 버퍼 농도를 사용하여 eluted되었습니다. 안녕 질량 DNA 사다리 (레인 L1)와 1킬로바이트 사다리 (레인 L2)는 시각 핵산의 대략적인 분자량 및 질량을 확인하는 데 사용되었습니다. 이 수치는 미생물학의 미국 사회의 허가를 재현되었으며 원래 앤드류스 - Pfannkoch 외에 실렸었습니다. 2010 12.

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Discussion

여기에 제시 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피 방법론 목표가 지역 사회의 핵산 성분을 연구하는 혼합 바이러스 assemblages에서 핵산의 분별 (분리)를위한 고효율하고 강력한 도구입니다. 일반적으로, ssDNA, RNA 및 dsDNA은 약 ~ 0and 0.40M 각각보다 큰 열을 검사하고 사진을 인산염 버퍼 농도에서 elute 것입니다. 그것이 알려진 핵산을 (재배 바이러스 준비의 예)를 사용하여 각각의 준비를 테스트하는 것이 중요하므로 단, 히드록 시아파 타이트의 각 준비는 약간 다른 구성과 용출 프로필을 가질 수 있습니다. 이것은 사용자가 원하는 핵산을 elute에 필요한 인산염 함유 버퍼의 특정 농도를 확인할 수 있습니다.

이 기법의 제한 요소를 사용할 수 칼슘 2의 수량 핵산의 인산 백본을 바인딩할 수 히드록 시아파 타이트에있는 + 이온입니다. 열에있는 히드록 시아파 타이트의 capacityamount은 열 또는 아래로 크기를 조정 할 수 있습니다 (물 외피 열 및 사용 히드록 시아파 타이트의 금액의 크기에 의해 결정) 및 용출에 사용되는 버퍼의 크기가 매우 작고 수용 또는 아래로 확장할 수 있습니다 또는 매우 큰 입력 핵산의 대량하지만은 궁극적으로 물을 외피 칼럼의 크기에 의해 제한됩니다.

또한, 핵산, 히드록 시아파 타이트, 그리고 인산 함유 버퍼가 혼합 튜브에 결합, 낮은 속도로 centrifuged하는 배치 기술은 타겟 핵산을 분리의 대안 방법입니다. 이 전략은 어떤​​ 경우에 도움이 될하지만,보다 정확하고 핵산의 더 나은 분류를 제공하는 색층 방법처럼 신뢰할 수 없습니다 있습니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이 연구는 과학 사무소 (BER), 에너지의 미국학과, 아니 계약의 협동에 의해 지원되었다. 드 FC02 - 02ER63453, 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 미생물 게놈 시퀀싱 프로그램 (보너스 번호 0,626,826 및 0,731,916). 우리는 환경 샘플 컬렉션과 함께 자신의 지원에 대한 그의 기술적 전문성과 조언과 K. 에릭 Wommack에 대한 존 유리 주셔서 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Econo-Column Bio-Rad 737-0717 0.7cm ID package/2
Hydroxyapatite Bio-Rad 130-0520 DNA Grade Bio-Gel HTP Gel, 100g/td>
Sodium Phosphate, Monobasic VWR international VW1497-01 Monohydrate, Crystal 500g
Sodium Phosphate, Dibasic VWR international VW1496-01 Anhydrous, Powder 500g
DEPC-treated Water Invitrogen AM9922 1L
10% SDS Solution Invitrogen 24730-020 UltraPure, 1L
0.5M EDTA Invitrogen AM9262 pH 8.0, 1L
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2-25ML
2ml serological pippette VWR international 89130-884 Polystyrene, Sterile
BD Falcon Centrifuge Tubes VWR international 21008-936 15ml, Sterile
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1 v/v/v) Invitrogen 15593-031 UltraPure, 100ml
Amicon Ultra-4 Centrifugal Device EMD Millipore UFC803024 Ultracel-30 membrane
20X TE Buffer, Rnase free Invitrogen T11493 100ml
Glycoblue Invitrogen AM9516 15mg/ml

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References

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