Separazione di DNA a singolo filamento, doppia elica del DNA e RNA da una Comunità Ambientale virale usando la cromatografia idrossiapatite

Immunology and Infection

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Summary

Descriviamo un metodo efficace per separare singolo filamento di DNA a doppio filamento di DNA e le molecole di RNA virale ambientale comunità. Gli acidi nucleici sono frazionate mediante cromatografia di idrossiapatite con concentrazioni crescenti di fosfati contenenti buffer. Questo metodo consente l'isolamento di tutti i tipi virali acidi nucleici da campioni ambientali.

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Fadrosh, D. W., Andrews-Pfannkoch, C., Williamson, S. J. Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography. J. Vis. Exp. (55), e3146, doi:10.3791/3146 (2011).

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Abstract

I virus, in particolare batteriofagi (fagi), sono le entità più numerosi biologica sulla Terra 1,2. I virus modulare cellula ospite abbondanza e la diversità, contribuiscono alla cicli dei nutrienti, alterare ospitare fenotipo delle cellule, e influenza l'evoluzione di entrambi cellula ospite e le comunità virale attraverso il trasferimento laterale dei geni 3. Numerosi studi hanno messo in evidenza la diversità sconcertante genetica dei virus e delle loro potenzialità funzionali in una varietà di ambienti naturali.

Tecniche di metagenomica sono state utilizzate per studiare la diversità tassonomica e le potenzialità funzionali di complessi assemblaggi virale i cui componenti contengono DNA a singolo filamento (ssDNA), DNA a doppia elica (dsDNA) e RNA genotipi 4-9. Attuali protocolli di costruzione della libreria usata per studiare l'ambiente del DNA-RNA contenenti o contenenti virus richiedono un trattamento iniziale nucleasi al fine di rimuovere i modelli nontargeted 10. Tuttavia, una comprensione globale del complemento gene collettiva della comunità virus e la diversità del virus richiede la conoscenza di tutti i membri indipendentemente dalla composizione del genoma. Frazionamento di acido nucleico purificato sottotipi fornisce un meccanismo efficace per lo studio assemblaggi virale senza sacrificare un sottoinsieme della firma genetica della comunità.

Idrossiapatite, una forma cristallina di fosfato di calcio, è stato impiegato nella separazione degli acidi nucleici, così come le proteine ​​e microbi, dal 1960 11. Sfruttando l'interazione tra la carica a carica positiva Ca 2 + ioni di idrossiapatite e la spina dorsale fosfato con carica negativa dei sottotipi acidi nucleici, è possibile eluire preferenzialmente ogni sottotipo di acido nucleico indipendente dagli altri. Recentemente abbiamo utilizzato questa strategia per frazionare in maniera indipendente i genomi di ssDNA, dsDNA e RNA contenenti virus, in preparazione di sequenziamento del DNA 12. Qui, vi presentiamo un metodo per il frazionamento ed il recupero di ssDNA, dsDNA e RNA virale acidi nucleici da assemblaggi misti virale mediante cromatografia in idrossiapatite.

Protocol

1. Preparazione di soluzioni

Prima di eseguire la cromatografia idrossiapatite, tamponi fosfato deve essere preparato e l'idrossiapatite devono essere adeguatamente idratati.

  1. Soluzione fosfato 1M, pH 6,8: In un pallone da 1 litro sciogliere 119.98g di fosfato monobasico di sodio in 1 litro di sterile, DEPC trattati con H 2 O. Preparare una soluzione 1M fosfato di sodio bibasico in un pallone da 1 litro, sciogliendo 141.96g di fosfato bibasico di sodio in 1 litro di sterile, DEPC trattati con H 2 O. Combinano la mono-e di soluzioni con un rapporto di 1:1. Pallone posto su un piatto mescolare e miscelare con una barra magnetica mescolare. Regolare il pH a 6,8 con l'aggiunta di idrossido di sodio (per aumentare il pH) o acido fosforico (per diminuire il pH).
  2. Tampone fosfato 0.12M: in un pallone da 500 ml, unire 30 ml di soluzione 1M fosfato, pH 6,8, 2,5 ml di 10% di sodio dodecil solfato (SDS), e 5 ml di EDTA 0.5M. Aggiungi sterile, DEPC trattati con H2O ad un volume di 225ml. Regolare il pH a 6,8. Aggiungi sterile, DEPC trattati con H2O a 250ml. Autoclave.
  3. Tampone fosfato 0.18M: in un pallone da 500 ml, unire 45ml di soluzione 1M fosfato, pH 6,8, 2,5 ml di 10% di sodio dodecil solfato (SDS), e 5 ml di EDTA 0.5M. Aggiungi sterile, DEPC trattati con H 2 O ad un volume di 225ml. Regolare il pH a 6,8. Aggiungi sterile, DEPC trattati con H 2 O a 250 ml. Autoclave.
  4. Tampone fosfato 0.20m: in un pallone da 500 ml, unire 50 ml di soluzione 1M fosfato, pH 6,8, 2,5 ml di 10% di sodio dodecil solfato (SDS), e 5 ml di EDTA 0.5M. Aggiungi sterile, DEPC trattati con H 2 O ad un volume di 225ml. Regolare il pH a 6,8. Aggiungi sterile, DEPC trattati con H 2 O a 250 ml. Autoclave.
  5. Tampone fosfato 0,40 M: in un pallone da 500 ml, 100 ml di soluzione di combinare fosfato 1M, pH 6,8, 2,5 ml di 10% di sodio dodecil solfato (SDS), e 5 ml di EDTA 0.5M. Aggiungi sterile, DEPC trattati con H 2 O ad un volume di 225ml. Regolare il pH a 6,8. Aggiungi sterile, DEPC trattati con H 2 O a 250 ml. Autoclave.
  6. "1.00m fosfato buffer" (effettiva concentrazione di fosfato in questa soluzione è 0,91 M): in un pallone da 500 ml, unire 30 ml di soluzione di fosfato 1M, pH6.8, 2,5 ml di 10% di sodio dodecil solfato (SDS), e 5 ml di 0.5M EDTA. Aggiungi sterile, DEPC trattati con H2O ad un volume di 225ml. Regolare il pH a 6,8. Aggiungi sterile, DEPC trattati con H 2 O a 250 ml. Autoclave.
  7. Idratazione idrossiapatite: Peso da 1g di idrossiapatite e aggiungere in una provetta da 50 ml. Aggiungere 6 ml di tampone fosfato 0.12M al idrossiapatite e miscelare. Prima dell'uso portare la temperatura a 60 ° C e mescolare accuratamente. Conservare per lunghi periodi di tempo a 4 ° C.
  8. Prima dell'uso, equilibrare tutti i tamponi fosfato e idrossiapatite idratata a 60 ° C.

2. Preparazione di Econo-Colonna

  1. Chiudere rubinetto. Sciacquare colonna parecchie volte con acqua deionizzata H 2 O invertendo ripetutamente la colonna e decantazione.
  2. Rimuovere il rubinetto dal Econo-colonna e la colonna autoclave per la sterilizzazione.
  3. Sostituire il rubinetto e chiudi. Aggiungere 1ml di Sigmacote alla sterile Econo-colonna e cappotto tutte le superfici in vetro. Aprire il rubinetto e decantare.
  4. Allegare colonna a un bagno d'acqua circolante e impostare la temperatura a 60 ° C. Per einsure la minor quantità di perdita di calore attraverso la colonna avvolgendo la colonna in un agente isolanti come un foglio di alluminio o tubo di schiuma isolante è raccomandato.
  5. Sciacquare la Econo-colonna due volte con sterili, RNasi-free H 2 O poi due volte con sterili, RNasi-free tampone fosfato 0.12M.

3. Hydroxypaptite cromatografia

  1. Assicurandosi che il rubinetto è chiuso, aggiungere lentamente 2 ml di pre-preparati, idrossiapatite risospese alla parte inferiore del Econo-colonna con una pipetta sterile 2ml sierologici.
  2. Lasciare che il idrossiapatite di stabilirsi sotto la forza di gravità per 30 minuti.
  3. Scolare buffer da colonna e rubinetto vicino. Combina acidi nucleici con tampone fosfato 0.12M in un volume finale di 500 microlitri e incubare a 60 ° C per 10 minuti in un blocco di calore o bagnomaria.
  4. Applicare rapidamente gli acidi nucleici, preparato in tampone fosfato 0.12M alla idrossiapatite con una pipetta sierologica 2ml facendo attenzione a non disturbare la colonna.
  5. Lasciare gli acidi nucleici di legarsi alla idrossiapatite per 30 minuti.
  6. Posizionare un tubo 15ml sotto la colonna, aprire il rubinetto e raccogliere il campione iniziale, contenente ssDNA. Chiudere rubinetto.
  7. Aggiungere 6 ml di tampone fosfato 0.12M alla idrossiapatite facendo attenzione a non disturbare la colonna, aprire il rubinetto e raccogliere DNA a singolo filamento nel tubo 15ml dal passaggio precedente. Chiudere rubinetto.
  8. Aggiungere 1 volume di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25:25:1 v / v / v) al tubo, mescolare vigorosamente e centrifugare a 3500 xg per 15 minuti. Trasferire il supernatante contenente ssDNA di un nuovo tubo 15ml.
  9. Ripetere 3,76 e 3,87 con 6 ml di tampone fosfato 0.20m per postaliuto e RNA purificare dalla colonna facendo attenzione a utilizzare un nuovo tubo 15ml per la raccolta.
  10. Ripetere 3,76 e 3,87 con 6 ml di tampone fosfato 0.40m per eluire e purificare dsDNA dalla colonna facendo attenzione a utilizzare un nuovo tubo 15ml per la raccolta.
  11. Ripetere 3,76 e 3,87 con 6 ml di tampone fosfato 1,00 m di togliere la colonna di qualsiasi residuo dsDNA assicurandosi di utilizzare un nuovo tubo 15ml per la raccolta.

4. Dissalazione campioni acidi nucleici

  1. Trasferimento 4-5 ml di campione ad un Amicon Ultra-4 dispositivo centrifugo filtro dotato di un peso molecolare 30.000 tagliato membrana Ultracel.
  2. Concentrato campione <500μl di filatura a 6.000 xg, 30 ° C, 5 minuti (o fino a quando il volume concentrato si ottiene) in un rotore ad angolo fisso. Gettare flusso attraverso.
  3. Aggiungere il resto del campione (s) per l'Ultra-4 Amicon dispositivo centrifugo filtro e portare il volume fino a 4 da 5 ml con tampone TE 1X RNase libero.
  4. Concentrato campione <500μl di filatura a 6.000 xg, 30 ° C, 5 minuti (o fino a quando il volume concentrato si ottiene) in un rotore ad angolo fisso. Gettare flusso attraverso.
  5. Aggiungere 4-5 ml di tampone TE 1X RNase libera al sistema Ultra-4 Amicon dispositivo centrifugo filtro. Concentrato campione <500μl per centrifugazione a 6.000 xg, 30 ° C, 5 minuti (o fino a quando il volume concentrato si ottiene) in un rotore ad angolo fisso. Gettare flusso attraverso.
  6. Ripetere il passo 4,5 un ulteriore 5 volte per desalt completamente campione di acido nucleico (s).
  7. Trasferimento del campione rimanente (s) ad un tubo sterile 1.7ml eppendorf. Aggiungi 1/10th volume di acetato di sodio 3M, pH 7,0, due volumi di etanolo 100%, e 1ml di Glycoblue. Mescolare bene nel vortex.
  8. Centrifugare a 28000 xg, a 4 ° C, 60 minuti. Decantare facendo attenzione a non disturbare il pellet. Aggiungere 300μl di etanolo 70%. Spin a 28.000 xg, temperatura ambiente per 10 minuti. Decantare, asciutto e risospendere ogni frazione in un volume adeguato di RNasi-free tampone TE.

5. Rappresentante dei risultati:

La Figura 1 riassume i metodi presentati per l'utilizzo di cromatografia idrossiapatite di frazionare ssDNA, dsDNA e gli acidi nucleici RNA da un assemblaggio misto virale. Questo metodo sfrutta l'interazione di carica tra la dorsale fosfato con carica negativa degli acidi nucleici e la carica positiva di Ca 2 + ioni presenti nella idrossiapatite e consente il frazionamento efficiente dei sottotipi acido nucleico (ssDNA, dsDNA e RNA), con concentrazioni crescenti di buffer fosfato 12.

Il frazionamento di un idrossiapatite in vitro "comunità" di noti ssDNA (M13mp18), dsDNA (lambda) e RNA (MS2 e phi6) genomi virali è illustrato in Figura 2. Gli acidi nucleici sono stati combinati in concentrazione pari, applicata alla colonna di idrossiapatite e sono stati eluiti con una crescente concentrazione del tampone fosfato. Ogni sottotipo acido nucleico eluisce indipendente dalle altre, con meno del 9% riporto da una frazione all'altra.

L'applicazione di questa tecnica per gli acidi nucleici isolato da una comunità virale raccolti dalla Baia di Chesapeake è mostrata in Figura 3. La resa totale di acidi nucleici isolato dal virus purificato è stato applicato alla colonna di idrossiapatite. Materiale genomico composto da ssDNA, RNA e DNA a doppia elica era indipendentemente eluiti con 0.12M, 0.20m 0.40M/1.00M e le concentrazioni di tampone fosfato, rispettivamente. DNA a doppia elica viene eluita a concentrazioni di fosfato e di 1,00 m e 0,40 m in questo caso, domina questa comunità virale rispetto ai genotipi ssDNA e RNA. Questa osservazione è coerente con la composizione prevista comunità virale di ambienti marini e di estuario, dove la maggior parte degli acidi nucleici sono recuperabili dsDNA 13.

Figura 1
Figura 1. Diagramma di flusso del metodo di cromatografia idrossiapatite per il frazionamento degli acidi nucleici. Una miscela di ssDNA, dsDNA e RNA, preparato in tampone fosfato 0.12M viene riscaldato a 60 ° C e applicata a una colonna di idrossiapatite mantenuto alla temperatura costante di 60 ° C con un bagno di acqua circolante. Acidi nucleici (ssDNA, RNA e dsDNA) sono eluiti dalla idrossiapatite con concentrazioni crescenti di un fosfato, contenente tampone. Questo dato è stato riprodotto con il permesso di Società Americana di Microbiologia ed è stato originariamente nel Andrews-Pfannkoch et al. 2010 12.

Figura 2
Figura 2. Separazione delle note acidi nucleici virali mediante cromatografia idrossiapatite. Concentrazioni pari di M13mp18 ssDNA, MS2 ssRNA, phi6 dsRNA e lambda dsDNA (corsie 2-5, rispettivamente) sono stati combinati (corsia 6) e applicata a una colonna di idrossiapatite. Single-DNA (M13mp18), RNA (MS2/phi6) e dsDNA (lambda) erano indipendentemente eluito idrossiapatite con 0.12M (corsia 8), 0.18M (corsia 9) e 0.40M/1.00M (corsia 10) . Una scala 1kb (corsie 1, 7) è stato usato per confermare le dimensioni del genoma. Questo dato è stato riprodotto con il permesso di Società Americana di Microbiologia ed è stato originariamente nel Andrews-Pfannkoch et al. 2010 12.

Figura 3
Figura 3. Separazione di acidi nucleici virale isolato da una comunità all'interno della Baia di Chesapeake. Gli acidi nucleici sono stati isolati e applicato a una colonna di idrossiapatite. ssDNA (corsia 0.12M), RNA (corsia 0.20m) e dsDNA (corsie 0.40M/1.0M) erano indipendentemente eluiti utilizzando le concentrazioni di tampone fosfato di 0.12M, 0.20m e 0.40M/1.00M, rispettivamente. Ladder Messa hi DNA (corsia L1) e Ladder 1kb (corsia L2) sono stati utilizzati per confermare visivamente approssimativo peso molecolare e la massa degli acidi nucleici. Questo dato è stato riprodotto con il permesso di Società Americana di Microbiologia ed è stato originariamente nel Andrews-Pfannkoch et al. 2010 12.

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Discussion

La metodologia cromatografia idrossiapatite qui presentato è uno strumento altamente efficiente e robusto per il frazionamento degli acidi nucleici da assemblaggi misti virale, quando l'obiettivo è quello di studiare la composizione totale di acidi nucleici della comunità. In generale, ssDNA, RNA e DNA a doppia elica si eluire dalla colonna pho concentrazioni di tampone fosfato maggiore di circa 0.40m 0e ~ rispettivamente. Tuttavia, ogni preparazione di idrossiapatite può avere una composizione leggermente diversa e profilo di eluizione quindi è importante verificare ogni preparazione con nota acidi nucleici (per esempio da una preparazione virus coltivato). Questo permetterà all'utente di accertare le concentrazioni specifiche di fosfati contenenti buffer necessaria per eluire gli acidi nucleici desiderato.

Un fattore limitante di questa tecnica è la quantità di spazio disponibile su Ca 2 + ioni presenti nella idrossiapatite che può legare la spina dorsale fosfato degli acidi nucleici. Il capacityamount della idrossiapatite nella colonna può essere scalato verso l'alto o verso il basso per colonna (dettate dalle dimensioni della colonna d'acqua con camicia e la quantità di idrossiapatite utilizzato) e il volume di buffer utilizzati per l'eluizione può essere scalato verso l'alto o verso il basso per ospitare molto piccoli o grandi quantità di acidi nucleici di ingresso, ma è in ultima analisi, limitata dalla dimensione della colonna d'acqua con camicia.

Inoltre, una tecnica di partita se si combinano gli acidi nucleici, idrossiapatite e fosfato contenenti tamponi in un tubo, misto, e centrifugati a bassa velocità è un modo alternativo di isolare mirati acidi nucleici. Questa strategia può essere utile in alcuni casi, ma non è così affidabile come i metodi cromatografici che sono più precisi e fornire una migliore frazionamento degli acidi nucleici.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata sostenuta dall'Ufficio della Scienza (BER), US Department of Energy, Cooperativa accordo no. De-FC02-02ER63453, la National Science Foundation microbica Programma Genome Sequencing (numeri premio 0626826 e 0731916). Ringraziamo Giovanni in vetro per la sua competenza tecnica e di consulenza e K. Eric Wommack per la sua assistenza con la raccolta dei campioni ambientali.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Econo-Column Bio-Rad 737-0717 0.7cm ID package/2
Hydroxyapatite Bio-Rad 130-0520 DNA Grade Bio-Gel HTP Gel, 100g/td>
Sodium Phosphate, Monobasic VWR international VW1497-01 Monohydrate, Crystal 500g
Sodium Phosphate, Dibasic VWR international VW1496-01 Anhydrous, Powder 500g
DEPC-treated Water Invitrogen AM9922 1L
10% SDS Solution Invitrogen 24730-020 UltraPure, 1L
0.5M EDTA Invitrogen AM9262 pH 8.0, 1L
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2-25ML
2ml serological pippette VWR international 89130-884 Polystyrene, Sterile
BD Falcon Centrifuge Tubes VWR international 21008-936 15ml, Sterile
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1 v/v/v) Invitrogen 15593-031 UltraPure, 100ml
Amicon Ultra-4 Centrifugal Device EMD Millipore UFC803024 Ultracel-30 membrane
20X TE Buffer, Rnase free Invitrogen T11493 100ml
Glycoblue Invitrogen AM9516 15mg/ml

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References

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