Generation teratoma nella Capsule Testicolo

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di dosare la pluripotenza generando teratomi nella capsula testicolare di topi immunocompromessi utilizzando cellule staminali pluripotenti umane o PSC H. Inizia raccogliendo una coltura delle PSC H putative da testare per la pluripotenza. Quindi eseguire un intervento chirurgico per esporre i testicoli del topo e iniettare le cellule nella capsula del testicolo.

Riposizionare i testicoli nella loro posizione originale e richiudere chirurgicamente il topo dopo sei-12 settimane, esaminare il tumore risultante mediante istologia per la presenza di cellule da ogni strato germinale. In definitiva, i risultati possono dimostrare che una linea HPSC è veramente pluripotente, dimostrando che può differenziarsi in cellule da tutti e tre gli strati germinali in un topo immunocompromesso. Sebbene siano stati recentemente riportati nuovi metodi per dimostrare la pluripotenza delle cellule staminali umane, il test del teratoma rimane il gold standard nel campo dimostrando che la procedura sarà Tron, un tecnico senior nel mio laboratorio di coltura.

Le cellule staminali pluripotenti umane per cofluenziare e quindi dissociare gli H PSE con Accutane enumerano le cellule per rispendere 1 milione di HPC per iniezione. Per prima cosa rasare l'addome di topi maschi anestetizzati di sei settimane di un ceppo di topo immunocompromesso con le tosatrici. Pulire la parete anteriore dell'addome del topo con una soluzione di iodio povidone, partendo dal centro dell'addome e procedendo in senso orario verso l'esterno.

Quindi lavare l'area rasata con etanolo al 70%. Ripetere il processo tre volte, cambiando i tamponi ogni volta. Per eseguire la procedura chirurgica, trasferire l'animale su un termoforo all'interno di una cappa sterile con forbici chirurgiche sterili.

Praticare un'incisione longitudinale di un centimetro attraverso la pelle e il peritoneo appena sotto il livello dell'articolazione dell'anca tenendo il peritoneo con una pinza. Raggiungi l'anca destra con un altro paio di pinze sterili ed estrai il tessuto adiposo bianco insieme ai testicoli attaccati. Ora riempi una siringa di tubercolina da un CC con l'hpsc da iniettare Iniettare lentamente da 20 a 30 microlitri di H PSC al centro della capsula del testicolo, lontano da qualsiasi vaso sanguigno principale.

Rimuovere lentamente l'ago per evitare il reflusso delle cellule utilizzando una pinza. Trasferisci i testicoli e il tessuto adiposo nella loro posizione originale nell'addome. Chiudere il peritoneo con due o tre punti di sutura riassorbibili e chiudere la pelle con clip automatiche.

Dopo l'intervento chirurgico, somministrare analgesia due volte al giorno secondo necessità. Monitorare l'animale per la crescita palpabile del tumore nel corso di sei-12 settimane. A circa cinque millimetri di dimensione del tumore, rimuovere il tumore dal topo sacrificato per la documentazione.

Fotografa il tumore e misura sia le dimensioni che il peso. Quindi tagliare il tumore in piccoli pezzi e fissarlo in una soluzione di paraldeide al 4% per istopatologia. In genere, un teratoma si osserva dopo sei-12 settimane.

In questo esempio, 1 milione di cellule staminali pluripotenti umane sono state iniettate nella capsula testicolare di un topo immunocompromesso. Un attento esame del teratoma rivela eterogeneità e molte cisti attaccate. Come previsto.

Le analisi istopatologiche indicano la presenza di cellule da ciascuno dei tre strati germinali. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di includere una linea cellulare di controllo positiva che si sa essere piuttosto potente per assicurarsi che il test sia stato eseguito correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona idea di come determinare se una linea di cellule staminali umane è pluripotente o meno.