الجيل التجريبية للسرطان ، المرتبطين بها الخلايا الليفية (مقاهي) من الخلايا الليفية الثديية البشرية

* These authors contributed equally
JoVE Journal
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

سرطان المرتبطة الليفية (مقاهي) غنية myofibroblasts الحالية داخل الورم سدى ، ولعب دورا رئيسيا في دفع عجلة تطور الورم. قمنا بتطوير نموذج xengraft الورم coimplantation تجريبيا لتوليد الخلايا الليفية من مقاهي الثديية البشرية. بروتوكول يصف كيفية تأسيس myofibroblasts CAF أن اكتساب القدرة على تعزيز tumourigenesis.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Polanska, U. M., Acar, A., Orimo, A. Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts. J. Vis. Exp. (56), e3201, doi:10.3791/3201 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وسرطان الأنسجة معقدة تتألف من خلايا الأورام وحجرة غير سرطانية المشار إليها باسم "سدى". ستروما يتكون من المصفوفة خارج الخلية (ECM) ومجموعة متنوعة من خلايا اللحمة المتوسطة ، بما في ذلك الخلايا الليفية ، myofibroblasts ، والخلايا البطانية ، pericytes والكريات البيض 1-3.

ستروما المرتبطة الورم يستجيب للإشارات الصادرة عن نظير الصماوي كبيرة سرطان الخلايا المجاورة. أثناء عملية المرض ، وغالبا ما يصبح سدى يسكنها سرطان المرتبطة الليفية (مقاهي) بما في ذلك أعداد كبيرة من myofibroblasts. وقد سبق هذه الخلايا المستخرجة من أنواع عديدة ومختلفة من السرطانات البشرية لثقافتهم في المختبر. A subpopulation من مقاهي تكون مميزة من خلال التنظيم تصل بهم من الأكتين العضلات على نحو سلس α (α - SMA) 4،5 التعبير. هذه الخلايا هي السمة المميزة ل'الليفية تنشيط" التي تشترك مع خصائص مشابهة ج myofibroblastsولاحظ ommonly في أنسجة المصابين ومتليفة 6. يرتبط ارتباطا وثيقا وجود هذا فرعية CAF myofibroblastic إلى الدرجة العالية والأورام الخبيثة المرتبطة التكهنات الفقراء في المرضى.

وقد أظهرت العديد من المختبرات ، بما في ذلك منطقتنا ، أن مقاهي ، عندما تم حقنها بخلايا سرطان العوز المناعي في الفئران ، وقادرة على تعزيز كبير tumourigenesis 70-10. مقاهي من مرضى سرطان المعدة ، ومع ذلك ، تخضع في كثير من الأحيان الشيخوخة خلال نشر الثقافة في الحد من اتساع نطاق استخدامها في جميع أنحاء التجريب المستمر. للتغلب على هذه الصعوبة ، قمنا بتطوير تقنية جديدة لتوليد تجريبيا خلد الإنسان الخلية الثديية CAF خطوط (إكسب - مقاهي) من الخلايا الليفية الثديية البشرية ، وذلك باستخدام نموذج ورم الثدي coimplantation طعم أجنبي.

كانت أول immortali من أجل توليد إكسب ، مقاهي ، والأبوية الليفية الثديية الإنسان ، تم الحصول عليها من الحد من الأنسجة رأب الثدي ،الحوار الاقتصادي الاستراتيجي مع hTERT ، والوحيدات الحفاز للعميم الإنزيم تيلوميراز ، وهندستها لGFP التعبير عن الجينات المقاومة وبوروميسين. وكانت هذه الخلايا coimplanted مع MCF - 7 خلايا سرطان الثدي التعبير عن الجين الورمي رأس تنشيط (MCF - 7 - رأس الخلايا) في طعم أجنبي الماوس. بعد فترة حضانة المرض في الجسم الحي ، تم استخراج الخلايا الليفية حقن في البداية الثديية البشرية من xenografts الورم على أساس المقاومة بوروميسين بهم 11.

لاحظنا أن الخلايا الليفية المقيمين الثديية البشرية ومتباينة ، واعتماد النمط الظاهري myofibroblastic والمكتسبة للورم تعزيز الخصائص أثناء تطور الورم. الأهم من ذلك ، هذه الخلايا ، على النحو المحدد إكسب ، مقاهي ، تحاكي عن كثب النمط الظاهري للورم تعزيز myofibroblastic من مقاهي سرطان الثدي المعزولة من تشريح من المرضى. لدينا ورم طعم أجنبي المستمدة إكسب - مقاهي بالتالي توفير نموذج فعال لدراسة بيولوجيا في مقاهي breas الإنسانسرطان ر. ويمكن أيضا وصف البروتوكول يجوز تمديدها لتوليد وتوصيف مختلف السكان CAF المستمدة من أنواع أخرى من السرطانات البشرية.

Protocol

1. عزل الخلايا الليفية الأولية العادي المثقف الإنسان الثديية

وترد الإجراءات التجريبية لعزل المثقف الإنسان العادي الليفية الأولية الثديية في الشكل. 1A.

  1. إعداد العازلة تفارق الخلية ، كما هو موضح سابقا (12) : متوسطة Dulbecco في التعديل النسر (DMEM) مع 10 ٪ مصل العجل الجنين (FCS) ، البنسلين ، الستربتومايسين (200 وحدة / مل) ، كولاجيناز النوع الأول (1 ملغ / مل) ، وهيالورونيداز ( 125 وحدة / مل).
  2. غسل نسيج الثدي تشريح من رأب الثدي التخفيض (~ 0.5 غرام) عدة مرات في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). فرم النسيج إلى أجزاء صغيرة (<1.5 مم 3) استخدام شفرات الحلاقة معقمة.
  3. نقل الأنسجة شظايا في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على مبلغ مناسب للالعازلة الخلية تفارق أعلاه (10 مل لكل 0.5 غرام من الأنسجة) ودوامة لمدة 1 دقيقة في أقصى سرعة.
  4. هضم الأنسجة شظايا في الخلية تفارق العازلة وأو 12-18 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الانفعالات بطيئة. * لاحظ أنه لن يكون هناك لا يزال العديد من القطع شظايا الأنسجة غير المهضومة في الأنبوب.
  5. احتضان الأنبوب لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة دون الانفعالات. نقل انسجة الخلايا الناتجة المخصب طاف في أنبوب مخروطي الشكل الجديد باستخدام الماصة 5 مل المصلية.
  6. الطرد المركزي الكسر اللحمية لمدة 5 دقائق في ز X 250 و resuspend الكرية خلية في برنامج تلفزيوني. الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 5 دقائق في ز X 250 و resuspend الكرية خلية في DMEM تستكمل مع FCS 10 ٪. الثقافة في الخلايا التي تحتوي على السفح DMEM 10 ٪ في طبق بتري 15 سم في 37 درجة مئوية وغاز ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪.
  7. نشر الخلايا حتى متموجة. وسوف يستغرق عادة 8-10 أيام. تخزين الخلايا عند -80 درجة مئوية باستخدام المتوسطة تجميد (ثنائي ميثيل سلفوكسيد 10 ٪ و 20 ٪ في FCS DMEM). 5 إعداد القنينات المجمدة باعتبارها المخزون الأصلي. passaged أذاب one فيال وتوسيع الخلايا لإعداد 5 قوارير للسهم الثانوية التي تحتوي على الخلايا الليفية في غضون 5 السكانالأضعاف (PDS) لتجارب لاحقة. هذه الإجراءات تقليل الإجهاد واختيار نسيلي الثقافة التي يمكن أن تحدث أثناء زراعة الأنسجة الموسعة. * لاحظ أنه يمكن أيضا P1.1 - 7 تستعمل لعزل سرطان الثدي من مقاهي التي حصلت عليها عملية استئصال الثدي 12.

2. جيل من GFP المسمى ، بوروميسين المقاوم ، الخلايا الليفية الإنسان العادي خلدت الثديية

  1. تخلد إلى الإنسان العادي الابتدائي الليفية الثديية معزولة في P1.7) ، إدخال pMIG فيروسات (MSCV - IRES - GFP) ناقلات 12 ، معربا عن كلا hTERT وGFP. ثقافة الخلايا لل4-5 أيام ثم فرز GFP إيجابية الخلايا باستخدام التدفق الخلوي.
  2. إدخال فيروسات pBabe - بورو بناء ترميز الجينات المقاومة بوروميسين في الخلايا الليفية GFP المسمى خلده. ثقافة الخلايا لمدة 5-7 أيام في حضور بوروميسين (تركيز النهائي : 1 ميكروغرام / مل) لعزل GFP إيجابية (GFP +) ، بوروميسين المقاوم (R بورو
  3. المقبل ، لدراسة ما إذا كانت هذه الخلايا الليفية تنتج الفيروسات النشطة ، والتي يمكن أن تؤدي إلى نقل الأفقي للجينات ترميز GFP بوروميسين والمقاومة ، وتنمو 2.5x10 5 GFP + R بورو خلدت الليفية الثديية البشرية في طبق بيتري 6 سم لمدة 2 ايام.
  4. متوسطة تصفية مشروطة من قبل هذه الخلايا الليفية باستخدام محقنة تصفية (حجم المسام : 0.45 ميكرون) وإضافته على خلايا فأر 10T1 / 2 ليفية 12H في حضور سلفات بروتامين (5 ميكروغرام / مل) الذي يزيد من كفاءة عدوى الفيروس. ثم يتم تغيير المتوسط ​​إلى 10 ٪ FCS - 2 DMEM لأيام إضافية.
  5. فحص الخلايا بواسطة المجهر مضان. سوف 10T1 / 2 الخلايا المصابة بفيروس GFP تصبح GFP إيجابية. علاج الخلايا أيضا مع بوروميسين (1 ميكروغرام / مل) لمدة 5-7 أيام ومراعاة لوحة وجدت بورو 10T1 R / 2 هي مستعمرات الخلايا الحالية وشكل بعد العلاج بوروميسين.
  6. علما أن الجينات الأفقي ترانقد sfer الفيروسات النشطة التي تنتجها GFP الوالدين + R بورو الليفية الثديية البشرية تجعل الخلايا المحيطة الفئران و / أو خلايا سرطان GFP + R في غضون بورو xenografts الورم. هذا قد تعيق عمليات عزل GFP حقنه في البداية + R بورو الليفية الثديية البشرية من xenografts الورم.

3A. Coinjection الخلايا الليفية الثديية البشرية مع خلايا سرطان الثدي إلى الماوس العوز المناعي

ويوضح إجراءات تجريبية لتوليد إكسب - مقاهي في الشكل. 1Ba.

  1. مزيج 1x10 6 MCF - 7 - رأس سرطان الثدي والخلايا البشرية 3x10 6 GFP + R بورو ، خلدت الليفية الثديية البشرية ولدت في P2.2). تحضير الخلايا في 400 ميكرولتر من مستنبت مع 50 ٪ (V / V) Matrigel في الحقن.
  2. حقن تحت الجلد الخليط الخلية في الماوس ولعارية العوز المناعي. عندما يتم استخراج مقاهي مستقلة من مختلفالأورام وزرع الخليط في كل الجناحين الأيمن والأيسر من الفئران عدة.

3B. حقن الخلايا الليفية الثديية الإنسان في ماوس العوز المناعي

  1. لتوليد الخلايا الليفية تحكم ضد مقاهي ، إكسب ، وإعداد 3x10 6 GFP + R بورو خلدت الليفية الثديية البشرية ولدت في P2.2 في 400 ميكرولتر من مستنبت مع 50 ٪ (V / V) في حقن Matrigel (الشكل 1Bb). لا تخلط مع الخلايا الليفية للسرطان.
  2. زرع الخلايا الليفية أعد في P3b.1 إلى مواقع تحت الجلد من الفئران عارية.

* لاحظ أن الخلايا الليفية تلقيح سوف تشكل أنسجة ليفية ولكن ليس ورم تحت الجلد.

4A. تشريح الورم طعم أجنبي

  1. Euthanise الماوس ايواء الثدي تحت الجلد البشري طعم أجنبي السرطان 42 يوما بعد الزرع (الشكل 1Ba) * ملاحظة. coimplanted التي هي سرطان الخلايا عندما أخرى و / أو الليفية، قد تحتاج الخلايا الليفية لتكون المحتضنة لمدة أطول من 42 يوما داخل الورم طعم أجنبي للشروع في النمط الظاهري myofibroblastic بهم.
  2. حصاد طعم أجنبي الورم من الجهة من الفأرة بواسطة ملقط تشريح حادة واستخدام المقص. تزج في نسيج الورم في برنامج تلفزيوني.

4B. تشريح طعم أجنبي الليفية

  1. Euthanise الماوس إيواء طعم أجنبي الليفية 42 يوما بعد الزرع (الشكل 1Bb).
  2. تشريح طعم أجنبي الليفية تحت الجلد باستخدام ملقط ومقص. وضع أنسجة ليفية في برنامج تلفزيوني. * لاحظ أن الخلايا الليفية طعم أجنبي ، والذي يظهر في الانسجة شفافة صغيرة ، قد يكون من الصعب العثور تحت الجلد.

5. إعداد الخلايا المستزرعة الابتدائية من xenografts

  1. استخدام الحكومة للسلامة الأحيائية العقيمة لتشريح الورم (~ 0.5 غرام) أو أنسجة ليفية (~ 0.1 جرام). نقل الأنسجة استئصاله على الجزء العلوي من ثقافة الطول 15 دالعش مع 1 مل من برنامج تلفزيوني. أنسجة اللحم المفروم إلى أجزاء الأنسجة الصغيرة (<1.5 مم 3) استخدام شفرات الحلاقة معقمة. * لاحظ أنه إذا كان طعم أجنبي الليفية يزن أقل من 0.1 غرام ، وجمع بضعة xenografts الليفية إضافية ومزجها معا لزيادة عدد الخلايا عن العزلة.
  2. نقل الأنسجة شظايا في أنبوب 15 مل مخروطي يحتوي على الخلية تفارق العازلة (10 مل لكل 0.5 غرام من الأنسجة) ودوامة لمدة 1 دقيقة في أقصى سرعة.
  3. احتضان تعليق خلية لمدة 3 ساعات في 37 درجة مئوية مع التحريض المستمر البطئ.

6. عزل خلايا بوروميسين المقاوم في الثقافة

  1. الطرد المركزي لفصل الخلايا تعليق إما من طعم أجنبي أو ورم الخلايا الليفية لمدة 5 دقائق في ز X 250 و resuspend الكرية خلية في برنامج تلفزيوني. الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 5 دقائق في X 250 جرام. Resuspend الناتجة بيليه في الخلية 10 ٪ FCS - DMEM. ثقافة خلايا في طبق بتري 15 سم في حضور بوروميسين (1 ميكروغرام / لتر) عند 37 درجة مئويةو 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون من أجل القضاء على أية خلايا سرطان تلويث و / أو خلايا انسجة الفئران. نشر الخلايا حتى متموجة (2-4 أسابيع). تخزين الخلايا عند -80 درجة مئوية باستخدام المتوسط ​​التجمد. * لاحظ أن الخلايا الناتجة بورو R ، المعين لمدة 42 يوما من العمر ، إكسب CAF1 (الشكل 1Ba) أو التحكم الليفية - 1 الخلايا (الشكل 1Bb) ، هي خالدة وايجابية GFP. فمن المستحسن للتحقق مما اذا كانت هذه الخلايا تنتج الفيروسات النشطة باستخدام 10T1 / 2 الخلايا ، كما هو موضح في 6 - P2.3.

7A. عزلة إكسب - CAF2 الخلايا في الثقافة

لمزيد من تعزيز النمط الظاهري تنشيط myofibroblastic للمقاهي ، مزيج لمدة 42 يوما من العمر ، إكسب CAF1 مع خلايا MCF - 7 - رأس الخلايا وحقن تحت الجلد مرة أخرى إلى ماوس عارية لفترات إضافية من 200 يوما. تشريح وفصل في الورم طعم أجنبي في تعليق وحيد الخلية والثقافة خلايا في طبق بتري 15 سم مع 10 ٪ FCS - DMEM في حضور بوروميسين (1 ميكروغرام / مل) ، كما هو مبين في P60.1. نشر الخلايا حتى متموجة (8-10 يوما). تخزين الخلايا عند -80 درجة مئوية باستخدام المتوسط ​​التجمد. تتم تسمية الخلايا الناتجة بورو R 242 يوما من العمر ، إكسب CAF2 الخلايا (الشكل 1Ba).

7B. استخراج الخلايا الليفية - 2 تحكم في الثقافة

لتوليد الخلايا الليفية ضد السيطرة إكسب CAF2 خلايا ، وضخ 42 يوما من عمره تحكم الخلايا الليفية - 1 وحده من دون خلايا سرطان تحت الجلد في ماوس عارية بالإضافة إلى ذلك لمدة 200 يوما. تشريح وتفكيك النسيج ليفية في تعليق خلية واحدة وثقافة خلايا في طبق بتري 15 سم مع 10 ٪ FCS - DMEM في حضور بوروميسين (1 ميكروغرام / مل) كما هو مبين في P6.1. نشر الخلايا حتى متموجة (3-4 أسابيع). تخزين الخلايا عند -80 درجة مئوية باستخدام المتوسط ​​التجمد. تتم تسمية الناتجة بورو الخلايا الليفية R - 2 تحكم الخلايا (الشكل 1Bb).

8. ممثل النتائج :

السيطرة الليفية - 2 - إكسب وسل CAF2ملون ليرة سورية ، والتي تم استخراجها من xenografts ورم الثدي ، وبقوة علامات إيجابية لالوسيطة ، بما في ذلك الإنسان الخاصة vimentin ، prolyl - 4 - هيدروكسيلاز ، 1A الكولاجين ، فبرونيكتين ، S100A4 ، والبروتين الليفية السطحية (الشكل 2A) 11 ، مما يدل الإنسان أصل وطبيعة الوسيطة من هذه الخلايا. في المقابل ، لم يكن في cytokeratin الملون ، وهي علامة للحصول على الخلايا الظهارية في هذه الخلايا الليفية + GFP (الشكل 2B). هذه النتائج تشير الى ذلك أن استخراج إكسب - CAF2 ومراقبة الخلايا الليفية - 2 قد نشأت من الخلايا الليفية الأبوية الثديية البشرية قدم في البداية إلى xenografts الماوس.

الأهم من ذلك ، ملطخة نسبة أعلى من إكسب - CAF2 الخلايا إيجابية لα - SMA وخارج الخلية بروتين سكري مصفوفة tenascin 5 - C ، وكلاهما من علامات myofibroblasts مقارنة ب 42 يوما من العمر CAF1 - إكسب والسيطرة الليفية - 2 الخلايا (الشكل رقم . 2C ، D) 11. هذه المعطيات تشير إلى أن المقيمين fibr الثديية البشريةأقاليم تتطور تدريجيا في غضون myofibroblasts CAF xenografts الورم.

الشكل 1
التمثيل التخطيطي الرقم 1 من عزل الخلايا الليفية الثديية البشرية. أ) كان مفروم النسيج رأب الثدي الحد من استخدام شفرات الحلاقة المعقمة (P1.2) ونقل في أنبوب 15 مل المخروطية (P1.3). تم هضم الأنسجة شظايا صغيرة في الخلية تفارق العازلة (P1.4) والمعد للثقافة في المختبر (P1.5 - 7). وقدم لتخلد الأولية الإنسان معزولة الليفية الثديية ، وهو pMIG فيروسات (MSCV - IRES - GFP) ناقلات ، معربا عن كلا hTERT وGFP ، وتم فرز GFP - الإيجابية الناتجة الخلايا باستخدام التدفق الخلوي (P2.1). وقدم بعد ذلك فيروسات pBabe - بورو ناقلات ترميز الجينات المقاومة بوروميسين في هذه الخلايا. على المعاملة بوروميسين ، GFP المسمى (GFP +) بوروميسين المقاوم (بورو R) ، immortaliتم عزل الخلايا الليفية SED الثديية البشرية (P2.2).

وكانت coinjected BA) لإنشاء إكسب - مقاهي ، GFP + R بورو خلدت الليفية الثديية البشرية MCF - 7 - رأس خلايا سرطان الثدي تحت الجلد في الماوس ولعارية العوز المناعي (P3a). وكانت مقطوعة طعم أجنبي الورم في 42 يوما بعد الزرع (P4A) ، وفصل في تعليق وحيد الخلية (P5). ثم كانت هذه الخلايا المستزرعة في المختبر في حضور بوروميسين للقضاء على أي خلايا سرطان خلايا فأر وتلويث اللحمية (P6). وصفت بأنها الناتجة بوروميسين مقاومة الخلايا المولدة تجريبيا CAF1 (إكسب - CAF1) الخلايا. وكانت هذه الخلايا ، مقطوعة 42 يوما بعد الغرس ، مرة أخرى مختلطة مع MCF - 7 - رأس الخلايا وزرعها تحت الجلد في الماوس كما كان من قبل المضيف (P7a). وسمح للورم أن ينمو الناتج لفترات إضافية من 200 يوما ، ثم تشريح ، فصلها ، والمثقف في حضور بوروميسين. المعزولةوصفت بأنها مقاومة الخلايا بوروميسين إكسب - CAF2 الخلايا (242 يوما).

ب) لعزل خلايا تحكم ضد مقاهي ، إكسب ، GFP + R بورو تم حقن الخلايا الليفية خلدت الثدي تحت الجلد في الإنسان ماوس عارية كما ثقافات نقية دون MCF - 7 - رأس الخلايا (P3b). أنسجة ليفية ، وتشريح 42 يوما بعد الزرع (P4b) ، في فصل وحيد الخلية المعلقات (P5) والخلايا بوروميسين المقاوم ، واسمه التحكم الليفية - 1 الخلايا ، كانت معزولة كما هو موضح سابقا (P6). ومرة أخرى هذه الخلايا الليفية المزروعة تحت الجلد في ماوس عارية دون MCF - 7 - رأس بالإضافة إلى الخلايا لمدة 200 يوما (P7b). وكان تشريح الأنسجة ليفية ، فصلها ، والمثقف في حضور بوروميسين. وقد وصفت معزولة بوروميسين مقاومة الخلايا الليفية - 2 تحكم الخلايا (242 يوما).

الشكل 2
الشكل 2 (B) وفي المقابل ، لعموم cytokeratin ، وهي علامة للحصول على الخلايا الظهارية ، لم يتم الكشف في عملي ، معربا عن الخلايا CAF2 GFP (الخضراء). هي ملطخة نواة الخلية مع 4' - 6 - Diamidino phenylindole - 2 - (دابي) (الأزرق). مقياس بار ، و 50 ميكرون (والمشار من كوجيما وآخرون 11)

(ج) من إكسب المناعي - CAF2 الخلايا الليفية والسيطرة - 2 الخلايا (السيطرة ف) باستخدام أجسام مضادة ضد α - SMA (الحمراء) أو tenascin - C (TN - C) (الحمراء). هي ملطخة نواة الخلية مع دابي (الأزرق). مقياس بار ، و 50 ميكرومتر (D) 48 ٪ من عملي ، وصمة عار CAF2 الخلايا إيجابية لα - SMA ، في حين أن 14 ٪ من ال 42 يوما من العمر ، إكسب CAF1 و 2.5 ٪ من السكان تحكم الخلية الليفية - 2 هي إيجابية لSMA - α. (يشار آخرون من كوجيما al.11)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لوحظ عدم وجود علامات محددة CAF ومستوى التجانس بين مقاهي تقديم توصيف هذا نوع من الخلايا يمثل تحديا في حد ذاته. كما تم في المختبر دراسة مقاهي يعوقه تعقيد إضافي على أن هذه الخلايا المتكاثرة senesce ووقف عند تربيتها لفترة طويلة. وكانت محاولة سابقة لدينا تخلد مباشرة مقاهي الأولية باستخدام بناء hTERT فيروسات [كدنا] ناجحة. وضعنا لذلك ، لتحقيق مزيد من الورم تعزيز خصائص هذه الخلايا ، وهي طريقة لتوليد مقاهي خلدت من الخلايا الليفية الثديية البشرية باستخدام نموذج coimplantation طعم أجنبي الورم. وقد خلدت الأولية الليفية الثديية البشرية ، المستخرجة من خفض الأنسجة رأب الثدي ، وذلك قبل حقنها بخلايا سرطان الثدي في الفئران. تم عزل الخلايا الليفية الإنسان ثم من xenografts الورم الناتج (انظر الشكل 1Ba للحصول على التفاصيل). الأهم من ذلك أن الخلايا الليفية الإنسان الثديية ه متزايدvolved الى تعزيز ورم مقاهي myofibroblastic خلال تطور الورم. لاحظنا بالفعل أن 242 يوما من العمر ، إكسب CAF2 خلايا الورم تظهر تعزيز قدرة أكبر بكثير myofibroblastic مقارنة ب 42 -- أو 70 يوما من العمر ، إكسب CAF1 الخلايا الليفية والسيطرة - 2 الخلايا 11. ورم تعزيز قدرة هذه الخلايا myofibroblastic إكسب CAF2 ، والتي لوحظ أيضا في مقاهي أعدت من مرضى سرطان الثدي ، ويعتمد على إقامة حلقات يشير autocrine بوساطة TGF - β السيتوكينات وقوات الدفاع الذاتى 1-11. لا نقل الجينات أو الانصهار بين خلايا سرطان الخلايا والخلايا الليفية ، يتوسط الظواهر من مقاهي ولدت في 11 نموذجنا طعم أجنبي. أخذت معا ، هذه الملاحظات تشير إلى أن طعم أجنبي المستمدة إكسب - مقاهي بمثابة أداة مفيدة لدراسة مقاهي سرطان الثدي موجودة داخل الإنسان. ويمكن أيضا وصف بروتوكول تجريبي للتمديد لعزل مختلف مقاهي الناشئة عن أنواع أخرى من السرطانات البشرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نشكر الدكتور روبرت ألف واينبرغ (معهد وايتهيد للأبحاث الطبية الحيوية في كامبريدج) للحصول على الدعم السخي والإشراف على هذا العمل ، والسيد كيران Mellody (جامعة مانشستر ، مانشستر) للتحرير الحاسمة لهذا المخطوط. وقد أيد هذا المشروع من قبل المملكة المتحدة للبحوث (CR - المملكة المتحدة) منح عدد C147/A6058 (AO)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen 61965-026
Fetal calf serum GIBCO, by Life Technologies 10270
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140-122
Collagenase type I Sigma-Aldrich C0130-1G
hyaluronidase Sigma-Aldrich H4272
Vimentin (V9) antibody Novocastra Laboratories

NCL-L-

VIM-V9
Tenascin C (BC-8) antibody

a gift from
Dr. Luciano

Zardi
α-SMA-Cy3 (1A4) antibody Sigma-Aldrich C6198

Prolyl-4-hydroxylase

Dako M0877
(5B5) antibody
Collagen type1 1A antibody Sigma-Aldrich HPA011795
Pan-cytokeratin antibody Sigma-Aldrich C5992
Fibronectin antibody BD Biosciences 610077

S100A4/FSP-1 (fibroblast-

specific protein-1) antibody
Dako A5114

Fibroblast surface protein

(clone 1B10) antibody
Abcam ab11333
MSCV-IRES-GFP construct Request to the the authors
pBabe-puro construct

Purchase

from Addgene
Puromycin Sigma-Aldrich P8833
DAPI Sigma-Aldrich D9564
15 ml conical tube Corning 430766
Nude mouse Taconic NCRNU-F Female NCr nude
C3H/10T1/2 cells ATCC CCL-226

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ronnov-Jessen, L., Bissell, M. J. Breast cancer by proxy: can the microenvironment be both the cause and consequence? Trends Mol. Med. 15, 5-13 (2009).
  2. Mueller, M. M., Fusenig, N. E. Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer. Nat. Rev. Cancer. 4, 839-849 (2004).
  3. Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
  4. Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).
  5. De Wever, O. Tenascin-C and SF/HGF produced by myofibroblasts in vitro provide convergent pro-invasive signals to human colon cancer cells through RhoA and Rac. 18, 1016-1018 (2004).
  6. Serini, G., Gabbiani, G. Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation. Exp. Cell. Res. 250, 273-283 (1999).
  7. Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression. Semin. Cell. Dev. Biol. 21, 19-25 (2010).
  8. Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Exp. Cell. Res. 316, 1324-1331 (2010).
  9. Polyak, K., Haviv, I., Campbell, I. G. Co-evolution of tumor cells and their microenvironment. Trends in Genetics. 25, 30-38 (2009).
  10. Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis. Semin. Cell. Dev. Biol. 21, 33-39 (2010).
  11. Kojima, Y. Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 20009-20014 (2010).
  12. Orimo, A. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121, 335-348 (2005).

Comments

1 Comment

  1. Can I immortalize the primary fibroblasts with pBaba-hygro-hTERT plasmid directly? Should I make viral particles or direct transfection in the fibroblasts will work? If direct transfection, what reagent is suitable for primary fibroblasts? Thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 2:44 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

Usage Statistics