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Detección y Genogrouping de norovirus en las heces de los niños por TaqMan en un solo paso RT-PCR

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Summary

Un One-Step RT-PCR para la detección e identificación genogrupo de los aislamientos de Norovirus en las heces de los niños, que utiliza cebadores y sondas TaqMan específicas para el marco de lectura abierto 1 (ORF1)-ORF2 región de la unión, la región más conservada del genoma del norovirus es descrito. Un no-comercial, rentable método de extracción de ARN se detalla.

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Apaza, S., Espetia, S., Gilman, R. H., Montenegro, S., Pineda, S., Herhold, F., Pomari, R., Kosek, M., Vu, N., Saito, M. Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR. J. Vis. Exp. (65), e3232, doi:10.3791/3232 (2012).

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Abstract

Los norovirus (NOV) son la principal causa de brotes de gastroenteritis aguda esporádica en todo el mundo en los seres humanos de todas las edades. Ellos son causa importante de hospitalización en niños con un impacto en la salud pública similar a la del rotavirus. NOV son virus de ARN de una gran diversidad genética y hay una continua aparición de nuevas cepas. Cinco genogrupos son reconocidos; GI y GII, con sus muchos genotipos y subtipos, siendo los más importantes para la infección humana. Sin embargo, el diagnóstico de estas dos genotipos sigue siendo problemática, retrasando el diagnóstico y tratamiento. 1, 2, 3

Para la extracción de RNA de muestras de heces, el método más comúnmente utilizado es el kit de QIAmp ARN viral comercial de Qiagen. Este método combina las propiedades de unión de una membrana de gel de sílice, tampones que RNasas de control y proporcionan unión óptimos de los ARN a la columna junto con la velocidad de MicroSpin. Este método es sencillo, rápido y fiable y es carrIED en unos pocos pasos que se detallan en la descripción proporcionada por el fabricante.

El Norovirus es sólo superada por rotavirus es la causa más común de diarrea. Diagnóstico de norovirus deben estar disponibles en todos los estudios sobre la patogenia de la diarrea, así como en los brotes de diarrea o de casos individuales. En la actualidad, sin embargo, el diagnóstico de norovirus se limita a unos pocos centros, debido a la falta de métodos sencillos de diagnóstico. Este retraso diagnóstico y el tratamiento 1, 2, 3. Además, debido a los costos de transporte y regulación de los buffers corrosivos dentro y entre los países el uso de estos equipos fabricados plantea problemas logísticos. Como resultado, en este protocolo se describe una alternativa, económica, en casa método que se basa en el original de la pluma y col. Método 4, que utiliza las propiedades de unión de ácidos nucleicos de partículas de sílice junto con las propiedades anti-nucleasa de tiocianato de guanidinio .

et al. 5 se detalla. La secuenciación del producto de PCR de la PCR convencional permite la diferenciación de genotipos pertenecientes al GI y GII genogrupos.

Protocol

1. Las muestras de heces

  1. Las muestras de heces deben conservarse congelados para preservar el ARN. Para hacer una suspensión al 10% fecal, tome aproximadamente 0,1 g de muestra de heces descongelado y completar a 1 ml con PBS.
  2. Dividir en partes alícuotas en 200 l para evitar los ciclos de congelación y descongelación. Almacene las alícuotas a -70 ° C.
  3. Descongele y centrifugue alícuotas a 4.000 g durante 10 minutos antes de su uso en la extracción.

2. Preparación de partículas de sílice para la extracción con guanidina y sílice

  1. A temperatura ambiente, suspender 30 g de dióxido de silicio y completar con dH 2 O hasta 250 ml.
  2. Después de 24 horas de sedimentación, eliminar 215 ml del sobrenadante por succión. Añadir DH 2 O hasta 250 ml, y la suspensión de la sílice precipitado por agitación.
  3. Después de otras 24 horas, separar el sobrenadante por succión, y ajustar el pH de la suspensión de sílice a un pH de 2,0, utilizando ácido clorhídrico (HCl). Alícuota de la suspensión de sílice en el bot de vidrioTLEs y autoclave.

3. Preparación de la L6 de búfer de extracción con guanidina y sílice

  1. A temperatura ambiente, preparar L6 tampón disolviendo 60 g de tiocianato de guanidinio (GuSCN) y 1,3 g de Triton X-100 en 50 ml de 0,1 M de hidrocloruro de Tris, pH 6,4, y 11 ml de una EDTA 0,2 M, pH 8,0 solución.

4. Preparación del tampón de L2 para extracción con guanidina y sílice

  1. A temperatura ambiente, preparar tampón L2 disolviendo 180 g de tiocianato de guanidinio (GuSCN) en 150 ml de 0,1 M de hidrocloruro de Tris, pH 6,4.

5. Procedimiento de extracción

  1. En cada extracción de una muestra de heces positivo NoV, como control positivo, y agua DEPC tratados, como control negativo, se debe incluir.
  2. En un tubo de centrífuga de micro-mezclar los siguientes; 1 ml de tampón L6, 20 l de partículas de sílice, y añadir 200 l de la suspensión extracto 10% fecal. Vortex brevemente y dejar a temperatura ambiente durante 15 millasn.
  3. Centrifugar la suspensión a 6000 g durante 10 s, y lavar el precipitado con 1 ml de tampón L2 dos veces, seguido por dos lavados con etanol al 70% y una vez con acetona. Secar el precipitado en un bloque de calentamiento en seco a 56 ° C durante 5 min.
  4. Hidratación el ARN en el sílice precipitado mediante la adición de 50 l de RNasa libre de dH 2 0. Añadir 1 l de RNasin, mezclar invirtiendo el tubo y se incuba a 56 ° C durante 15 min.
  5. Centrifugar durante 3 minutos a plena velocidad, en una centrífuga de mesa, y recoger 40 l del sobrenadante que contiene el ARN.
  6. Cuantificar los extrajeron muestras de ARN utilizando Nanodrop 2000 espectrofotómetro (Thermo Scientific). A continuación, almacenar a -70 ° C hasta su uso, hasta 6 meses. (Nota: Una mejor manera de preservar el total de ARN intacto es convertirlo en cDNA).

6. La extracción comercial alternativo mediante el ARN viral kit QIAamp ARN

Las instrucciones completas se encuentran en el folleto provIDed con el kit de QIAGEN. Brevemente el procedimiento es como sigue:

  1. L Pipetee 560 de tampón AVL que contiene el ARN portadoras en un tubo de 1,5 ml, y añadir 140 l de la suspensión de heces 10%. Mezclar por vortex pulso durante 15 segundos. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
  2. Añadir 560 l de etanol (96-100%) a la muestra y mezclar por vortex pulso durante 15 segundos, centrifugar brevemente.
  3. Aplicar 630 l de esta solución a una columna de centrifugación coloca en un tubo de recogida de 2 ml. Centrifugar durante 1 min a 6.000 g, y luego colocar la columna de centrifugación en un tubo limpio ml 2.
  4. Lavar la columna que contiene ARN enlazados con 500 l de buffer AW1 y se centrifuga a 6.000 g durante 1 min. Coloque la columna en un tubo de recogida limpio de 2 ml.
  5. Lavar la columna con 500 l de tampón AW2 y centrifugar a toda velocidad (20.000 g ó 14.000 rpm) durante 3 min.
  6. La columna de giro en un lugar limpio de 1,5 ml de micro-tubo de centrífuga, añadir 40 l agua tratada con DEPC y eluir el RNA a toda velocidad. Repita el procedimiento ence para una final de 80 L de ARN eluidos.
  7. Cuantificar los extrajeron muestras de ARN utilizando Nanodrop 2000 espectrofotómetro (Thermo Scientific). A continuación, almacenar a -70 ° C hasta su uso, hasta 6 meses. (Nota: Una mejor manera de preservar el total de ARN intacto es convertirlo en cDNA).

7. La detección de norovirus en el ARN extraído por el tiempo de un paso real RT-PCR con sondas específicas de Taqman

Instrumento StepOnePlus PCR en Tiempo Real de Sistemas (Applied Biosystems).

Metodología

  1. Limpiar y limpiar todas las superficies de trabajo, pipetas y centrífugas con RNasa LEJOS para eliminar cualquier potencial de contaminación RNasa.
  2. Pipetear la GI y GII NoV detección mezclas maestras de acuerdo a la Tabla 1. Primers y sondas TaqMan están listados en la Tabla 2.
  3. Alícuota de 10 l de mezcla maestra apropiada a cada tubo de reacción.
  4. Añadir 5 ml de la muestra problema sin diluirARN, agua tratada con DEPC como control negativo, o IG, respectivamente, GII positivo ARN de control, a los pocillos de reacción correspondientes. Todas las muestras deben procesarse por duplicado. Los controles positivos y las normas de concentración de 300 mg / l y 500 mg / l, respectivamente, fueron proporcionados por Nacional Calicivirus Laboratorio Centro para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC).
  5. Centrifugar la placa de reacción a 6.000 g durante 10 seg.
  6. En la pantalla del experimento de propiedades, definir y seleccionar un tipo de experimento para la carrera. Asegúrese de que los reactivos TaqMan se muestran como el tipo de reactivos, y que decía: pre-PCR y la amplificación se seleccionan.
  7. Ejecutar 15 l reacciones utilizando el perfil térmico en la Tabla 3.
  8. Analizar los resultados.

8. La genotipificación del NoV GI y GII Usando convencional de RT-PCR y secuenciación

(No se menciona en este video, ya que es un método común y ampliamente utilizado.)

Instrumento. Applied Biosystems StepOne y StepOnePlus en tiempo real de sistemas de PCR con la plantilla Quantitec.

Metodología

  1. Antes de genotipado, el genogrupo (GI o GII) de las muestras se determinó por la detección de RT-PCR se ha descrito anteriormente. GI NoV ARN tiene que ser amplificado con la mezcla maestra genotipo GI y el GII NoV ARN con la mezcla de determinación del genotipo GII maestro.
  2. Pipetear la GI y GII NoV genotipo maestro de las mezclas de acuerdo a la Tabla 4. Primers GI SKF / SKR y G2 SKF / SKR se enumeran en la Tabla 5.
  3. Alícuota de 45 l de la mezcla maestra adecuada para tubos de 0,2 mL de reacción.
  4. Añadir 5 l de agua tratada con DEPC a cada tubo de control negativo, y 5 l de pre-seleccionados, nov (GI y / o GII) ARN positivos en el tubo de reacción correspondiente.
  5. Ejecutar 50 reacciones l utilizando el perfil térmico en la Tabla 6.
  6. Enviar PCR productos conteNing al menos 100 ng / l de la región amplificada a cápsida Macrogen Compañía para la purificación y secuenciación. (9700 Gran Séneca carretera. Rockville, MD 20850 y $ 10 por muestra por secuenciación).

9. Los resultados representativos

Figura 1
La figura 1 muestra los resultados representativos de la TaqMan One-Step RT-PCR cuando se utiliza para el ARN de ensayo extraídas de muestras de heces diarreicas de los niños. El ciclo umbral (Ct) de una muestra positiva se fijó en menor o igual a 37 Ct para el GI y GII 39 para Ct. El CT-valores para los controles positivos se encontraron en menos de 27 y 18 de la unión ORF1-ORF2 para el GI y GII, respectivamente. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 2
Figura 2

Master Mix Concentración final Volumen (l)
H 2 0 PCR 2,875
Quantitect RT-PCR Master Mix 1x 6,250
RT Mix 1x 0,125
50 micras Cog R imprimación 1 mM 0,250
50 micras de imprimación Cog F 1mM 0,250
10 mM de la sonda del anillo 1 mM 0.125/0.250 *
10,00

* 0,250 l de cada sonda se utilizó para las pruebas de IG, mientras que 0,125 l de cada sonda se utilizó para las pruebas de la GII.

Tabla 1. Qiagen Quantitect mezcla maestra para la investigación GI y GII (Trujillo et al., 2006). 7

Nombre Geno-grupo Utilizar Secuencia (5 'a 3')
Cog 1R GI Cartilla CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C
Cog 1F GI Cartilla CGY TGG ATG CGN TTY CAT GA
Cog 2R GII Cartilla TCG ACG CCA TCA TCT ACA TTC
Cog 2F GII Cartilla CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG
Anillo de 1A GI Sonda FAM-AGA TYG CGA TCY CCT GTC CA-BHQ-1
Anillo 1B GI Sonda FAM-AGA TCG CGG CCT TCT GTC CA-BHQ-1
RING2-TP GII Sonda FAM-TGG GAG GAT GGC CGC AAT CT-BHQ-1

Tabla 2. Primer y oligonucleótidos sonda utilizada para la cuantitativa en tiempo real RT-PCR para genogrupos I, II (Kageyama et al.2003) 8.

Paso Temperatura (° C) Tiempo (min)
1 50 30:00 síntesis de ADNc
2 95 15:00 HotStart Taq activación de la polimerasa
3 95 Doce y quince
60 01:00 Ciclos de 45X

Mesa3. El perfil térmico de un solo paso Taqman en tiempo real RT-PCR (Trujillo et al., 2006). 7

Master Mix Concentración final Volumen (l)
H 2 0 PCR 29,50
5X Qiagen RT-PCR Buffer 1x 10,00
10 mM dNTP Mix 0,4 mM 2,00
Mezcla de enzimas 2,00
40 U / l ARNsin 20 U / l 0,50
10 mM de SKF 0.1 mM 0,50
10 mM SKR 0.1 mM 0,50
45,00

Tabla 4. Qiagen One-Step RT-PCR Master Mix para la determinación del genotipo GI y GII.

Nombre Geno-grupo Utilizar Secuencia (5 'a 3')
G1SKF GI Cartilla 5'-CTG CCC GAA TTY GTA AAT GA - 3
G1SKR GI Cartilla 5'-CCA CAC CAR CCA TTR Un TAC - '3
G2SKF GII Cartilla 5'-GGG AGG CNT GCG ATC ACG A - 3
G2SKR GII Cartilla 5'-CCR CCN GCA TRH CCR TTR TA CAT-3

Los cebadores Tabla 5. Utilizado para la amplificación de la Región C de la región de la cápside (Kojima et al., 2002). 5

Paso Temperatura (° C) Tiempo (min)
1 60 30:00 síntesis de ADNc
2 96 15:00 HotStart Taq activación de la polimerasa
3 94 00:30
52 01:00 Ciclos de 40X
72 Doce y media
4 72 10:00 Recocido

Tabla 6. El perfil térmico para Taqman One-Step RT-PCR.

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Discussion

Uso de la económica en casa-método para aislar ácido nucleico a partir de muestras de heces, se obtiene resultados iguales como con el kit comercial QIAmp viral de RNA de Qiagen, y junto con la TaqMan RT-PCR desarrollado en nuestro laboratorio que puede detectar una amplia gama de NoV genotipos pertenecientes al GI y GII genogrupo. Una publicación reciente del protocolo de la región C informaron las tasas de genotipado de 78% 6. Desde la diversidad de las cepas contemporáneas NoV ha ido en aumento durante los años anteriores, la tasa de éxito dependerá de los desajustes de los cebadores en la región C de las muestras que se están probando. El ensayo es útil para diagnóstico de rutina, ya que elimina después de la amplificación de procesamiento del producto, acortando así el tiempo de vuelta 7. Aparte de diagnóstico, este protocolo también se puede utilizar para aclarar la epidemiología de las infecciones por NoV, por lo tanto ser útil para el control de la salud pública de esta enfermedad.

Cuando se ejecuta la proyección de RT-PCR, de control negativo (NC), las reacciones de los primers / sonda no debe exhibir curvas de fluorescencia de crecimiento que cruzan la línea del umbral. Si se produce un falso positivo con uno o más de las reacciones del conjunto de cebadores / sondas de Carolina del Norte, contaminación de la muestra puede haber ocurrido, y en todos estos casos, toda la carrera fue invalidado y se repite con una adhesión más estricta a las directrices.

Cruce de reacción para la detección de RT-PCR fue probada usando la GI y GII normas positivas proporcionada por los CDC. No hay reacción cruzada se observó entre los cebadores y sondas con GI GII ARN y viceversa. La reproducibilidad de la detección de RT-PCR fue más alto que los valores de Ct similares para carreras repetidas, con ARN de los controles positivos. ARN de muestras de heces niños que se habían encontrado positivo para el NoV y tenía Ct valores entre 20 y 33, donde posteriormente amplificado por la RT-PCR convencional y se envía para el genotipado. Cinco muestras positivas con CT-valores entre 35 y 38 no fueron enviados a la secuencialCing como la carga viral, donde resultó ser demasiado bajo para la amplificación posterior usando la RT-PCR convencional.

Actualmente, la disponibilidad de diagnóstico norovirus es limitada debido a los métodos no son capaces de ser implementado en los laboratorios locales con sólo equipo básico. Esto retrasa el diagnóstico y tratamiento en los casos de diarrea individuales o en brotes. El método kit es fiable y rápido todavía requiere una cantidad significativa de tiempo y recursos para transportar materiales en los países. El costo es tres veces mayor que la de nuestro método. Hemos demostrado un método auxiliar utilizando fácilmente disponibles en el país los reactivos para la detección del NoV que es igualmente sencillo, rápido y fiable. Este método rentable evita la dependencia de los materiales comprados en el extranjero, los problemas de la normativa internacional e intra-nacional en su transporte, que en última instancia, conducen a un diagnóstico más accesible y rápido tratamiento de una de las causas virales más comunes de gastroenteritis en el capítuloildren.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer al Centro de Calicivirus Laboratorio Nacional para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) para el tipo de regalo algunos aspectos positivos estándar y el control de Nov, y los Laboratorios de la Escuela de Salud Pública de Johns Hopkins para la prestación de los reactivos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Guanidine isothiocyanate Sigma-Adrich G9277
Tris HCL Sigma-Aldrich T5941
EDTA Sigma-Aldrich E5134
Silica Sigma-Aldrich S5631
Triton X 100 VWR 14530
Diethylpyrocarbonate Sigma-Aldrich D-5758
QIAamp viral RNA Mini Kit (250) Qiagen 52906
QuantiTec Probe RT-PCR kit (200) Qiagen 204443
Qiagen One Step RT-PCR Kit (200) Qiagen 210212
Rnase Inhibitor 2000 units A. Biosystems N808-0119 2000 unids/vial
Non-Stick Rnae-free Microfuge Tubes Ambion AM12450
UltraPure Agarose 1000 Invitrogen 16550-100

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References

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Comments

1 Comment

  1. thanks a lot

    Reply
    Posted by: mohamed h.
    May 4, 2015 - 5:20 PM

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