Visualisatie van Caenorhabditis elegans Cuticle structuren met behulp van de lipofiele vitale kleurstof, DII

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Wij presenteren een methode om cuticula te visualiseren in levende

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Schultz, R. D., Gumienny, T. L. Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI. J. Vis. Exp. (59), e3362, doi:10.3791/3362 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De cuticula van C. elegans is een zeer resistent structuur die de buitenkant van het dier 1-4 omringt. De nagelriem beschermt niet alleen het dier uit de omgeving, maar ook bepalend voor lichaamsvorm en speelt een rol in de motiliteit 4-6. Meerdere lagen afgescheiden door epidermale cellen bestaan ​​uit de nagelriem, waaronder een buitenste lipide laag 7.

Omtrek ribbels in de cuticula genoemd annuli patroon de lengte van het dier en zijn aanwezig tijdens alle stadia van ontwikkeling 8. Alae zijn richels in de lengterichting die aanwezig zijn tijdens specifieke stadia van ontwikkeling, waaronder L1, Dauer, en volwassen stadia 2,9. Mutaties in genen die cuticulair collageen organisatie beïnvloeden kan veranderen cuticulair structuur en dierlijk lichaam morfologie 5,6,10,11. Terwijl cuticulair imaging met behulp van microscopie compound met DIC optiek is het mogelijk, de huidige methoden die de aandacht vestigen cuticulair structuren omvatten fluorescentielampencent transgenexpressie 12, antilichaam vlekken 13, en elektronenmicroscopie 1. Gelabeld tarwekiemen agglutinine (WGA) is ook gebruikt om cuticulair glycoproteïnen visualiseren, maar is beperkt in het oplossen van fijnere structuren cuticulair 14. Kleuring van cuticulair oppervlak met behulp van fluorescerende kleurstof is waargenomen, maar nooit in detail gekarakteriseerd 15. Wij presenteren een methode om cuticula te visualiseren in levende C. elegans het gebruik van de rode fluorescerende kleurstof lipofiele DII (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchloraat), die veel gebruikt wordt in C. elegans om milieuvriendelijke blootgesteld neuronen te visualiseren. Dit geoptimaliseerde protocol voor DII kleuring is een eenvoudige, robuuste methode voor hoge resolutie fluorescentie visualisatie van annuli, alae, vulva, mannelijke staart, staart en hermafrodiete piek in de C. elegans.

Protocol

1. Voorbereiding van de Dii vlek

  1. Bereid een voorraad oplossing van 20 mg / ml DII (Biotium, Inc, Hayward, CA) in DMF. Dii is licht gevoelig, dus bescherming tegen licht DII door inpakken in folie.
  2. Maak een werkverdunning van Dii door het toevoegen van 0,6 ul DII voorraad 399,4 pi M9 voor elke populatie. Dit moet een laatste werkverdunning van 30 ug / ml DII in M9. Dit kan worden opgeschaald voor het beitsen van verschillende bevolkingsgroepen tegelijk. Shield Dii van het licht door het wikkelen van de buis (s) in folie.

2. Voorbereiding van de nematoden

  1. Gebruik een 60 mm plaat met een bevolking van niet-verontreinigd nematoden. Wassen dieren uit plaat met behulp van een oplossing van 0,5% Triton X-100 in M9 buffer onder voorzichtig schudden vloeistof in een cirkelvormige beweging over het oppervlak van de plaat om alle larven en volwassen dieren los te maken. Transfer wassen in een steriele 1,5 ml buis.
  2. Onmiddellijk spin down van de dieren bij 2000 omwentelingen per minuut gedurende 30 sec. Verwijder en gooi zoveel mogelijk supernatant mogelijk zonder de massa van de dieren op de bodem van de buis.
  3. Van de resterende Triton X-100 te verminderen, afspoelen dieren met behulp van M9 buffer, spin en verwijder supernatant. Herhaal deze stap.
  4. Voeg 400 ul van werken Dii oplossing in M9 aan de buis en vortex kort voor dieren opnieuw in suspensie in de oplossing.
  5. Schud buis bij 20 ° C horizontaal voor 3 uur bij 350 rpm in een licht-beschermde omgeving. Indien gewenst, kunnen dieren worden geïncubeerd tot 16 uur voor kleuring.
  6. Om de hoeveelheid ongebonden kleurstof, spin down van de dieren bij 2000 rpm voor 20 sec. Verwijder en gooi zoveel supernatant mogelijk zonder het verstoren van de massa van de dieren.
  7. Resuspendeer dieren in 400 ul buffer M9 en giet vloeistof op een bacterie-vrije deel van een NGM agarplaat bezaaid met OP50 E. coli. Toestaan ​​dat dieren ten minste 30 minuten te herstellen. Tijdens het herstel tijd dat de dieren moeten weg kruipen van de DII vlekken vloeistof en op het eten. Deze stapvermindert de achtergrond fluorescentie van gratis DII.

3. Montage en het observeren van exemplaren

  1. Smelt 4% agar-agar in water met behulp van een autoclaaf of een magnetron.
  2. Herbruikbare spacers, die kan worden gebruikt om een ​​uniforme dikte van de agar pad te verzekeren, door de gelaagdheid twee stukken van lab tape op een glasplaatje. Maak twee spacer dia's in totaal.
  3. Schik een schoon glasplaatje tussen twee spacer dia's. Pipet ongeveer 150 pi (vier druppels) van gesmolten 4% agar op het midden van de schone glaasje. Snel dekking van de gesmolten agar met behulp van een extra dia naar een agar pad te vormen. Verwijder voorzichtig het deksel glijden, waardoor het pad gericht op de top van de montage dia.
  4. Pipetteer ongeveer 5 microliter van de nematode verdoving (100 uM - 1 mM levamisole, bijvoorbeeld) op het pad.
  5. Mount 8 tot 12 dieren in de verdoving en bedek het met een microscoop dekglaasje aan.
  6. Observeer dieren met behulp van een verbinding of confocale microscoop voorzien van ten minste een 40x objectivering ve en een DsRed / TRITC (of een ander compatibel) filter. De fluorescentie excitatie maximum van Dii is 549 nm en de emissie maximum is 565 nm voor gebonden kleurstof (Biotium, Inc, Hayward, CA).

4. Representatieve resultaten

DII vlekken van de cuticula van wild-type en mutant C. elegans. De cuticulair oppervlak bevat annuli van elkaar gescheiden door cirkelvormige groeven en in sommige stadia, richels in de lengterichting genoemd alae. Elke ontwikkelingsfase heeft cuticulair structuren met verschillende composities 2. Ribbels of groeven van beide neusvleugels en annuli fluorescent vlek, afhankelijk van de samenstelling van het oppervlak, door larven en volwassen stadia en goed zichtbaar blijven tot een dag na het herstel van het gebruik van deze methode. Achtergrond fluorescerende spikkels zijn soms waargenomen (figuren 2F, G), maar niet routinematig (Figuur 1, Figuur 2A-E, H, I). Alle beelden zijn gemaakt met draaiende schijf confocale of, indien opgemerkt, groothoek (WF) verbinding microscopie.

ENT "> Figuur 1
Figuur 1. Dii vlekken nagelriem en het milieu worden blootgesteld neuronen. L2 stadium dier. 630x vergroting. Mosaic image onderdelen werden gevangen met behulp van iVision-Mac-software (BioVision Technologies, Exton, PA). Beelden werden verbonden met behulp van Adobe Photoshop CS3 (Adobe Systems, Inc, San Jose, CA). Schaalbalk = 10 micrometer. Dii ook fluorescent vlekken amphid en fasmide sensorische neuronen in de kop en de staart respectievelijk (pijlen geven sommige).

Figuur 2
Figuur 2. Dii fluorescent vlekken C. elegans cuticula in alle fasen van post-embryonale ontwikkeling. 630x vergroting. Schaalbalk = 10 micrometer. Kleuring van wild-type dieren in A) L1, B) L2, C) Dauer; D) L3, E), L4, en F) volwassen stadia. De neusvleugels en de ringvormige randen zijn fluorescerend gekleurd in L1 en Dauer dieren (A, C). Dii vlekken ringvormige randen in L2 dieren(B). Ringvormige groeven vlek in L3 en L4 dieren (D, E). De groeven van de neusvleugels en annuli zijn gekleurd in volwassen dieren (FH). Alae zijn samengesteld uit twee, vijf, of drie ribbels (in L1, Dauer of volwassen dieren, respectievelijk) dat de lengte van het dier (pijlen) 16 draaien. Annuli creëren omtrek bergkammen rond het dier (pijlpunten, F en J). De cuticula van volwassen dieren mutant weer matig cuticulair organisatie defecten (GH). G) Ridges van alae zijn discontinue (WF). H) restembryo alae ruggen zijn versmolten en vertakte en gespleten (WF). Collageen gen mutanten vertonen alae en ringvormige organisatie defecten (IJ). I) In transgene dieren tot overexpressie pRF4 (rol-6 (su1006)), kammen van alae liggen in een hoek aan de lengte van het dier. J) Annuli in transgene dieren tot overexpressie pRF4 (rol-6 (su1006)) tonen een onregelmatig patroon.

Figuur 3
Figuur 3. External morfologische structuren worden verlicht door Dii vlekken. 630x vergroting. Schaal bars = 10 micrometer. Dii belicht ook andere uiterlijke kenmerken, waaronder A) volwassen hermafrodiet vulva, B) volwassen man staart stralen en ventilator, en C) hermafrodiet staart spike (gevorkte in deze mutant achtergrond).

Figuur 4
Figuur 4. Cuticle duurt langer om met Dii vlek dan het milieu worden blootgesteld neuronen. 630x vergroting. Schaalbalk = 10 micrometer. Na twee uur kleuring, zijn amphid (niet afgebeeld) en fasmide sensorische neuronen (pijlen) voldoende gekleurd. In tegenstelling, de cuticula van de jongere dieren is slechts gedeeltelijk gekleurd in patches (pijlpunt).

Wassen Stain oplossing (+ DII) Incubatietijd Cuticle gebrandschilderde
M9 + 0,5% TrIton X-100 M9 + 0,5% Triton X-100 2 uur geen
M9 + 0,5% Triton X-100 M9 + 0,5% Triton X-100 3 uur geen
M9 + 0,5% Triton X-100 M9 2 uur partieel
M9 + 0,5% Triton X-100 M9 3 uur ja
M9 + 0,5% Triton X-100 H 2 0 2 uur partieel
M9 + 0,5% Triton X-100 H 2 0 3 uur ja

Tabel 1. Cuticulair vlekken onder verschillende omstandigheden. Verschillende incubatie-oplossingen en-tijden werden getest om cuticulair vlekken te optimaliseren bij dieren. H 2 0, steriel gedestilleerd water. Gedeeltelijke vlekken geeft fragmentarisch kleuring van larvale cuticula (figuur 4), hoewel volwassen cuticula vlekken consistently.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De Dii kleuringsmethode hier gepresenteerde zorgt voor een relatief snelle en gemakkelijke manier om de cuticula in C. elegans te visualiseren. Door herbestemming en optimaliseren van een methode die vaak wordt gebruikt om de afbeelding milieuvriendelijke blootgesteld sensorische neuronen 15,17, kan DII worden gebruikt om de fluorescent vlek zowel alae en ringvormige structuren (figuren 1 en 2), evenals de vulva, mannelijke staart, staart en hermafrodiete spike (Figuur 3). We hebben geconstateerd dat de incubatietijd oplossing en de tijd invloed hebben op de mogelijkheid van DII consequent de cuticula (tabel 1, figuur 4) vlek. De methode voor het DII kleuren van het milieu worden blootgesteld neuronen maakt gebruik van een twee-uur incubatietijd in M9 met Triton X-100 15. Een eerste wassen van M9 met de oppervlakte Triton X-100 helpt bij het verwijderen verontreinigingen uit de cuticulair oppervlak en voorkomt dat de dieren tegen klonteren. Echter, het incuberen van de dieren drie uur in een kleuroplossing in dezelfde buffer voorkomt dat de kleurstof van het kleuren van de cuticula (tabel 1).Dit kan worden veroorzaakt door lipiden op de nematode oppervlak wordt ontdaan door de langere behandeling in het reinigingsmiddel. Incubatie van de dieren in het water met DII vlekken de nagelriem, wat aangeeft dat de M9 zout oplossing niet nodig is voor DII kleuring van cuticula. Hoewel het een water-gebaseerd protocol wordt aanbevolen voor neuronale DII vlekken 15, vinden we dat de dieren behandeld worden op deze manier vaak ongezond verschijnen. Wassen dieren kort in 0,5% Triton X-100 in M9, gevolgd door een drie-uur incubatie in kleuroplossing gemaakt met M9, biedt consistente kleuren van cuticulair structuren en onderhoudt het welzijn van de dieren.

Dieren kunnen worden gered nadat constatering en onderhouden, waardoor directe downstream-analyses. Deze methode is een handig hulpmiddel dat gebruikt kan worden in tal van studies, waaronder, maar niet beperkt tot, cuticulair secretie en organisatie, epidermale cel ontwikkeling, heterochronic gen paden, en nematoden evolutie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

We hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij willen S. Taneja-Bageshwar, K. Beifuss, S. Kedroske, en HC bedanken. Hsiao voor nuttige discussies. Dit werk werd gefinancierd door start-up middelen van de TAMHSC Departement Moleculaire en Cellulaire Geneeskunde. De verbinding reikwijdte en de draaiende schijf werden aangekocht met geld van de afdeling en de TAMHSC bureau van de decaan. Sommige stammen werden verstrekt door de Caenorhabditis Genetics Center, dat wordt gefinancierd door het National Center for Research Resources. pRF4 (rol-6 (su1006)) was een geschenk van A. Fire.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DiI (1,1’-Dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) Biotium, Inc. 60010 Stock dilution:
20 mg/mL in DMF
working dilution: 30 mg/mL
DMF (Dimethylformamide) Sigma-Aldrich D4551
Triton X-100 (Octylphenoxypolyethoxyethanol) VWR international EM-9410
M9 (22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1mM MgSO4)
NGM (Nematode growth medium) IPM Scientific, Inc. 11006-501 Can be prepared following NGM agar protocol18
Agar-agar EMD Millipore 1.01614 4% in water
Levamisole (Levamisole hydrochloride) Sigma-Aldrich 31742 100 μM - 1 mM levamisole as required
Microscope slides VWR international 16005-106
Microscope cover glasses VWR international 16004-302
Compound scope Carl Zeiss, Inc. A1m Use objectives to match the needs of the experiment
TRITC or other compatible filter Chroma Technology Corp. 49005 ET - DSRed (TRITC/Cy3) sputtered filter set

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cox, G. N., Kusch, M., Edgar, R. S. Cuticle of Caenorhabditis elegans: its isolation and partial characterization. The Journal of Cell Biology. 90, 7-17 (1981).
  2. Cox, G. N., Staprans, S., Edgar, R. S. The cuticle of Caenorhabditis elegans. II. Stage-specific changes in ultrastructure and protein composition during postembryonic development. Dev. Biol. 86, 456-470 (1981).
  3. Hall, D., Altun, Z. C. elegans Atlas. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
  4. Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. The C. elegans Research Community. WormBook. (2007).
  5. Kramer, J. M., Johnson, J. J., Edgar, R. S., Basch, C., Roberts, S. The sqt-1 gene of C. elegans encodes a collagen critical for organismal morphogenesis. Cell. 55, 555-565 (1988).
  6. Mende, N. von, Bird, D. M., Albert, P. S., Riddle, D. L. dpy-13: a nematode collagen gene that affects body shape. Cell. 55, 567-576 (1988).
  7. Blaxter, M. L. Cuticle surface proteins of wild type and mutant Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 268, 6600-6609 (1993).
  8. Costa, M., Draper, B. W., Priess, J. R. The role of actin filaments in patterning the Caenorhabditis elegans cuticle. Dev. Biol. 184, 373-384 (1997).
  9. Sapio, M. R., Hilliard, M. A., Cermola, M., Favre, R., Bazzicalupo, P. The Zona Pellucida domain containing proteins, CUT-1, CUT-3 and CUT-5, play essential roles in the development of the larval alae in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol.. 282, 231-245 (2005).
  10. Johnstone, I. L. Cuticle collagen genes. Expression in Caenorhabditis elegans. Trends Genet. 16, 21-27 (2000).
  11. Kramer, J. M., French, R. P., Park, E. C., Johnson, J. J. The Caenorhabditis elegans rol-6 gene, which interacts with the sqt-1 collagen gene to determine organismal morphology, encodes a collagen. Mol. Cell Biol. 10, 2081-2089 (1990).
  12. Thein, M. C. Caenorhabditis elegans exoskeleton collagen COL-19: an adult-specific marker for collagen modification and assembly, and the analysis of organismal morphology. Dev. Dyn. 226, 523-539 (2003).
  13. McMahon, L., Muriel, J. M., Roberts, B., Quinn, M., Johnstone, I. L. Two sets of interacting collagens form functionally distinct substructures within a Caenorhabditis elegans extracellular matrix. Molecular Biology of the Cell. 14, 1366-1378 (2003).
  14. Link, C. D., Ehrenfels, C. W., Wood, W. B. Mutant expression of male copulatory bursa surface markers in Caenorhabditis elegans. Development. 103, 485-495 (1988).
  15. Tong, Y. G., Burglin, T. R. Conditions for dye-filling of sensory neurons in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. Methods. 188, 58-61 (2010).
  16. Singh, R. N., Sulston, J. E. Some observations on moulting in Caenorhabditis elegans. Nematologica. 24, 63-71 (1978).
  17. Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 148, 187-200 (1998).
  18. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics