Glial प्रतिबंधित व्यापारियों की E13 चूहों से व्युत्पत्ति

Neuroscience
 

Summary

इस प्रोटोकॉल भ्रूण रीढ़ की हड्डी डोरियों से Glial प्रतिबंधित व्यापारियों की व्युत्पत्ति की रूपरेखा और या तो प्रत्यारोपण के लिए या oligodendrocytic वंश के अध्ययन के लिए इन विट्रो में बनाए रखा है.

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Phillips, A. W., Falahati, S., DeSilva, R., Shats, I., Marx, J., Arauz, E., Kerr, D. A., Rothstein, J. D., Johnston, M. V., Fatemi, A. Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice. J. Vis. Exp. (64), e3462, doi:10.3791/3462 (2012).

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Abstract

यह glial E13 माउस भ्रूण की रीढ़ की हड्डी से प्रतिबंधित अग्रदूत साबित कोशिकाओं (जीआरपी) की व्युत्पत्ति के लिए एक प्रोटोकॉल है. इन कोशिकाओं oligodendrocytic सेल वंश के भीतर जल्दी व्यापारियों रहे हैं. हाल ही में, इन कोशिकाओं को मज़बूत कर देनेवाला सफेद बात रोगों में उपचार के लिए संभावित स्रोत के रूप में अध्ययन किया गया है. Periventricular leukomalacia (PVL) गैर आनुवंशिक बचपन में सफेद पदार्थ की बीमारी का प्रमुख कारण है और बहुत समय से पहले शिशुओं के 50% को प्रभावित करता है. डेटा विकासशील मस्तिष्क hypoxia-ischemia के लिए, oxidative तनाव और excitotoxicity कि चुनिंदा लक्ष्य नवजात सफेद बात के बढ़ संवेदनशीलता का सुझाव देते हैं. Glial प्रतिबंधित (जीआरपी) व्यापारियों, oligodendrocyte पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (OPC) और अपरिपक्व oligodendrocytes (preOL) PVL के विकास में प्रमुख खिलाड़ियों को लगता है और पढ़ाई जारी रखने के विषय हैं. इसके अलावा, पिछले अध्ययनों की पहचान की है CNS ऊतक के एक सबसेट है कि संवेदनशीलता बढ़ गया है के रूप में excitotoxicity ग्लूटामेटइस संवेदनशीलता के लिए एक विकास पैटर्न के रूप में अच्छी तरह से. हमारी प्रयोगशाला वर्तमान विकास की जीआरपी स्तर पर PVL और उपयोग कोशिकाओं में oligodendrocyte progenitors की भूमिका की जांच कर रही है. हम कई प्रयोगात्मक मानदंड में इन व्युत्पन्न जीआरपी कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए अपने PVL साथ लगातार तनाव का चयन करने के लिए प्रतिक्रिया परीक्षण. जीआरपी कोशिकाओं OPCs और preOL में इन विट्रो में माउस PVL मॉडलों के साथ और hypoxia-ischemia सहित PVL तरह के अपमान के इन विट्रो मॉडल में प्रत्यारोपण के प्रयोगों के लिए चालाकी से किया जा सकता है. संवर्धित कोशिकाओं का उपयोग करते हुए और इन विट्रो अध्ययन में प्रयोगों जो डेटा की व्याख्या की सुविधा के बीच परिवर्तनशीलता कम होगा. संवर्धित कोशिकाओं भी जीआरपी आबादी के संवर्धन के लिए, जबकि गैर - जीआरपी phenotype की कोशिकाओं contaminating के प्रभाव को न्यूनतम करने की अनुमति देता है.

Protocol

परिचय

इस प्रोटोकॉल में हम बताते हैं कैसे निकालने के लिए, का चयन करने के लिए और प्लेट glial E13 माउस भ्रूण की रीढ़ की हड्डी से प्रतिबंधित अग्रदूत साबित कोशिकाओं (जीआरपी). इन कोशिकाओं को oligodendrocytic और astrocytic सेल प्रजातियों के भीतर जल्दी व्यापारियों और A2B5 की उनकी अभिव्यक्ति के द्वारा परिभाषित कर रहे हैं. जीआरपी मध्यम FGF-2 के साथ पूरक में, A2B5 + GRPS जल्दी oligodendrocytic वंश मार्करों PDGFαR और NG2 1,2 व्यक्त शुरू हो जाएगा. इन oligodendrocyte वंश कोशिकाओं अलग प्ररूपी चरणों, उनमें से प्रत्येक morphological परिवर्तन, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विशिष्ट विकास के चरणों के लिए मार्करों की अभिव्यक्ति द्वारा विशेषता के एक श्रृंखला के माध्यम से गुजरती हैं.

इन अग्रदूत साबित कोशिकाओं वर्तमान में केंद्रीय तंत्रिका तंत्र सफेद बात के विकारों में सेल आधारित चिकित्सकीय दृष्टिकोण सहित कई काठिन्य, leukodystrophies, और periventricular (PVL) leukomalacia 3,4,5,6, के लिए एक संभावित स्रोत के रूप में अध्ययन किया जा रहा है 6,7,8,9 मॉडल में सफल remyelination की सूचना है. इन glial कोशिकाओं अग्रदूत अन्य रीढ़ की हड्डी की चोट और amyotrophic पार्श्व 10,11,12,13 काठिन्य के रूप में सफेद पदार्थ रोग मॉडल के अध्ययन में भी इस्तेमाल किया गया है.

हमारी प्रयोगशाला जल्दी प्रसव के बाद माउस hypoxia-ischemia के मॉडल के साथ जो हम PVL, मस्तिष्क पक्षाघात 14,15,16 का प्रमुख कारण में एक सबल दृष्टिकोण के रूप में जीआरपी कोशिकाओं को व्युत्पन्न इन रीढ़ की हड्डी के प्रभाव का मूल्यांकन कर रहे हैं विकसित किया गया है. वहाँ भी एक कृंतक व्युत्पन्न मस्तिष्क OPC के मॉडल है कि व्यापक रूप से सफेद पदार्थ की चोट के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है के बाद से जीआरपी कोशिकाओं के astrocytic 17 मार्ग में अंतर की प्रवृत्ति है. OPC के फेनोटाइप पहले से ही oligodendrocyte वंश मार्ग, एक घटना है है कि irreve लगता प्रवेश किया हैrsible. हालांकि, हम GRPS और संभवतः भी E10.5 पर व्युत्पन्न NEPs सहित oligodendrocyte progenitors के एक व्यापक स्पेक्ट्रम के जवाब का आकलन करने में रुचि रखते हैं. इस कारण से हम रीढ़ की हड्डी में हमारे काम के लिए व्युत्पन्न जीआरपी मॉडल को अपनाया है.

GRPS का उपयोग करने के लिए सेल प्रतिस्थापन के लिए इसके अलावा, जंगली और सफेद पदार्थ रोगों के प्रकार ट्रांसजेनिक कृंतक मॉडल से इन कोशिकाओं की व्युत्पत्ति glial भेदभाव में इन विट्रो सेटिंग में एक सामान्य और रोग की शर्तों के तहत आगे के अध्ययन की अनुमति देता है. पिछला प्रकाशन चयनात्मक oligodendrocytic वंश अग्रदूत साबित कोशिकाओं की परिपक्वता पर निर्भर ग्लूटामेट excitotoxicity है, oxidative तनाव, और चुनें neuroinflammation 18,19 में फंसा कारकों जैसे विभिन्न बाह्य तनाव के लिए जोखिम का सबूत दिखा. हमारे अध्ययन के इन सफेद बात चोटों के विकास के पीछे सेलुलर और आणविक तंत्र को समझने पर ध्यान केंद्रित किया है, में कोशिकाओं की संवेदनशीलता का मूल्यांकनoligodendrocyte वंश स्पेक्ट्रम के रूप में अच्छी तरह से ख्यात चिकित्सकीय दृष्टिकोण का विश्लेषण के रूप में अपमान के लिए.

सामग्री

सभी जानवरों को शामिल प्रक्रियाओं PHS नीति और JHU IACUC के अनुरूप हैं. सभी प्रक्रियाओं एक लामिना का प्रवाह हुड में प्रदर्शन किया जाना चाहिए क्रम में सड़न रोकनेवाला स्थिति बनाए रखने के लिए. सामान्यतः dissections एक क्षैतिज प्रवाह हुड में और एक ऊर्ध्वाधर प्रवाह हुड में इन विट्रो काम में प्रदर्शन कर रहे हैं. सभी मीडिया dissections के दौरान ठंड का इस्तेमाल किया. हमारे अध्ययन में इस्तेमाल चूहों एक जंगली प्रकार CD-1 तनाव और एक C57/BL6 पृष्ठभूमि में एक ट्रांसजेनिक GFP हैं. एक CD-1 माउस बांध आमतौर पर पैदावार 10 से अधिक भ्रूण जो बीज बोतल T25 1-2 करने के लिए पर्याप्त हैं. आमतौर पर, दो बांधों को एक बार और भ्रूण रीढ़ की हड्डी डोरियों जमा और बांध प्रति 1 T25 कुप्पी में चढ़ाया में बलिदान कर रहे हैं. एक बार कोशिकाओं को व्युत्पन्न किया गया है कि वे और विस्तारित किया जा सकता है और बाद के अध्ययन के लिए इन विट्रो में विशेषता है.

1. मीडिया और बोतल की तैयारी

  • जीआरपी स्टॉक, N2 (100x, Invitrogen) की आपूर्ति करता है और गोजातीय सीरम albumin (BSA, 0.5% w / वी) DMEM / F12 (Invitrogen) 01:01 B27-Invitrogen (50x): मध्यम विच्छेदन के माध्यम के रूप में इस्तेमाल किया जाता है.
  • हदबंदी मध्यम: विच्छेदन माध्यम के रूप में एक ही.
  • संस्कृति मध्यम: जीआरपी स्टॉक मध्यम + FGF-2 (10-20 एनजी / मिली, Invitrogen) और हेपरिन (1 μg / मिलीलीटर, सिग्मा).
  • / PLL के laminin लेपित 75 2 सेमी या 25 सेमी 2 बोतल (T75 या T25).
  • आसुत एच 2 हे, 1 घंटे के लिए फिर से aspirated को 37 ° C पर incubated, टिशू कल्चर बोतल (75 2 सेमी, फाल्कन) पाली एल lysine 15-20μg/ml (सिग्मा पीएलएल) के साथ लेपित रहे थे. बोतल पीबीएस तो 15-20 μg / मिलीलीटर पीबीएस में laminin (सिग्मा) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए फिर से aspirated लेपित और ताजा पीबीएस या मीडिया जब तक कोशिकाओं को चढ़ाया बनने के लिए तैयार हैं के साथ 1X धो रहे हैं. कोटिंग के बाद, बोतल के लिए सूखी करने की अनुमति कभी नहीं चाहिए, लेकिन 4 में पीबीएस या मीडिया में रखा जा सकता ° उपयोग करने से पहले संक्षिप्त अवधि के लिए सी.

2. उपकरण और अन्य एमaterial

  • 4 प्रति बांध:: 3 विच्छेदन के लिए पेट्री डिश (75 मिमी), काटा रीढ़ की हड्डी डोरियों को इकट्ठा करने के लिए एक 20 मिमी पकवान पेट्री डिश.
  • बड़े (43 मिमी ऑपरेटिंग कैंची, Roboz) कैंची और बांध पेट खोलने के लिए ऊतक संदंश.
  • गर्भाशय विदारक और भ्रूण (15 मिमी माइक्रो विदारक कैंची, Roboz) को हटाने के लिए लघु कैंची.
  • सूक्ष्म विदारक वसंत कैंची (6 मिमी) fetuses की रीढ़ की हड्डी के टुकड़े करना करने के लिए.
  • माइक्रो सर्जरी के दौरान बांध और भ्रूण शरीर प्रस्तोता और बाद में एक बार उजागर रीढ़ की हड्डी की हड्डी को हटाने के लिए angled संदंश विदारक.
  • 40 या 70 सुक्ष्ममापी सेल छलनी चढ़ाना पहले सेल मलबे को हटाने के लिए.
  • 0.05% trypsin 37 सी. ° prewarmed
  • 10 मिलीग्राम / एमएल 1 DNase (सिग्मा) के, एक 100x स्टॉक के रूप में तैयार (1 जी / मिली).
  • पशु लाशों के लिए जैव खतरा बैग.
  • प्रसंस्करण के लिए 15 और 50 मिलीग्राम अपकेंद्रित्र ट्यूबों रीढ़ की हड्डी डोरियों निकाले.

3. समय पीआर निर्धारणegnancy

गर्भवती माउस बांधों या तो भ्रूण दिन E12 या E13 भ्रूण के विकास या गर्भावस्था के घर में निर्धारित की पर वितरण निर्दिष्ट वाणिज्यिक स्रोतों से आदेश दिया जाता है. संक्षेप में, दो महिलाओं के साथ देर से दोपहर में एक पुरुष के साथ रखा जाता है और रात में एक साथ छोड़ दिया. अगले दिन महिलाओं vaginally स्थित बलगम प्लग की उपस्थिति के लिए मनाया जाता है. बलगम प्लग केवल एक संकेत है कि संभोग हुई तो जानवरों बाद वजन में वृद्धि की दर पर नजर रखने के लिए दैनिक तौल रहे है. दिन बलगम प्लग भ्रूण एक दिन (E1) मनाया जाता है के रूप में परिभाषित किया गया है.

4. ऊतक व्युत्पत्ति

  1. एक क्षैतिज प्रवाह हुड के तहत काम करने के लिए सड़न रोकनेवाला स्थिति बनाए रखने के.
  2. नीचे और 70% इथेनॉल के साथ काम कर क्षेत्र हुड स्प्रे.
  3. आटोक्लेव उपकरणों या 70% इथेनॉल के साथ उदारतापूर्वक स्प्रे.
  4. उपकरणों, मीडिया, और माइक्रोस्कोप उपयोग के लिए तैयार.
  5. बाँझ पेट्री di में ठंड विच्छेदन माध्यम की 20 मिलीलीटर डालोश.
  6. Intraperitoneally (आईपी) ग्रीवा अव्यवस्था या शिरच्छेद के बाद प्रशासित क्लोरल हाइड्रेट (500 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ पशु असंवेदनता उत्पन्न करना.
  7. 70-90% इथेनॉल (कीटाणुशोधन) के साथ बांध का पेट क्षेत्र स्प्रे
  8. बड़ी कैंची और संदंश के साथ पेट खोलें.
    1. CD1 और C57/BL6 उपभेदों में: आम तौर पर 8 से 14 भ्रूण गर्भाशय के अंदर हो जाएगा. fetuses की संख्या तनाव निर्भर है.
  9. निकालें माउस गर्भाशय सहित पिल्ले और जगह ताजा ठंडा विच्छेदन मध्यम में एक स्वच्छ पेट्री डिश में भ्रूण से रक्त और ऊतक मलबे धोने.
  10. प्रत्येक भ्रूण गर्भाशय सींग से निकालें और उन्हें भ्रूण थैली और प्लेसेंटा से अलग छोटे कैंची का उपयोग. ताजा विच्छेदन मध्यम में एक नई पेट्री डिश में निकाली भ्रूण स्थानांतरण.
    1. विच्छेदन मध्यम कम चयापचय गतिविधि कम और ली गई कोशिकाओं की व्यवहार्यता की रक्षा के तापमान पर होना चाहिए.
    2. पर अब दो संदंश के साथ से काम औरसूक्ष्म वसंत कैंची विदारक.
  11. विच्छेदन खुर्दबीन के तहत कार्य करना, सूक्ष्म शल्य कैंची और छील त्वचा वापस करने के लिए रीढ़ की हड्डी का पर्दाफाश के साथ रीढ़ की हड्डी के साथ त्वचा में कटौती.
  12. आड़ा काट के बारे में सी 1 में microsurgical कैंची और पूंछ की शुरुआत के साथ रीढ़ की हड्डी.
  13. कुंद संदंश के साथ रीढ़ की हड्डी निकालें, सब हड्डी और उपास्थि को हटा रहे हैं सुनिश्चित करने और मध्यम विदारक के 3 Rd पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण.
  14. तानिका संबंधी ऊतक के बाद सेल संस्कृतियों में अतिवृद्धि को रोकने के लिए रीढ़ की हड्डी से के रूप में संभव के रूप में meninges की बहुत हटाने की कोशिश करो. नवजात परिधीय नसों उभड़नेवाला के कारण इस निकाले मस्तिष्क से तानिका संबंधी ऊतक को हटाने की तुलना में अधिक मुश्किल है.
  15. एक बार तानिका हटा दिया गया है, 20 मिमी पेट्री डिश के लिए रीढ़ की हड्डी डोरियों हस्तांतरण
  16. अच्छी तरह से 70-90% इथेनॉल के साथ क्षेत्र छिड़काव द्वारा साफ करें.
  17. हदबंदी के लिए निम्नलिखित कदम जल्दी से किया जाना चाहिए बनाए रखने के लिएव्युत्पन्न रीढ़ की हड्डी ऊतक के एक उच्च व्यवहार्यता.

5. संस्कृति की स्थापना

  1. Trypsin किया जाना चाहिए एक 37 ° दर्पण 2 हे स्नान में कम से कम 30 मिनट के लिए पहले से गरम. शेयर के तापमान के उतार चढ़ाव के जोखिम को कम एक उपयुक्त अशेष भाजक स्टॉक से हटाया जाना चाहिए.
  2. एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र 10ml पूर्व गरम (0.05%, गुणवत्ता बायोलॉजिकल) trypsin युक्त ट्यूब काटा स्पाइनल तार स्थानांतरण और 100 μl DNase (10 मिलीग्राम मिलीग्राम /) और संक्षिप्त महीन चुर्ण बनाना.
  3. अंडों पर बैठना में 37 ° दर्पण 2 हे 10 मिनट के लिए स्नान.
  4. महीन चुर्ण बनाना और एक और 10 मिनट के लिए सेते हैं.
  5. 5 मिलीलीटर जीआरपी (ऊपर परिभाषित) मध्यम और 1000 आरपीएम पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र जोड़ें.
  6. 10 मिलीलीटर जीआरपी माध्यम से सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली महाप्राण (व्यंजन) और DNase-1 (10 मिलीग्राम / एमएल, सिग्मा) जोड़ने.
  7. अंडों पर बैठना में 37 ° दर्पण 2 हे 10 मिनट के लिए स्नान.
  8. 1000 आरपीएम पर 5 मिनट अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला महाप्राण (व्यंजन).
  9. Fre के साथ resuspend गोलीश जीआरपी मध्यम तो एक 40 - 70 माइक्रोन सेल झरनी के साथ फिल्टर मलबे.
  10. PLL / laminin लेपित 25 सेमी 2 बोतल (T25) और 37 पर सेते हैं डिग्री सेल्सियस, आर्द्रता 95% और 5% सीओ 2 पर थाली.
  11. 100% मीडिया दिन के बाद बदल जाते हैं.
  12. इस बिंदु पर, GRPS और संलग्न है प्रक्रियाओं का विस्तार शुरू कर दिया.

6. जीआरपी जनसंख्या Immunopanning

  1. प्लेट कुप्पी जब तक लेपित / PLL के laminin बोतल में रीढ़ की हड्डी ऊतक 85-90% मिला हुआ है या एक सप्ताह के बारे में है.
  2. एक रबर पुलिसकर्मी के साथ या 0.05% trypsin साथ फ्लास्क scraping द्वारा फसल की कोशिकाओं, अच्छी तरह से महीन चुर्ण बनाना लेकिन धीरे, 5 मिनट और 3 मिलीग्राम जीआरपी मध्यम के साथ अच्छी तरह से resuspend गोली के लिए 1000 RPM में अपकेंद्रित्र.
  3. स्थानांतरण 1 मिलीलीटर प्रत्येक 3 में T25 बोतल या 3 मिलीग्राम 1 T75 कुप्पी माध्यम की उचित मात्रा जोड़ने के लिए पूरी तरह से कोशिकाओं कवर और बोतल 80-90% संगम तक पहुँचने के लिए अनुमति देते हैं.
  4. मीडिया हर दूसरे दिन बदलने के लिए, जल्दी ही अगर मध्यम जल्दी depletes.
  5. कोट जीवाणु पेत्रि व्यंजन (75 मिमी) 4 में एक विरोधी माउस आईजीएम एंटीबॉडी के साथ रात भर ° C (दक्षिणी बायोटेक), 10 / μg पीबीएस में मिलीग्राम.
  6. अतिरिक्त बफर महाप्राण (व्यंजन) और पेट्री पीबीएस के साथ 3x बर्तन धोने.
  7. 5 μg / पीबीएस और कमरे के तापमान (आर टी) में 1 घंटे के लिए सेते हैं में पतला मिलीग्राम की एकाग्रता A2B5 प्रतिरक्षी (Millipore) जोड़ें.
  8. पीबीएस के साथ फिर से 3x प्लेटें धो तो थाली के सुखाने को रोकने के लिए जीआरपी मध्यम के 8 मिलीग्राम जोड़ने के लिए.
  9. पेट्री डिश और फसल जीआरपी कोशिकाओं से बोतल स्क्रैप एक रबर पुलिसकर्मी के साथ सभी कोशिकाओं को अलग से स्थानांतरण जीआरपी मध्यम के 5 मिलीलीटर
  10. सेल निलंबन संक्षिप्त महीन चुर्ण बनाना clumps को तोड़ने और A2B5 लेपित जीवाणु पेट्री डिश 5ml सेल निलंबन हस्तांतरण.
  11. हिल के बिना कमरे के तापमान पर 1 घंटा सेते हैं.
  12. 1 घंटा महाप्राण (व्यंजन) मीडिया और धोने पीबीएस के साथ 8x प्लेटों के बाद.
  13. धीरे 2 मिलीलीटर जीआरपी मीडिया में एक रबर पुलिसकर्मी के साथ कोशिकाओं के परिमार्जन तो जीआरपी माध्यम की उचित मात्रा के साथ / PLL के laminin लेपित प्लेट या बोतल के लिए स्थानांतरण.

    7. और व्युत्पन्न कक्ष की बर्फ़ीली भंडारण

    1. कोशिकाओं 85-90% 2 मिलीलीटर 0.05% trypsin के साथ सहधारा T25 या T75 कुप्पी से harvested रहे हैं.
    2. Trypsin पतला है और निष्क्रिय 8ml जीआरपी स्टॉक मध्यम और 5 मिनट के लिए 1000 RPM में Centrifuged.
    3. T25 बोतल से हिमपात 1 मिलीलीटर जीआरपी ठंड मध्यम, (जीआरपी स्टॉक मध्यम 10 (v / v)% DMSO और वैकल्पिक रूप से, 20% FBS के साथ पूरक) में resuspended कर रहे हैं. T75 बोतल से बड़ा छर्रों दो गुना पतला कर रहे हैं.
    4. के 1.5 सेल निलंबन - 3 एक्स 10 10,11,12,13 कोशिकाओं को क्रायोजेनिक शीशियों (Nalgene) के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं और रातोंरात एक क्रायोजेनिक (Nalgene) कंटेनर -80 पर isopropanol युक्त डिग्री सेल्सियस धीरे स्थिर करने के लिए रात भर में संग्रहीत.
    5. रात भर ठंड कोशिकाओं बाद फ्रीजर बक्से को स्थानांतरित कर रहे हैं और 6 महीने से 1 वर्ष -80 में संग्रहीत डिग्री सेल्सियस या लंबी अवधि में (एल). Thawed है कोशिकाओं को आमतौर पर 60-80 व्यवहार्य% कोटिंग / PLL के laminin की गुणवत्ता पर काफी हद तक निर्भर करता हैं.
    6. 8. प्रतिनिधि परिणाम

      सीओ 2 fetuses और अंततः व्युत्पन्न कोशिकाओं की व्यवहार्यता पर संभव बहाव के प्रभाव की वजह से जानवर anesthetizing के लिए नहीं किया जाता है. इसके अलावा, यह बहुत मुश्किल होने के लिए पूरी तरह से व्युत्पत्ति प्रक्रिया के दौरान रीढ़ की हड्डी से तानिका हटाने लेकिन जीआरपी मध्यम और immunopanning के संयोजन इन तेजी से बढ़ कोशिकाओं को समाप्त होगा. इसी तरह, पूरे रीढ़ की हड्डी जीआरपी उदर रीढ़ की हड्डी में उद्भव और 20 पीछे की ओर पलायन करने के कारण आबादी का एक बड़ा उदर एकाग्रता के बावजूद काटा जाता है. हालांकि जीआरपी मध्यम जीआरपी phenotype के लिए चयन करता है और कि जनसंख्या A2B5 immunopanning द्वारा maximized है. रीढ़ की हड्डी के ऊतकों चढ़ाना के बाद, दो मार्ग के लिए या एक सप्ताह के बारे में इन विट्रो संस्कृतियों incubated हैं. संस्कृति में 2 दिनों के बाद, अलग morphologies की कोशिकाओं ऊतक संस्कृति असमलैंगिक का संकेत बोतल में देखा जा सकता हैजनसंख्या लेकिन जीआरपी मध्यम geneity जीआरपी phenotype के लिए चुनता है. इन कोशिकाओं को A2B5 का एक संयोजन + जीआरपी, ई NCAM + neuronal प्रतिबंधित (NRP) व्यापारियों और nestin के के +, A2B5 neuroepithelial कोशिकाओं और संभवतः fibronectin + तानिका संबंधी कोशिकाओं हैं. इसके अलावा, अधिक परिपक्व phenotypes doublecortin और neuronal वंश लिए Tuj1, astrocytes लिए GFAP और PDGFaR के oligo वंश के लिए GalC के क्रम में करने के लिए शुरू विषम पूल (चित्र 1 ए) से एक अत्यधिक जीआरपी समृद्ध आबादी को अधिकतम वर्तमान व्यक्त मार्करों हो सकता है, कोशिकाओं कर सकते हैं डबल - immunopanned का चयन करने के लिए और ई - NCAM A2B5 के लिए चयन के बाद कोशिकाओं + जीआरपी आबादी को समाप्त एक बार सेल घनत्व के बारे में 85-90 T75 बोतल में confluency% बढ़ गया है. इन जीआरपी कोशिकाओं कि oligodendrocyte phenotype के लिए चुनता है तो बाद A2B5 immunopanning अत्यधिक समृद्ध जीआरपी जनसंख्या को बनाए रखने के लिए आवश्यक हो सकता है एक माध्यम में होने के बावजूद astrocytes बनने की क्षमता को बनाए रखने. Immunopanning generसहयोगी की पैदावार 95% A2B5 + कोशिकाओं को भी अधिक से अधिक उपज के लिए A2B5 संयुग्मित चुंबकीय मोतियों (Miltenyi बायोटेक इंक) के 97% की एक उपज प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. नियमित रूप से मीडिया में परिवर्तन के रूप में रखरखाव जीआरपी संस्कृतियों में सतर्कता गैर जीआरपी सेल प्रकार के प्रसार को कम कर देंगे. के अभाव में भी बीएमपी 4 astrocytes और अभी भी पाया जा सकता है समाप्त विशेष रूप से मीडिया के लिए एक astrocytic फेनोटाइप भेदभाव प्रेरित लगता है. हालांकि B27 पूरक त्रिकोणीय iodothyronine हार्मोन (T3) के होते हैं, वहाँ कोई मनाया जीआरपी जनसंख्या में oligodendrocytes में अंतर है, केवल जब T3 की उच्च स्तर मध्यम करने के लिए जोड़ रहे हैं इस घटना घटित प्रवृत्ति किया गया है. हालांकि, एक T3 के मुक्त B27 पूरक है अगर वहाँ परिपक्व oligodendrocytes (चित्रा 1 बी) द्वारा संक्रमण के लिए एक चिंता का विषय है प्रतिस्थापित किया जा सकता है. इन जीआरपी कोशिकाओं को आसानी से 2 या 3 छोटे प्रक्रियाओं के साथ अपने छोटे से सोम की आकारिकी लेकिन अन्य कोशिका प्रकार है कि मौजूद हो सकता है, im के लिए स्क्रीन के लिए पहचाना जा सकता हैmunocytochemistry पहले नाम सामान्य विकास और सेल प्रकार विशिष्ट मार्करों के लिए किया जा सकता है. सामान्यतः A2B5 कोशिकाओं है कि (NEP) neuroepithelial और भी जीआरपी या NRP बनने में सक्षम हैं की एक छोटी आबादी लगातार हो जाएगा. सौभाग्य से, अब कोशिकाओं जीआरपी अधिक संभावना है कि मध्यम जीआरपी phenotype के लिए चुन लिए जाएँगे मध्यम में रखा जाता है.

      आकृति 1.

      चित्रा 1) मढ़वाया विषम आकारिकी की रीढ़ की हड्डी की कोशिकाओं संस्कृति में 2 दिनों के बाद मनाया जाता है ख) Immunopanning के शुरू विषम पूल से एक उच्च जीआरपी समृद्ध आबादी अधिकतम.

Discussion

Disclosures

इस अध्ययन स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान [NICHD P30HD024061 (AWP), K08NS063956 NINDS (वायुसेना), और R01NS028208 (एम वी जे) और बाल तंत्रिका विज्ञान फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया. इस रिपोर्ट की सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान, DHHS के आधिकारिक विचार जरूरी नहीं प्रतिनिधित्व. लेखक इस अध्ययन के लिए प्रासंगिक ब्याज की कोई संघर्ष है.

Acknowledgments

हम अपनी अंतर्दृष्टि और प्रतिक्रिया के लिए जीआरपी कोशिकाओं के उपयोग पर डॉ. डेविन गैरी धन्यवाद करना चाहते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/ F12 1:1 Invitrogen 11320033
B27 Invitrogen 17504044
N2 Invitrogen 17502048
rH-FGF-basic Invitrogen PHG0026
Trypsin (0.05%) EDTA Quality Biological, Inc. 118-087-721
POLY-L-LYSINE HBr Sigma-Aldrich P1274-25MG
Laminin Sigma-Aldrich L2020-1MG
Dnase 1 Sigma-Aldrich DN25

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References

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