Подготовка тканей и Иммуноокрашивание Мыши чувствительные нервные волокна, иннервирующие кожу и кости конечностей

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Иммуноцитохимическая идентификации периферических сенсорных нервных волокон подтипы (и выявления экспрессии белка в них) являются ключом к пониманию молекулярных механизмов, лежащих периферические ощущения. Здесь мы опишем методы подготовки периферического / висцерального образцы тканей, таких как кожа и кости конечностей, для конкретных иммуноокрашивания периферических сенсорных нервных волокон.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Shepherd, A. J., Mohapatra, D. P. Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones. J. Vis. Exp. (59), e3485, doi:10.3791/3485 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Обнаружение и первичной обработки физических, химических и термических сенсорных стимулов на периферических сенсорных нервных волокон имеет ключевое значение для чувственного восприятия у животных и человека. Эти периферические чувствительные нервные волокна выразить множество рецепторов и белков ионных каналов, которые обнаруживают и инициировать конкретные сенсорные стимулы. Существуют методы для характеристики электрических свойств периферических сенсорных нервных волокон, иннервирующих кожу, что также может быть использована для выявления функциональной экспрессии специфических белков ионных каналов в этих волокон. Однако подобные электрофизиологические методы недоступны (и также трудно разработать) для выявления функциональных экспрессию рецепторов и ионных каналов белков в периферических сенсорных нервных волокон, иннервирующих других внутренних органов, в том числе самых сложных тканей, таких как кости. Более того, такие электрофизиологические методы не могут быть использованы, чтобы определить выражение не-возбудимых белкаа в периферических сенсорных нервных волокон. Таким образом, иммунной периферической / висцерального образцы ткани для сенсорных fivers нерв обеспечивает наилучший способ определения экспрессии специфических белков интереса к этим нервным волокнам. Пока большая часть экспрессии белка исследований в сенсорных нейронов использовали иммуноокрашивания процедур в сенсорных ганглиях, где информация ограничивается экспрессии специфических белков в теле клетки определенных типов или подмножеств сенсорных нейронов. Здесь мы приводим подробные методы / протоколы для подготовки периферического / висцерального образцы ткани для иммунной периферических сенсорных нервных волокон. Мы специально подробно методы подготовки кожи или подошвенной биопсии и кость (бедро) разделов из мышей для иммунной периферических сенсорных нервных волокон. Эти методы не только ключ к качественного определения экспрессии белка в периферических сенсорных нейронов, но и обеспечить количественный метод анализа дляопределения изменений в экспрессии белка уровней в конкретных типов или подмножеств чувствительные волокна, а также для определения морфологических и / или анатомические изменения в количество и плотность чувствительных волокон при различных патологических состояниях. Кроме того, эти методы не ограничиваются окрашивание только чувствительные нервные волокна, но также может быть использована для окраски любых типов нервных волокон в коже, костях и других висцеральных тканей.

Protocol

1. Животное перфузии

Все животные процедур, выполняемых в данном исследовании утверждается Уходу за животными и использованию комитетом Университета штата Айова, и следуй за НИЗ руководящие принципы для использования животных в научных исследованиях.

  1. За день до перфузии, подготовить 1 л фосфатного буфера (0,2 М PB в бидистиллированной H 2 O, рН 7,4), и хранить при температуре 4 ° C. Это будет использоваться для перфузии и после фиксации процессов.
  2. В день перфузии, готовят 500 мл 4,0% параформальдегида в 0,1 М PB (PFA, рН 7,4), фиксирующий раствор, объеме, достаточном для перфузии 2 мыши: микроволновая 200 мл DDH 2 O в стеклянный стакан в течение 30 сек или пока она приближается кипения. Добавить 20 г гранулированного параформальдегида (PFA) на стакан при постоянном помешивании в вытяжном шкафу. Добавьте 5 мл 5 N NaOH каплям и перемешать, пока раствор не станет чистой. Когда PFA полностью не растворится, охладить раствор до комнатной температуры (РТ). Slowly добавьте 250 мл 0,2 М PB в то время как постоянно помешивая. Использование все слабее HCl решения (6 N 1, N до 0,1 N), отрегулировать рН до 7,4. Отрегулируйте конечный объем до 500 мл и охладить на льду. Также приготовьте 400 мл 0,1 М PB от 0,2 фондовом М путем разбавления 1:1 в DDH 2 O и охладить на льду.
  3. Обезболить мышь intraperitonial инъекции передозировка анестетика (натрия фенобарбитала, 80 мг / кг, вводили иглы 27G).
  4. Во время перфузии, 50 мл 0,1 М PB (разбавленного 0,2 М PB фондовых 1:1 с DDH 2 O) и 150 мл PFA будет передано последовательно в мышь обращении. Настройка перистальтического насоса, заполняя трубы с ПБ и фиксации 23 1 / 2 G бабочку иглой на одном конце. Погрузитесь другом конце трубку в стакан, содержащий 0,1 М PB. Установить скорость перистальтического насоса до 10 мл / мин, а прокачивать достаточное количество раствора, чтобы Есть нет пузырьков воздуха в трубы.
  5. Подождите, покаnesthetized мыши больше не показывает какой-либо рефлекторной деятельности, такие как ноги / хвост шнура и закрытием век. Положите животное на вскрытии брюшной стороне лотка внутрь вытяжной шкаф и безопасной лапы с лентой. Спрей меха с 70% этанола. Сделать разрез через кожу вдоль средней линии, чтобы разоблачить грудной клетки и верхней четверти брюшной стенки. Затем разрезать брюшную стенку у основания грудной клетки. После того, этот разрез, диафрагмы и нижней части грудины должна быть видна. Аккуратно вырежьте слева направо через край диафрагмы, и вдоль всей длины грудины, стараясь не повредить легкие. Некоторые незначительные кровотечения из грудины на данном этапе это нормально и не пойдет на компромисс перфузии. Как только разрез вдоль грудины был достигнут, и диафрагма вырезать, должна быть возможность поднять каждую половину грудной клетки вверх и наружу, так, что сердце подвергается. Отодвиньте легкие, если это необходимо. Обе половины грудной клетки можеткоторый состоится в этом положении с использованием гемостатических зажимов. Вставьте иглу бабочка (23 1 / 2 G), подключенных к перистальтического насоса 3-4 мм в левый желудочек, параллельно длинной оси животного. Данное размещение минимизирует риск иглы становятся выбили. Сделайте небольшой надрез в правое предсердие, чтобы возвращение обращения вытекать из сердца.
  6. Начните перфузии с 0,1 М PB в 10 мл / мин в течение 4-5 мин. Если есть еще значительное количество крови, исходящие из правого предсердия в данный момент, продлится до потока ясно.
  7. Остановите поток ПБ и переключиться на входе перистальтического насоса для 4% раствора PFA. Уменьшить расход до 5 мл / мин и возобновить насосные PFA решение в течение 20-25 мин. Как PFA поступает обращение, мышцы идут в судорогу, и после нескольких минут, животное должно быть буквально "фиксированной" в нужном положении. Эта жесткость может быть проверена, аккуратно давит hindpaws, стараясь не двигаться животныхой выбить канюли. Хорошо перфузии будет препятствовать конечности от сгибания в ответ. После перфузии с PFA завершена, канюли и гемостатические зажимы могут быть отключены и труп готов к ткани рассечение. Рассечение подход используется, зависит от конкретной ткани.
  8. Подготовка 4% PFA / 5% (объем / объем) пикриновой кислоты (PA; для сбора и после фиксации подошвенной удар только) путем добавления насыщенного раствора пикриновой до 4% PFA. Включение ПА значительно повышает выявляемость антигена в периферических тканях нейронов 1
  9. Подготовка кости / хрящевую ткань для удаления накипи / криопротектора решение - 10% ЭДТА в 0,1 М PB с 0,07% глицерина и 15% сахарозы. ЭДТА решений на основе ткани известковые отложения, сохраняя эпитопов 2.
  10. Подготовка криопротектора решение - 30% сахарозы в 0,1 М PB.

2. Рассечение тканей / удаление, после фиксации и Секционирование

  1. Подошвенные Панч
    Место perfuSED животных вентральной стороной вниз на разделочной коврик или другой устойчивой поверхности. Холдинг ноги подошвенной поверхности деятельности, надавите крепко биопсии инструмент (3 мм в диаметре; Харрис микро-удар, Тед Пелла Inc) в середину стопы. Включите инструмент биопсии вперед и назад на 180 градусов, чтобы подтвердить инструментом биопсии прорезать полноту заднюю лапу. Аккуратно снимите инструментом биопсии от подножия и извлечь ткань в стерильную 2 мл трубку с крышкой, содержащий в 1 мл 4% PFA / 5% годовых решение.
  2. Костей конечностей (например, бедра)
    Сделать боковой разрез вдоль спины животного на уровне таза, продолжая вниз по обе задние конечности. Сокращение в области таза и окружающие мышцы бедра отдельный от таза при этом остается проксимальная головки бедренной кости нетронутыми. Сокращение в голени / малоберцовой кости оставить дистальных головы неповрежденными, удаление окружающих мышц / надкостницы от кости вала. Место бедренной кости в 2 мл пробирку, содержащую 1 мл 4% PFA /5% годовых решение.
  3. После исправления образцы ткани в 4% PFA / 5% годовых решение, с нежным перемешивания на рокера в течение 16-18 ч при температуре 4 ° C
  4. Известковые отложения ткани следующим образом: Для подошвенных пунш (на известковые отложения мелких костей стопы) место тканью удар в 2 мл стерильной трубки с крышкой, содержащий 1,5 мл 10% раствора ЭДТА в 0,1 М PB с 0,07% глицерина и 15 % сахарозы. Место трубки на рокера с легкой смешивания в течение 16-18 ч при температуре 4 ° С. Для костей конечностей место ткани в 2 мл стерильной трубки с крышкой, содержащий 1,5 мл 10% раствора ЭДТА в 0,1 М PB с 0,07% глицерина и 15% сахарозы. Место трубки на рокера с легкой смешивания в течение 6-7 дней при температуре 4 ° С. Декальцинации решения следует менять каждые 24 часа и тканей контроль за потерю жесткости с парой щипцов.
  5. Передача ткани в 2 мл стерильной трубки с крышкой с 1,5 мл криопротектора раствора (30% сахарозы в 0,1 М PB), и поместите трубку на рокера шго мягкий перемешивание в течение 16-18 часов при температуре 4 ° С.
  6. Подготовка ткани для секционирования: место объем слоя оптимальной температуре резания (ОКТ) соединения (Сакура Finetek США Inc) на криостате ткани монтажный блок и позволить заморозить в камере криостата (как правило, поддерживается на уровне -20 ° С). Криогенных аэрозоля (Цито заморозки, контроль Ко США) также может быть распылен на октябрь для ускорения процесса замораживания. Место ткани образца на этой кровати в октябре и покрытие с дополнительным тонким слоем октября Аккуратно спрей этой октября с криогенным аэрозоля, пока он затвердеет и ткани в заморозил. Место образца на режущую головку в криостате камеры и позволяют блокировать ткани образца, чтобы уравновесить для резки температуры - по крайней мере 1 час. Попытка секции, когда вложение соединение все еще слишком холодно результаты в хрупких разделов и повреждение тканей.
  7. Как только ткань достиг оптимальной температуры резки, начала резки образца и генерировать 40 разделов мкм.
  8. Для подошвенных удар собирать cryosections в 12-и тканевой культуре пластин, содержащего 0,1 М PB с 10 мМ азида натрия. Убедитесь, что разделы оставаться под водой в этом растворе при температуре 4 ° C. Разделы могут храниться таким образом, на срок до 4-6 месяцев для иммунной целей. Кроме того, в свободном обращении разделы могут быть сохранены на неопределенный срок в криопротектора раствор при -20 ° C (500 мл 0,1 М PBS, рН 7,2, 30 г сахарозы, 10 г PVP40, 300 мл этиленгликоля). Отрегулируйте конечного объема в 1 л дистиллированной воды) 3. Для костей конечностей собирать cryosections непосредственно на желатин предварительно покрытых слайды (или SuperFrost Плюс слайды, Fisher Scientific) и дайте высохнуть на воздухе в течение 1 ч, перед хранением при температуре -20 ° C. Кость разделы на слайдах храниться таким образом, могут быть использованы для иммунной цели в течение 2-3 месяцев.

3. Иммуноокрашивание тканевых срезов для чувствительные нервные волокна

3.1. Подошвенные ударразделы - плавающая окрашивания разделе

  1. Использование лезвия бритвы, вырезать 6-7 мм от конца 1 совет мл микропипетки. Предварительное условие внутри наконечника, аспирационных 1% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) в 0,1 М PB несколько раз (это препятствует прилипанию срезах тканей к стенам совет). Передача подошвенной разделы удар быть окрашены в 24-луночного планшета для культуры ткани. Обычно 8-10 разделы должны быть окрашены в хорошо обеспечить несколько высококачественных разделы создаются в иммунной окраски.
  2. Вымойте подошвенной разделы удар с 500 мкл 0,1 М PB на скважину в течение 5 мин при энергичном перемешивании на рокера при комнатной температуре. Повторите еще 2 раза.
  3. Откажитесь от моющего раствора и инкубировать подошвенной разделы удар в блокировании решения, состоящего из 10% сыворотки козьего и 0,3% Тритон Х-100 в 0,1 М PB (500 мкл блокирующего раствора на лунку), с нежным перемешивания на рокера в течение 1 ч при 4 ° C.
  4. Удалите блокирующий раствор и инкубировать срезов ткани в начальной antiboду / антитела, разводят в 250 мкл блокирующий раствор в течение 18-24 ч с нежным перемешивания на рокера при 4 ° C. На основе экспериментальных следователя требований, одно immunolabeling (с одним первичных антител против специфического белка или маркер нервного волокна), или дважды immunolabeling (с двумя первичными антителами против двух белков или нервные волокна маркеры) могут быть выполнены на том же разделе. При выполнении двойного immunolabeling важно убедиться, что два первичных антител использовали выращиваются в различных видов хозяев (например, один поднял у мыши и один поднятый в кролик), или, наоборот, очищенные моноклональные антитела различных иммуноглобулина G (IgG) изотипов (например, один IgG1 и один IgG2a) могут быть использованы. Желательно, чтобы запечатать пластины с парафильмом для ночной инкубации, чтобы избежать чрезмерного испарения. Для того, чтобы пятно периферических сенсорных нервных волокон, некоторые специфические антитела могут быть использованы. Антитела против белков нейрофиламентов 200 (NF200, Sigma) этикетка ЛарGE-диаметр волокна, в то время как связанный с геном кальцитонина пептид (CGRP; Sigma) и переходных рецепторный потенциал пептидергической этикетке ваниллоидных 1 (TRPV1, Neuromics), малого диаметра периферических чувствительных волокон. Все периферических нервных волокон также может быть окрашивали антителами против β3-тубулина. В кожи, коллаген IV (Abcam) используется для разграничения базальной мембране, которая отделяет эпидермис от дермы. Как правило, антитела должны быть в 5-10 раз более концентрированный, чем для культурных клеточной иммунофлюоресценции анализы, как правило, на рабочие концентрации 5-10 мкг / мл.
  5. Вымойте срезах тканей с 500 мкл блокирующего раствора (с Тритон Х-100) на скважину в течение 5 мин при энергичном перемешивании на рокера при комнатной температуре. Повторить 3 раза.
  6. Откажитесь от моющего раствора и инкубировать срезах тканей в соответствующих флуорофора конъюгированных вторичных антител (обычно разбавленного 1:1000 в блокирующем раствор, 500 мкл) с нежным перемешивания на рокера при 4 ° C. Пластину музт быть завернуты в алюминиевую фольгу, чтобы избежать фотообесцвечивания флуорофоров.
  7. Вымойте срезах тканей с 500 мкл блокирующего раствора на хорошо в течение 10 мин при энергичном перемешивании на рокера при комнатной температуре. Затем промыть с 500 мкл 0,1 М PB при энергичном перемешивании в течение 10 минут при комнатной температуре. Наконец, промойте 500 мкл 0,05 М PB при энергичном перемешивании в течение 10 минут при комнатной температуре.
  8. Использование 1 мл микропипетки с FBS обработанных наконечника (вырезать 6-7 мм от конца), аспирация разделы с пластинки культуры тканей и передачи на SuperFrost Плюс предметные стекла. Упорядочить разделы и поглощают избыток промывочного буфера с тонкой кистью. Избегайте длительного воздействия света. Инкубируйте слайды при комнатной температуре, для того, чтобы позволить разделы сухих участков на слайде (5-30 мин).
  9. Применяют несколько капель монтажа среды (ProLongGold, Vectashield или аналогичный), медленно место покровное стекло на разделы. Разрешить слайды сидеть в темноте в течение 5 минут, а затем печать покровное края с прозрачными ногтейдля ногтей. Разрешить воздушной сушки в течение 15-20 мин. Слайдах теперь можно визуализировать или хранится при температуре -20 ° С в течение нескольких лет без каких-либо значительных потерь флуоресценции.

3.2. Разделы костей конечностей - на слайд-окрашивание

  1. Разрешить слайды вернуться в РТ хранения от -20 ° C. Использование гидрофобных пера барьер (Super Пап Жидкие Блокировка Pen, Тед Пелла Inc) ограничивают область на слайд, содержащий кости разделы для окрашенных щедрым слоем раствора. Дайте высохнуть на воздухе в течение 10-15 мин.
  2. Промыть кости секций с 250 мкл 0,1 М PB на слайд в течение 5 минут и повторите еще 2 раза.
  3. Откажитесь от моющего раствора и инкубировать кости разделы в блокировании решения, состоящего из 10% сыворотки козьего и 0,3% Тритон Х-100 в 0,1 М PB (250 мкл блокирующего раствора на слайд) в течение 1 ч при температуре 4 ° C.
  4. Удалите блокирующий раствор и инкубировать кости разделы в первичных антител (или комбинацию первичных антител, в случаедвойных immunolabeling, упомянутых в 3.1.4) разводят в 250 мкл блокирующий раствор в течение 18-24 часов при температуре 4 ° С. Очень важно отметить, что слайды должны быть помещены во влажной камере с закрытой крышкой, чтобы избежать высыхания первичных решение антител. Для того, чтобы пятно периферических сенсорных нервных волокон, вышеупомянутый набор антител (см. раздел 3.1.4) может быть использован с аналогичных рабочих концентрациях.
  5. Вымойте срезах тканей с 250 мкл блокирующего раствора (с Тритон Х-100) на слайд в течение 15 минут при комнатной температуре и повторите 3 раза.
  6. Откажитесь от моющего раствора и инкубировать кости в соответствующих разделах флуорофора конъюгированных вторичных антител (обычно разбавленного 1:1000 в блокирующем раствор, 250 мкл) при 4 ° C. Окрашивание камеры должны быть завернуты в алюминиевую фольгу, чтобы избежать фотообесцвечивания флуорофоров. Для удобства рекомендуется использовать темные цвета окраски камер (например, слайд инкубационный лоток / коробка, RPI Corp.)
  7. Wзолы костей разделов с 250 мкл блокирующего раствора на слайде в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем промыть с 500 мкл 0,1 М PB в течение 15 мин при комнатной температуре. Наконец, промойте 500 мкл 0,05 М PB в течение 15 мин при комнатной температуре. Dip кратко в DDH 2 O для полоскания слайды, а затем инкубируют при комнатной температуре для того, чтобы кости разделы высохнуть на воздухе (5-30 мин). Избегайте длительного воздействия света.
  8. Применяют несколько капель монтажа среды (ProLongGold или подобное) и медленно место покровное стекло на разделы. Пусть слайды стоять в темноте в течение 5 минут, а затем печать покровное с прозрачными краями лак для ногтей. Разрешить сушки в течение 15-20 мин. Слайды можно хранить при температуре от -20 ° С в течение нескольких лет без потери флуоресценции.

4. Представитель Результаты

4.1. Подошвенные разделы удар

Подошвенные ткани удар разделы могут быть визуализированы в epifluorescence микроскопом или под конфокальной микроскопии с 10X, 40X или 63x цели.

Рисунок 1
Рисунок 1. AD-шоу окрашивание коллагена IV антител (зеленый) в базальных мембран, в эпидермальные-дермальные перехода и в хрящевой ткани и мышцы. Многочисленные волокна CGRP-(AB, красный) и NF200-положительных (CD, красный) распределены по всему мыши кожи в подошвенной области (стрелки). β3-тубулина является пан-нейронный маркер (Е, красный), в то время как TRPV1 окрашивания (F, красный) в основном приурочены к малым диаметром волокна, которые также являются CGRP-позитивные (зеленый, наконечники стрел). В и С epifluorescence снимки, сделанные с целью 10X (масштаб бар -500 мкм), B, D, E и F являются конфокальной композитов изображения, сгенерированный из 11-образ Z-Stack, принятые на 2 мкм шагом под 60X цель (масштаб бар - 50 мкм).

4.2. Разделы костей конечностей

Лимб разделы костной ткани также могут быть визуализированы в epifluorescence микроскопом или под конфокальной microscopе с 10X, 40X или 63x цели.

Рисунок 2
. На рисунке 2 показан иммуноокрашивания с анти-CGRP (AB, красный; стрелки), анти-NF200 (CD, красный; стрелки), анти-β3-тубулина (Е; красный) и анти-TRPV1 (F; красный) совместно окрашенных с анти-CGRP антител (зеленый; стрелки). Эти изображения показывают подтипов чувствительные нервные волокна распределены по всему костного матрикса в губчатой ​​области головки бедренной кости мышей. В и С epifluorescence снимки, сделанные с целью 10X (масштаб бар -500 мкм), B, D, E и F являются конфокальной композитов изображения, сгенерированный из 11-образ Z-Stack, принятые на 2 мкм шагом под 60X цель (масштаб бар - 50 мкм).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы имеем подробные методы для подготовки кожи мыши и костной ткани разделы для иммунной и обнаружения периферических сенсорных нервных волокон. Разделы производится из подошвенной биопсии удар содержать как голые и волосатые кожи, а это значит протокол может быть использован на любом типе кожи. Эти методы могут быть использованы также для окрашивания других типов клеток в этих тканях (например, лейкоцитов, сосудистый эндотелий, гладких мышц и др.). Эти методы обеспечивают отличный компромисс между оптимальными ультраструктурным сохранения (что достигается глутаральдегида фиксации, но часто приводит к нарушению эпитопов и снижение качества окрашивания иммунной) и иммуноцитохимического обнаруживаемость, если процедуры следуют шаг за шагом в строгой манере.

Обнаружение чувствительные нервные волокна в этих тканях может помочь в понимании регуляции периферического результатом аксонов и прорастают 4,а также анатомические изменения в периферических сенсорных афферентов при различных патологических состояниях. Кроме того, изменения в экспрессии медиаторов, рецепторов, ионных каналов или других фенотипических маркеров в нормальном развитии или патологических состояний может быть исследована 3,5-10. Наряду с соответствующей электрофизиологические, биохимические и поведенческие тестирования, такие изменения в периферических сенсорных моделей окрашивания нейрон может быть использован для проверки гипотез, связанных с различными состояниями 6,9 боли, воспаления 11 и нейропатии 5,12. В заключение, эти методы обеспечивают неоценимый источник в естественных условиях данных, который дополняет и усиливает другие анатомические, структурные и функциональные данные, полученные за счет дополнительных подходов, углубления нашего понимания регулирования и приобретение пластичности в периферических сенсорных нервных волокон в норме и патологии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Мы благодарим д-ра Юрия М. Усачев за помощь в начальной стандартизации конфокальной микроскопии / изображений мыши подошвенной иммуноокрашивания биопсии и д-р Донна Л. Хаммонд за ее постоянную помощь и конструктивную критику в этой работе. Эта работа финансировалась грантами от NINDS / NIH (NS069898) и Грант Идея развития премию от Министерства обороны простаты Программа исследований рака (DoD-PCRP-101096) для DPM

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
3mm Harris Micro-Punch Material Ted Pella, Inc. 15094
Perfusion pump Material VWR international 23609-170
Paraformaldehyde Reagent Fisher Scientific T353
Picric acid Reagent Sigma-Aldrich 239801
OCT Embedding compound Reagent Tissue-Tek 4583
Cyto-Freeze cryogenic aerosol spray Material Control Company 3118
Goat Serum Reagent Sigma-Aldrich G9023
Incubation tray and lid for Immunostaining (Large) Material Research Products International Corp. 248270 (tray) 248270-A (lid)
ImmEdge hydrophobic barrier pen Material Vector Laboratories H-4000
Camel’s Hair Brushes (#1 thickness) Material Ted Pella, Inc. 11859
Pro‐Long Gold Mounting medium Reagent Invitrogen P36930

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative Composition Alters Distributions of Immunoreactivity for Glutaminase and Two Markers of Nociceptive Neurons, Nav 1.8 and TRPV1, in the Rat Dorsal Root Ganglion. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58, 329-344 (2010).
  2. Neves, J. D. S., Omar, N. F., Narvaes, E. A. O., Gomes, J. R., Novaes, P. D. Influence of different decalcifying agents on EGF and EGFR immunostaining. Acta Histochemica. 113, 484-488 (2011).
  3. Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology. Peptides. 7, 155-159 (1986).
  4. Yen, L. D., Bennett, G. J., Ribeiro-da-Silva, A. Sympathetic sprouting and changes in nociceptive sensory innervation in the glabrous skin of the rat hind paw following partial peripheral nerve injury. The Journal of Comparative Neurology. 495, 679-690 (2006).
  5. Boyette-Davis, J., Xin, W., Zhang, H., Dougherty, P. M. Intraepidermal nerve fiber loss corresponds to the development of Taxol-induced hyperalgesia and can be prevented by treatment with minocycline. Pain. 152, 308-313 (2011).
  6. Bloom, A. P. Breast Cancer-Induced Bone Remodeling, Skeletal Pain, and Sprouting of Sensory Nerve Fibers. The Journal of Pain. 12, 698-711 (2011).
  7. Constantin, C. E. Endogenous Tumor Necrosis Factor α (TNFα) Requires TNF Receptor Type 2 to Generate Heat Hyperalgesia in a Mouse Cancer Model. J. Neurosci. 28, 5072-5081 (2008).
  8. Jankowski, M. P. Sensitization of Cutaneous Nociceptors after Nerve Transection and Regeneration: Possible Role of Target-Derived Neurotrophic Factor Signaling. The Journal of Neuroscience. 29, 1636-1647 (2009).
  9. Jimenez-Andrade, J. M. Pathological Sprouting of Adult Nociceptors in Chronic Prostate Cancer-Induced Bone Pain. J. Neurosci. 30, 14649-14656 (2010).
  10. Persson, A. -K. Sodium-calcium exchanger and multiple sodium channel isoforms in intra-epidermal nerve terminals. Molecular Pain. 6, 84-84 (2010).
  11. Ohshima, M., Miyake, M., Takeda, M., Kamijima, M., Sakamoto, T. Staphylococcal Enterotoxin B Causes Proliferation of Sensory C-Fibers and Subsequent Enhancement of Neurogenic Inflammation in Rat Skin. Journal of Infectious Diseases. 203, 862-869 (2011).
  12. Johnson, M. S., Ryals, J. M., Wright, D. E. Early loss of peptidergic intraepidermal nerve fibers in an STZ-induced mouse model of insensate diabetic neuropathy. Pain. 140, 35-47 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics