ऊतक और माउस संवेदी तंत्रिका फाइबर त्वचा और अंग की हड्डी Innervating तैयार Immunostaining

Neuroscience

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Summary

परिधीय संवेदी तंत्रिका फाइबर subtypes के Immunocytochemical पहचान (और उसमें प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के) आणविक परिधीय सनसनी अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं. यहाँ हम परिधीय / आंत जैसे त्वचा और अंग हड्डियों के ऊतकों के नमूनों, परिधीय संवेदी तंत्रिका तंतुओं के विशिष्ट immunostaining के लिए, की तैयारी के लिए विधियों का वर्णन.

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Shepherd, A. J., Mohapatra, D. P. Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones. J. Vis. Exp. (59), e3485, doi:10.3791/3485 (2012).

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Abstract

Protocol

1. पशु परफ्यूज़न

सभी पशु इस अध्ययन में प्रदर्शन प्रक्रियाओं संस्थागत पशु देखभाल और आयोवा विश्वविद्यालय का प्रयोग समिति द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं, और अनुसंधान में पशुओं के उपयोग के लिए NIH दिशा निर्देशों का पालन करें.

  1. छिड़काव से पहले दिन में, 4 डिग्री सेल्सियस पर फॉस्फेट बफर के 1 एल (दोहरा आसुत एच 2 हे, 7.4 पीएच 0.2 एम पंजाब), और दुकान तैयार यह छिड़काव और पोस्ट - निर्धारण प्रक्रियाओं के लिए उपयोग किया जाएगा.
  2. छिड़काव के दिन पर, 0.1M पंजाब में 4.0% paraformaldehyde की 500 मिलीलीटर तैयार (पीएफए, 7.4 पीएच) लगानेवाला समाधान है, एक दो चूहों के छिड़काव के लिए पर्याप्त मात्रा: 30 सेकंड के लिए माइक्रोवेव एक गिलास बीकर में 200 DDH हे 2 मिलीलीटर या जब तक इसे उबलते दृष्टिकोण. एक धूआं हुड के नीचे लगातार क्रियाशीलता के साथ बीकर के 20 ग्राम बारीक paraformaldehyde (पीएफए) जोड़ें. 5 एन NaOH के 5 मिलीलीटर जोड़ें ड्रॉप - बुद्धिमान और हलचल जब तक समाधान को साफ करता है. जब पीएफए ​​पूरी तरह भंग है, कमरे के तापमान (आर टी) समाधान शांत. SloWLY 0.2 एम पंजाब के 250 मिलीलीटर जोड़ने जबकि लगातार क्रियाशीलता. उत्तरोत्तर कमजोर एचसीएल समाधान (6 एन एन 1 में 0.1 एन) का प्रयोग, 7.4 पीएच को समायोजित करें. 500 मिलीलीटर और बर्फ पर ठंड अंतिम मात्रा समायोजित करें. इसके अलावा 0.2 एम शेयर से DDH 2 हे और ठंड में बर्फ पर 1:01 गिराए 0.1 एम पंजाब के 400 मिलीलीटर तैयार.
  3. संवेदनाहारी (pentobarbital सोडियम, 80 मिलीग्राम / किग्रा, एक 27G सुई के साथ प्रशासित) के एक ज्यादा के intraperitonial इंजेक्शन द्वारा माउस anesthetize.
  4. छिड़काव के दौरान 0.1 एम (पतला एम 0.2 के साथ पंजाब शेयर DDH 2 हे 01:01) पंजाब और पीएफए ​​के 150 मिलीलीटर का 50 मिलीलीटर माउस संचलन में क्रमिक रूप से पारित कर दिया जाएगा . पंजाब के साथ टयूबिंग भरने और एक अंत में एक 23 1 / 2 जी तितली सुई फिक्सिंग क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप सेट करें. 0.1 एम पंजाब युक्त बीकर में टयूबिंग के दूसरे छोर विसर्जित कर दिया. समाधान का एक पर्याप्त राशि के लिए सुनिश्चित करें कि वहाँ टयूबिंग में कोई हवाई बुलबुले के माध्यम से 10 मिलीग्राम / मिनट के लिए क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप और पंप की गति सेट.
  5. एक जब तक रुकोnesthetized माउस नहीं रह / पैर की अंगुली पूंछ चुटकी और ब्लिंक रिफ्लैक्स के रूप में किसी भी पलटा गतिविधि, से पता चलता है. एक धूआं हुड के अंदर एक विच्छेदन ट्रे ventral पक्ष पर पशु लेटाओ और टेप के साथ पंजे सुरक्षित. 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे फर. त्वचा के माध्यम से midline साथ एक चीरा ribcage और पेट की दीवार के ऊपरवाला तिमाही का पर्दाफाश करें. फिर, ribcage के आधार में पेट की दीवार के माध्यम से काटा. इस चीरा के बाद, डायाफ्राम और उरोस्थि के निचले अंत दिखाई जानी चाहिए. ध्यान से डायाफ्राम के मार्जिन के माध्यम से सही करने के लिए छोड़ दिया है, और उरोस्थि की पूरी लंबाई के साथ कटौती, ध्यान लेने के फेफड़ों को नुकसान नहीं है. इस चरण में उरोस्थि से कुछ मामूली खून बह रहा है सामान्य है और छिड़काव समझौता नहीं किया जाएगा है. एक बार उरोस्थि साथ चीरा बनाया गया है और कटौती डायाफ्राम, यह संभव हो सकता है ribcage के ऊपर और बाहर, जैसे कि दिल संपर्क में है के प्रत्येक आधा लिफ्ट चाहिए. फेफड़ों अलग हटो यदि आवश्यक हो. Ribcage के दोनों आधा कर सकते हैंhemostatic clamps के उपयोग के साथ इस स्थिति में आयोजित हो. तितली (23 1 / 2 जी) सुई बाएं वेंट्रिकल में क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप 3-4 मिमी जुड़ी, जानवर की लंबी अक्ष के लिए समानांतर डालें . यह स्थान सुई उखाड़ फेंकना बनने का जोखिम minimizes. सही atrium में एक छोटा सा चीरा बनाने के लिए वापसी संचलन दिल के प्रवाह के लिए अनुमति देते हैं.
  6. 0.1 एम पंजाब के साथ 10 / एमएल 4-5 मिनट के लिए मिनट पर छिड़काव शुरू करो. अगर वहाँ अभी भी इस बिंदु पर सही atrium से निकलती खून की एक महत्वपूर्ण राशि है, जारी जब तक प्रवाह स्पष्ट है.
  7. पंजाब का प्रवाह बंद करो और 4% पीएफए ​​समाधान के लिए क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप पर इनलेट स्विच. 5 मिलीलीटर / मिनट प्रवाह दर को कम करने और 20-25 मिनट के लिए पीएफए ​​समाधान पंप फिर से शुरू. के रूप में पीएफए ​​संचलन में प्रवेश करती है, मांसपेशियों में ऐंठन में जाने के लिए और कुछ ही मिनटों के बाद, पशु सचमुच होना चाहिए "तय" की स्थिति में है. इस कठोरता धीरे hindpaws के खिलाफ धक्का द्वारा परीक्षण किया जा सकता है, ख्याल रख रही जानवर नहीं एक चालएन डी प्रवेशनी बेदखल. अच्छा छिड़काव प्रतिक्रिया में ठोके से अंग को रोकने जाएगा. है एक बार पीएफए ​​के साथ छिड़काव पूरा हो गया है, प्रवेशनी और hemostatic clamps और डिस्कनेक्ट किया जा सकता है शव ऊतक विच्छेदन के लिए तैयार है. विच्छेदन इस्तेमाल दृष्टिकोण विशिष्ट ऊतकों पर निर्भर करता है.
  8. - 4% पीएफए ​​संतृप्त रंगाई एसिड समाधान जोड़कर, 4% पीएफए ​​/ 5% (v / v) रंगाई एसिड (और तल केवल पंच के बाद नियतन संग्रह के लिए फिलीस्तीनी अथॉरिटी) तैयार करें. फिलीस्तीनी अथॉरिटी के समावेशन काफी परिधीय neuronal 1 ऊतकों में प्रतिजन detectability में सुधार
  9. 0.07% और 15% ग्लिसरॉल sucrose के साथ EDTA 10% - 0.1 एम पंजाब में / हड्डी उपास्थि ऊतक विकैल्सीभवन / cryoprotectant समाधान तैयार करें. EDTA आधारित समाधान 2 epitopes संरक्षण whilst ऊतक अम्लो व्दारा कैल्सियम.
  10. 0.1 एम पंजाब में 30% sucrose - cryoprotectant समाधान तैयार करें.

2. ऊतक / विच्छेदन हटाना, पोस्ट - निर्धारण और सेक्शनिंग

  1. तल पंच
    Perfu प्लेसsed जानवर वेंट्रल एक काटने चटाई या अन्य तगड़ा सतह पर नीचे की ओर. पैर के बीच में, पैर तल सतह ऊपर, नीचे घूंसा बायोप्सी उपकरण (माइक्रो पंच हैरिस, टेड पेला इंक 3 मिमी व्यास) के साथ मजबूती से प्रेस होल्डिंग. बायोप्सी उपकरण आगे और पीछे 180 डिग्री के माध्यम से बायोप्सी उपकरण हिंद पंजा की संपूर्णता के माध्यम से कटौती की है पुष्टि करने के लिए मुड़ें. धीरे पैर से बायोप्सी उपकरण हटाने और बाँझ 2 मिलीलीटर ट्यूब में टोपी के साथ ऊतक बाहर फैंकना, 4% पीएफए ​​/ 5% पीए समाधान के 1 मिलीग्राम से युक्त.
  2. अंग अस्थि (उदा. जांध की हड्डी)
    श्रोणि के स्तर पर पशु के पीछे के साथ एक पार्श्व चीरा, दोनों हिंद अंग के साथ नीचे जारी रखने. श्रोणि और आसपास के श्रोणि से फीमर के प्रॉक्सिमल सिर बरकरार जा whilst फीमर अलग मांसपेशियों में काटें. टिबिअ / बहिर्जंघिका में कट करने के लिए बाहर का सिर बरकरार छोड़, अस्थि शाफ्ट से आसपास के मांसपेशियों / periosteum हटा. एक 2 मिलीलीटर 4% पीएफए ​​/ 1 मिलीलीटर युक्त ट्यूब में फीमर प्लेस5% पीए समाधान.
  3. 4% पीएफए ​​/ 5% पीए समाधान में ऊतकों के नमूनों के बाद ठीक है, 4 में 16-18 घंटे के लिए एक घुमाव पर सौम्य मिश्रण के साथ डिग्री सेल्सियस
  4. के रूप में ऊतक अम्लो व्दारा कैल्सियम: तल पंच जगह (करने के लिए पैर के छोटे हड्डियों अम्लो व्दारा कैल्सियम) के लिए एक बाँझ 2 मिलीलीटर ट्यूब में टोपी के साथ ऊतक पंच, 0.1 एम पंजाब में 0.07% ग्लिसरॉल और 15 के साथ 10% EDTA समाधान के 1.5 मिलीग्राम से युक्त % sucrose. 4 में 16-18 घंटे के लिए हल्के मिश्रण के साथ एक घुमाव डिग्री सेल्सियस अंग हड्डियों को एक बाँझ 2 मिलीलीटर ट्यूब में टोपी के साथ ऊतक जगह 0.1 एम पंजाब में 0.07% ग्लिसरॉल के साथ 10% EDTA समाधान के 1.5 मिलीग्राम से युक्त पर ट्यूब प्लेस और 15% sucrose. हल्के मिश्रण के साथ एक घुमाव पर 4 पर 6-7 दिनों डिग्री सेल्सियस के लिए ट्यूब प्लेस विकैल्सीकरण समाधान हर 24 घंटे और ऊतक संदंश की एक जोड़ी के साथ कठोरता के नुकसान के लिए निगरानी बदला जाना चाहिए.
  5. Cryoprotectant समाधान के 1.5 मिलीलीटर (0.1 एम पंजाब में 30% sucrose) के साथ टोपी के साथ एक बाँझ 2 मिलीलीटर ट्यूब में ऊतक, स्थानांतरण और एक घुमाव w पर ट्यूब जगह4 डिग्री सेल्सियस पर 16-18 घंटे के लिए ith हल्के मिश्रण
  6. सेक्शनिंग के लिए ऊतक तैयार: जगह इष्टतम काटने तापमान के एक बिस्तर मात्रा (अक्टूबर) cryostat ऊतक बढ़ते खंड पर यौगिक (Sakura Finetek संयुक्त राज्य अमेरिका, Inc) और cryostat कक्ष में फ्रीज की अनुमति (आमतौर पर -20 ° सी में रखा). एक क्रायोजेनिक एयरोसोल (cyto फ्रीज, नियंत्रण कंपनी संयुक्त राज्य अमेरिका) भी अक्टूबर पर छिड़काव किया जा सकता है जमने की प्रक्रिया में तेजी लाने के. जगह अक्टूबर के इस बिस्तर पर ऊतक का नमूना और अक्टूबर की एक अतिरिक्त पतली परत के साथ कवर. धीरे क्रायोजेनिक एयरोसोल के साथ इस अक्टूबर स्प्रे जब तक यह कठोर है और भीतर ऊतकों जमी है. काटने के सिर पर cryostat कक्ष में प्लेस नमूना और ऊतक नमूना ब्लॉक काटने तापमान को संतुलित करना करने के लिए अनुमति देते हैं - कम से कम 1 घंटा. अनुभाग के लिए कोशिश कर रहा है जब एम्बेडिंग यौगिक अभी भी भंगुर वर्गों और ऊतकों को नुकसान में भी ठंड परिणाम.
  7. एक बार ऊतक इष्टतम काटने के तापमान तक पहुँच गया है, नमूना काटने शुरू और 40 सुक्ष्ममापी वर्गों उत्पन्न.
  8. तल पंच के लिए 12 अच्छी तरह से टिशू कल्चर 10 मिमी सोडियम azide के साथ 0.1 एम पंजाब युक्त प्लेटों में cryosections इकट्ठा . यकीन है कि वर्गों इस समाधान में 4 डिग्री सेल्सियस पर जलमग्न रहते हैं धारा इस तरीके में संग्रहीत किया जा सकता है, 4-6 महीने के लिए immunostaining प्रयोजनों के लिए के लिए. वैकल्पिक रूप से, मुक्त अस्थायी वर्गों cryoprotectant समाधान में -20 डिग्री सेल्सियस (500 मिलीलीटर 0.1 एम Pbs, 7.2 पीएच, 30 ग्राम sucrose, 10 PVP40 जी, 300 मिलीलीटर ethylene glycol) में अनिश्चित काल के संग्रहीत कर सकते हैं. 1L आसुत जल के साथ अंतिम मात्रा समायोजित) 3. अंग हड्डियों cryosections सीधे इकट्ठा जिलेटिन पूर्व लेपित स्लाइड्स (या Superfrost पर प्लस स्लाइड्स, फिशर साइंटिफिक) और 1 घंटे के लिए -20 ° सी. पर भंडारण से पहले हवा शुष्क की अनुमति इस रास्ते में संग्रहीत स्लाइड्स पर अस्थि वर्गों 2-3 महीने के भीतर प्रयोजनों immunostaining के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

3. संवेदी तंत्रिका फाइबर के लिए ऊतक धारा के Immunostaining

3.1. तल पंचचल अनुभाग धुंधला - वर्गों

  1. एक धार का प्रयोग, 1 मिलीलीटर micropipette टिप के अंत से 6-7 मिमी काटा. पूर्व शर्त के अंदर 0.1 एम पंजाब में कई बार 1% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) aspirating (इस ऊतक वर्गों के टिप की दीवारों पर चिपके रोकता) द्वारा टिप. तल पंच वर्गों स्थानांतरण 24 अच्छी तरह से एक ऊतक संस्कृति की थाली के लिए दाग हो. आम तौर पर 8-10 वर्गों अच्छी तरह से प्रति दाग होना चाहिए सुनिश्चित करने के कई उच्च गुणवत्ता वाले वर्गों immunostaining प्रति उत्पन्न कर रहे हैं.
  2. 0.1 एम पंजाब के 500 μl प्रति के लिए अच्छी तरह से आरटी पर एक घुमाव पर जोरदार मिश्रण के साथ 5 मिनट के साथ तल पंच वर्गों धो लें. 2 अधिक बार दोहराएँ.
  3. धोने के समाधान त्यागें और समाधान अवरुद्ध, 10% बकरी सीरम और 0.3% 0.1 में ट्राइटन X-100 एम पीबी (समाधान के प्रति अच्छी तरह से अवरुद्ध की 500 μl) के मिलकर में तल पंच वर्गों के 1 घंटे के लिए एक घुमाव पर सौम्य मिश्रण के साथ, सेते 4 में डिग्री सेल्सियस
  4. अवरुद्ध समाधान त्यागें और प्राथमिक antibo में ऊतक वर्गों सेतेवि / 4 में एक झूली कुरसी पर सौम्य मिश्रण के साथ 18-24 घंटे के लिए 250 μl अवरुद्ध समाधान में पतला एंटीबॉडी डिग्री सेल्सियस अन्वेषक प्रयोगात्मक आवश्यकताओं, एकल immunolabeling (एक एक विशिष्ट प्रोटीन या तंत्रिका फाइबर मार्कर के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ), या डबल immunolabeling (दो प्रोटीन या तंत्रिका फाइबर मार्करों के खिलाफ दो प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ) के आधार पर एक ही खंड पर किया जा सकता है. जबकि डबल immunolabeling प्रदर्शन महत्वपूर्ण है सत्यापित करने के लिए है कि दो प्राथमिक इस्तेमाल किया एंटीबॉडी अलग मेजबान प्रजातियों में उठाया जाता है (जैसे एक माउस और एक खरगोश में उठाया में उठाया), या वैकल्पिक रूप से, शुद्ध अलग immunoglobulin जी (आईजीजी) (isotypes जैसे मोनोक्लोनल एंटीबॉडी IgG1 एक और एक IgG2a) इस्तेमाल किया जा सकता है. Parafilm के साथ रात भर incubations अत्यधिक वाष्पीकरण से बचने के लिए थाली मुहर यह सलाह दी जाती है. आदेश में परिधीय संवेदी तंत्रिका तंतुओं दाग करने के लिए, कई विशिष्ट एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रोटीन neurofilament 200 के खिलाफ एंटीबॉडी (NF200, सिग्मा) Lar के लेबलजीई व्यास फाइबर, कैल्सीटोनिन जीन संबंधी पेप्टाइड (CGRP, सिग्मा) और क्षणिक रिसेप्टर संभावित 1 vanilloid लेबल (TRPV1, Neuromics) peptidergic जबकि, छोटे व्यास परिधीय संवेदी फाइबर. सभी परिधीय तंत्रिका तंतुओं भी β3 - ट्यूबिलिन के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग जा सकता है. त्वचा में कोलेजन चतुर्थ (Abcam) तहखाने झिल्ली है कि dermis से epidermis अलग चित्रित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. एक सामान्य नियम के रूप में, एंटीबॉडी 5-10 गुना अधिक सुसंस्कृत पर आम तौर पर 5-10 μg / मिलीलीटर का एक काम एकाग्रता सेल आधारित immunofluorescence assays, के लिए की तुलना में केंद्रित करने की आवश्यकता है.
  5. अवरुद्ध समाधान के 500 μl ट्राइटन X-100 के साथ () प्रति के लिए अच्छी तरह से आरटी पर एक घुमाव पर जोरदार मिश्रण के साथ 5 मिनट के साथ ऊतक वर्गों धो लें. 3 से अधिक बार दोहराएँ.
  6. वाशिंग समाधान और उचित fluorophore संयुग्मित एक झूली कुरसी पर सौम्य मिश्रण के साथ माध्यमिक एंटीबॉडी (आमतौर पर अवरुद्ध समाधान, 500 μl में 1:1000 पतला) में 4 में सेते ऊतक वर्गों डिग्री सेल्सियस त्यागें थाली musटी fluorophores के photobleaching से बचने एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटा जा.
  7. अवरुद्ध समाधान के प्रति के लिए अच्छी तरह से आरटी पर एक घुमाव पर जोरदार मिश्रण के साथ 10 मिनट के 500 μl ऊतक वर्गों के साथ धोएं. फिर आरटी से कम 10 मिनट के लिए जोरदार मिश्रण के साथ 0.1 एम पंजाब के 500 μl के साथ धो लो. अंत में, आरटी से कम 10 मिनट के लिए जोरदार मिश्रण के साथ 0.05 एम पंजाब के 500 μl के साथ धो लो.
  8. एक FBS इलाज टिप (अंत से 6-7 मिमी) में कटौती के साथ एक 1 मिलीलीटर micropipette का प्रयोग, टिशू कल्चर और SuperFrost पर थाली हस्तांतरण से वर्गों महाप्राण (व्यंजन) प्लस खुर्दबीन स्लाइड. वर्गों को व्यवस्थित करें और ठीक एक तूलिका के साथ अतिरिक्त धो बफर अवशोषित. प्रकाश के लिए लंबे समय तक जोखिम से बचें. आरटी पर स्लाइड्स सेते हैं, क्रम में वर्गों स्लाइड (5-30 मिनट) पर वर्गों शुष्क करने की अनुमति.
  9. बढ़ते मध्यम (ProLongGold, Vectashield या इसी तरह के) के कई बूँदें लागू करें, धीरे धीरे वर्गों पर एक गिलास coverslip जगह. स्लाइड अंधेरे में 5 मिनट के लिए बैठने के लिए, और फिर पारदर्शी नाखून के साथ coverslip किनारों मुहर देंपॉलिश. 15-20 मिनट के लिए हवा सुखाने की अनुमति दें. स्लाइड्स अब कई वर्षों के लिए कल्पना या -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत प्रतिदीप्ति के किसी भी महत्वपूर्ण हानि के बिना किया जा सकता है.

3.2. अंग की हड्डी वर्गों - स्लाइड पर धुंधला हो जाना

  1. स्लाइड्स -20 डिग्री सेल्सियस भंडारण से आरटी के लिए वापस जाने के लिए अनुमति दें. एक hydrophobic बाधा कलम (सुपर पैप लिक्विड अवरुद्ध पेन, टेड पेला इंक) का प्रयोग स्लाइड पर हड्डी के लिए समाधान के एक उदार परत के साथ दाग वर्गों से युक्त क्षेत्र परिगत करना. 10-15 मिनट के लिए सूखी हवा की अनुमति दें.
  2. स्लाइड प्रति 0.1 एम पंजाब के 250 μl के साथ हड्डी वर्गों 5 मिनट के लिए धो अधिक 2 बार के लिए दोहराएँ.
  3. त्यागें धोने समाधान और समाधान अवरुद्ध, 10% बकरी सीरम और 0.3% ट्राइटन 1 घंटे के लिए 0.1 में X-100 M (स्लाइड प्रति समाधान अवरुद्ध के 250 μl) 4 ° पीबी सी. से मिलकर में हड्डी वर्गों सेते
  4. अवरुद्ध समाधान त्यागें और प्राथमिक एंटीबॉडी (या प्राथमिक एंटीबॉडी के संयोजन में हड्डी वर्गों सेते हैं, के मामले मेंडबल के रूप में 3.1.4 के तहत उल्लेख किया immunolabeling) 250 4 में 18-24 घंटे के लिए μl अवरुद्ध समाधान डिग्री सेल्सियस में पतला यह बहुत महत्वपूर्ण है ध्यान दें कि स्लाइड एक सीलबंद ढक्कन के साथ एक humidified कक्ष में रखा होना चाहिए क्रम में प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के सूखने से बचने. आदेश में परिधीय संवेदी तंत्रिका तंतुओं का दाग, एंटीबॉडी के सेट उपर्युक्त (3.1.4 अनुभाग देखें) इसी तरह काम कर रहे सांद्रता के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है.
  5. धो अवरुद्ध समाधान के 250 प्रति आरटी पर 15 मिनट के लिए स्लाइड (Triton X-100 के साथ) μl के साथ ऊतक वर्गों और 3 गुना अधिक के लिए दोहराएँ.
  6. धोने के समाधान त्यागें और उचित fluorophore संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (आमतौर पर अवरुद्ध समाधान, 250 μl में 1:1000 पतला) में 4 में हड्डी वर्गों सेते डिग्री सेल्सियस धुंधला चैम्बर fluorophores के photobleaching से बचने एल्यूमीनियम पन्नी में लिपटे होना चाहिए. सुविधा के लिए, यह करने के लिए काले रंग धुंधला हो जाना कक्षों (जैसे स्लाइड ऊष्मायन ट्रे / बॉक्स, आरपीआइ कार्पोरेशन) का उपयोग करने के लिए सलाह दी जाती है.
  7. डब्ल्यूराख आरटी पर 15 मिनट के लिए स्लाइड प्रति समाधान को रोकने की 250 μl के साथ हड्डी वर्गों. फिर आरटी पर 15 मिनट के लिए 0.1 एम पंजाब के 500 μl के साथ धो लो. अंत में, आरटी पर 15 मिनट के लिए 0.05 एम पंजाब के 500 μl के साथ धो लो. DDH 2 हे में डुबकी संक्षिप्त स्लाइड्स कुल्ला करने के लिए और फिर आरटी पर सेते क्रम में शुष्क हवा (5-30 मिनट) हड्डी वर्गों की अनुमति. प्रकाश के लिए लंबे समय तक जोखिम से बचें.
  8. बढ़ते मध्यम (ProLongGold या समान) के कई बूँदें लागू करें और धीरे धीरे वर्गों पर एक गिलास coverslip जगह. स्लाइड्स अंधेरे में 5 मिनट के लिए खड़े हैं, और तब पारदर्शी नेल पॉलिश के साथ coverslip किनारों मुहर. 15-20 मिनट के लिए सुखाने की अनुमति दें. स्लाइड्स कई वर्षों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिदीप्ति की हानि के बिना संग्रहित किया जा सकता है.

4. प्रतिनिधि परिणाम

4.1. तल पंच वर्गों

तल पंच ऊतक वर्गों epifluorescence खुर्दबीन के नीचे देखे जा सकते हैं, या एक 10X, 40x या 63X उद्देश्य के साथ एक confocal खुर्दबीन के तहत.

चित्रा 1
1 चित्रा ई. तहखाने झिल्ली में कोलेजन चतुर्थ प्रतिरक्षी (हरा) के साथ epidermal - त्वचीय जंक्शन और उपास्थि और मांसपेशियों में, धुंधला दिखाने . कई CGRP (अटल बिहारी, लाल) और NF200 पॉजिटिव फाइबर (सीडी, लाल) तल क्षेत्र में माउस त्वचा (तीर) भर में वितरित कर रहे हैं. β3 - ट्यूबिलिन एक अखिल neuronal मार्कर (ई, लाल) है, जबकि TRPV1 धुंधला (एफ, लाल) मुख्य रूप से छोटे व्यास फाइबर भी है कि CGRP पॉजिटिव (arrowheads, हरी) तक ही सीमित है. ए और सी epifluorescence 10X उद्देश्य (पैमाने पर पट्टी -500 सुक्ष्ममापी) के साथ लिया छवियों हैं, बी, डी, ई और एफ confocal छवि एक 11 छवि एक 60x उद्देश्य (पैमाने के तहत 2 सुक्ष्ममापी वेतन वृद्धि में लिया z-ढेर से उत्पन्न कंपोजिट बार - 50 सुक्ष्ममापी).

4.2. अंग की हड्डी वर्गों

अंग अस्थि ऊतक वर्गों epifluorescence खुर्दबीन के नीचे, या एक confocal microscop के तहत भी visualized किया जा सकता हैएक 10X, 40x या 63X उद्देश्य के साथ ई.

चित्रा 2
विरोधी NF200 (सीडी, लाल, तीर), विरोधी β3 ट्यूबिलिन (ई, लाल) और विरोधी TRPV1 (एफ, लाल) सह दाग, चित्रा 2 (तीर अटल बिहारी, लाल) विरोधी CGRP साथ immunostaining से पता चलता है विरोधी CGRP एंटीबॉडी के साथ (हरे, तीर). इन छवियों माउस फीमर के चिमड़ा सिर क्षेत्र में मैट्रिक्स हड्डी भर में वितरित संवेदी तंत्रिका फाइबर के उपप्रकार दिखा. ए और सी epifluorescence 10X उद्देश्य (पैमाने पर पट्टी -500 सुक्ष्ममापी) के साथ लिया छवियों हैं, बी, डी, ई और एफ confocal छवि एक 11 छवि एक 60x उद्देश्य (पैमाने के तहत 2 सुक्ष्ममापी वेतन वृद्धि में लिया z-ढेर से उत्पन्न कंपोजिट बार - 50 सुक्ष्ममापी).

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Discussion

यहाँ हम माउस त्वचा और हड्डी immunostaining और परिधीय संवेदी तंत्रिका तंतुओं का पता लगाने के लिए ऊतक वर्गों की तैयारी के लिए तरीकों की विस्तृत है. तल पंच बायोप्सी से उत्पादित वर्गों दोनों अलोम और बालों त्वचा के होते हैं, जिसका मतलब है कि प्रोटोकॉल किसी भी प्रकार की त्वचा पर इस्तेमाल किया जा सकता है. इन तकनीकों में भी इन ऊतकों में अन्य प्रकार की कोशिकाओं दाग (जैसे leukocytes, संवहनी endothelia, दूसरों के बीच में चिकनी मांसपेशियों) करने के लिए नियोजित किया जा सकता है. इन विधियों एक उत्कृष्ट इष्टतम ultrastructural संरक्षण के बीच समझौता (जो glutaraldehyde निर्धारण द्वारा हासिल की है, लेकिन अक्सर epitopes और कम immunostaining धुंधला गुणवत्ता के विघटन में परिणाम) और immunocytochemical detectability, अगर प्रक्रियाओं का पालन कर रहे हैं एक कठोर तरीके से कदम-by-कदम प्रदान करते हैं.

इन ऊतकों में संवेदी तंत्रिका तंतुओं की जांच परिधीय neurite परिणाम के विनियमन की हमारी समझ में सहायता कर सकते हैं और 4 अंकुरण , एकअच्छी तरह से विभिन्न रोग शर्तों के तहत परिधीय संवेदी afferents में संरचनात्मक परिवर्तन के रूप में. इसके अलावा, न्यूरोट्रांसमीटर, रिसेप्टर्स, आयन चैनल या सामान्य विकास या रोग की स्थिति में अन्य प्ररूपी मार्करों की अभिव्यक्ति में परिवर्तन भी 3,5-10 अध्ययन किया जा सकता है . Electrophysiological, जैव रासायनिक और व्यवहार उचित परीक्षण के साथ साथ, परिधीय संवेदी न्यूरॉन धुंधला पैटर्न में इस तरह के परिवर्तन करने के लिए विभिन्न दर्द राज्यों 6,9, 11 सूजन और 5,12 neuropathies से संबंधित hypotheses परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अंत में, इन तकनीकों के vivo में डेटा है कि पूरक और पुष्ट अन्य संरचनात्मक, संरचनात्मक और कार्यात्मक अतिरिक्त दृष्टिकोण के माध्यम से प्राप्त डेटा, विनियमन और परिधीय स्वास्थ्य और रोग में संवेदी तंत्रिका तंतुओं में plasticity के अधिग्रहण की हमारी समझ को आगे बढ़ाने में एक अमूल्य स्रोत प्रदान करते हैं.

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Disclosures

हितों का कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम उनकी मदद के लिए confocal माइक्रोस्कोपी / माउस तल पंच बायोप्सी immunostaining की इमेजिंग के प्रारंभिक मानकीकरण में डा. यूरी एम. Usachev धन्यवाद, और उसे जारी की मदद और इस काम में रचनात्मक आलोचना के लिए डॉ. डोना एल हैमंड. इस काम NINDS NIH / (NS069898) से अनुदान, और रक्षा प्रोस्टेट कैंसर रिसर्च प्रोग्राम के विभाग (DoD - PCRP 101,096) से एक आइडिया विकास अनुदान DPM पुरस्कार द्वारा वित्त पोषित किया गया था

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
3mm Harris Micro-Punch Material Ted Pella, Inc. 15094
Perfusion pump Material VWR international 23609-170
Paraformaldehyde Reagent Fisher Scientific T353
Picric acid Reagent Sigma-Aldrich 239801
OCT Embedding compound Reagent Tissue-Tek 4583
Cyto-Freeze cryogenic aerosol spray Material Control Company 3118
Goat Serum Reagent Sigma-Aldrich G9023
Incubation tray and lid for Immunostaining (Large) Material Research Products International Corp. 248270 (tray) 248270-A (lid)
ImmEdge hydrophobic barrier pen Material Vector Laboratories H-4000
Camel’s Hair Brushes (#1 thickness) Material Ted Pella, Inc. 11859
Pro‐Long Gold Mounting medium Reagent Invitrogen P36930

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References

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