Isolering och Biofysikalisk studie av frukt nagelband

Biology
 

Summary

Antenn växtorgan skyddas av ytterhuden, en supramolekylär biopolyester-vax montering. Vi presenterar protokoll för att övervaka selektivt borttagande av EPI-och intracuticular vaxer från nagelbanden tomatfrukt på molekylära och mikronivå med solid-state NMR och atomkraftsmikroskopi respektive och bedöma tvärbindning förmåga konstruerade cuticular biopolyesters.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Chatterjee, S., Sarkar, S., Oktawiec, J., Mao, Z., Niitsoo, O., Stark, R. E. Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles. J. Vis. Exp. (61), e3529, doi:10.3791/3529 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Nagelband, ett hydrofobt skyddande skikt på flygbilder delarna av landväxter, fungerar som en mångsidig defensiv hinder för olika biotiska och abiotiska stress och reglerar även vattenflöde från den yttre miljön. 1 A biopolyester (inkoppling) och långkedjiga fettsyror ( vax) bildar den huvudsakliga strukturella ramen för nagelband, den funktionella integriteten hos cuticular skiktet beror på den yttre 'epicuticular' skiktet samt den blandning som består av kutin biopolymeren och 'intracuticular kallad konventionen vaxer 2 Häri beskriver vi en omfattande protokoll. att extrahera vaxer uttömmande från kommersiell tomat (Solanum lycopersicum) frukt nagelbanden eller ta bort epicuticular och intracuticular vaxer sekventiellt och selektivt från nagelbanden komposit. Metoden för Jetter och Schaffer (2001) var anpassad för en stegvis utvinning av epicuticular och intracuticular vaxer från frukten nagelband. Att övervaka 3,4Processen av stegvis vax avlägsnande, i fast tillstånd korspolarisation magic-angle spinning (CPMAS) 13 C NMR-spektroskopi användes parallellt med atomkraftmikroskopi (AFM), vilket ger molekylär nivå profiler av bulkmaterial kompletteras med information om mikroskala topografi och grovhet av cuticular ytor. För att utvärdera de tvärbindande förmåga awaxade nagelband från odlade vildtyp och enkel-genen mutanta tomat frukter, var MAS 13 ^ C NMR användes för att jämföra de relativa proportionerna av syresatt alifatiska (CHO och CH2O) kemiska delar.

Uttömmande awaxning genom stegvis Soxhlet extraktion med en panel av lösningsmedel med varierande polaritet ger ett effektivt sätt att isolera vax delar baserade på hydrofoba egenskaperna hos deras alifatiska och aromatiska beståndsdelar, samtidigt som den kemiska strukturen hos inkoppling biopolyester. Den mekaniska extraktion av epicuticular vaxer och Selective bort intracuticular vaxer, då övervakas av kompletterande fysiska metoder, ger en oöverträffad möjlighet att undersöka på nagelbanden församlingen: detta synsätt visar supramolekylär organisation och strukturell integrering av olika typer av vaxer, arkitekturen av inkoppling-vaxmatrisen, och den kemiska Sammansättningen av varje beståndsdel. Dessutom avslöjar fast tillstånd 13 '^ C NMR skillnader i de relativa antalen CHO och CH2O kemiska delar för vildtyp och mutant röda mogna tomater frukter. De NMR-tekniker erbjuder särskilda verktyg för att fingeravtrycket den molekylära strukturen hos cuticular material som är olösliga, amorf, och kemiskt heterogen. Som en icke-invasiv yt-selektiva bildteknik, förser AFM ett effektivt och direkt sätt att sondera den strukturella organisation cuticular församlingen om NM-um längdskala.

Protocol

1. Enzymatisk Isolering av tomat fjällskikt 5

  1. Placera flera kommersiella eller odlade tomater i en skål. Skala huden från frukterna i stora delar, kasta den inre fruktväggen vävnaden. Tvätta tomatskal med avjoniserat vatten och bevara dem under vatten i en bägare.
  2. Framställ en 50 mM pH 4,0 buffert natriumacetat (vid 31 ° C) genom att sätta 1,22 g natriumacetat-trihydrat (M ^. 136,08 g / mol) och 2,34 ml isättika (17,485 M) i en bägare, tillsätta 200 ml av avjoniserat vatten, och sedan justering av pH till 4,0 vid 31 ° C. Framställa en blandning innehållande 4 ml pektinas (EC 3.2.1.15, 10 U ml -1, TCI America), 0,2 g cellulas (EG 232.734.4; 1,3 enheter / mg fast substans, Sigma Aldrich), och 13 mg NaNs 3, och tillsätt sedan 196 ml natriumacetatbuffert till enzymet blandningen för att erhålla 200 ml av den slutliga enzymblandning. 5 Helt doppa den skalade tomatskal i enzymblandning och inkuberavid 31 ° C under 24 timmar med konstant skakning (G24 Environmental inkubator Shaker; New Brunswick Scientific Co.)
  3. Samla tomatskal med ett kök sil eller Büchner tratt och tvätta dem med avjoniserat vatten. Därefter placera dem i en vakuumugn vid rumstemperatur under en timme. Bevara de torkade tomatskal i märkta och försluten flaska för efterföljande avvaxningsprocesser förfaranden.

2. Uttömmande Avvaxning genom Soxhlet-extraktion 6

  1. Den utrustning som används för uttömmande avvaxning består av en värmekälla (värme mantel och Variac controller), rundkolv under ett lösningsmedel behållare, Soxhlet extraktionsutrustning sintrat glas fingerborg engångs-eller extraktionshylsa, stötdämpande chips och en kondensor (se figur. 1). Observera att den smala sifonen armen (delar 6 och 7 i figur 1). Är mycket känslig och utsatt för brott, kräver noggrann hantering.
  2. Sätt 0,5-1 g tomat hud (som erhållits isteg 1.) i en mortel, och mala provet till ett grovt pulver med en mortel om proverna ska användas för AFM mätning (avsnitt 5). Fyll ett sintrat glas eller engångs fingerborg ungefär halvvägs med provet och använd pincett för att placera den försiktigt på basen av extraktionskolonnen.
  3. Fäst kondensorn och linda den med aluminiumfolie. Värma metanollösningsmedlet (ACS-kvalitet) i närvaro av ett par stötdämpande flis tills den kokar försiktigt och återloppskokar på väggarna i kolven. Täcka det lösningsmedel reservoaren med både glasull och aluminiumfolie. Kontrollera processen under en timme, inträffar att justera Variac spänning så att reservoaren ackumuleras ca en droppe per sekund och sifonering inom Soxhlet-apparat när hylsan är full.
  4. Fortsätta extraktionsprocessen i 12 h, därefter sänka värmemantel och tillåta anordningen att svalna. Avlägsna extraktor-och reservoaren som en enda enhet för att göra sig av med lösningsmedel. Använda pincettliknanders att höja hylsan till strax under halsen på extraktionskolonnen, dränera överskottet lösningsmedel från den, och Placera hylsan på en ren yta. Luta extraktionskolonnen att hävert i kolven nedan. Koppla bort kolven och häll avfallet till en märkt avfall lösningsmedel behållare.
  5. Upprepa steg 2.3 och 2,4 för successiva lösningsmedel av progressivt minskande polaritet, t.ex. kloroform och hexan under 12 timmar i vardera fallet.
  6. Tillåta tomat kutin provet för att torka inuti hylsan, antingen genom att blåsa en ström av kvävgas över det eller genom att placeras i en vakuumugn vid rumstemperatur. Slutligen mäta massan av det torra provet och lagra den vid rumstemperatur i en skruvlock burk förseglades med parafilm.

3. Selektiv isolering av Epicuticular och Intracuticular Växer 3,4

  1. Första, tvätta hela tomater (en separat sats av tomater från de som beskrivs i 1.) Med destillerat vatten. Torka dem med papEr handdukar och Kimwipes, och placera dem spindeln nedåt på en bit aluminiumfolie.
  2. Måla hela tomater med 120% (vikt / vikt, massa-kvot) gummi arabicum vattenlösning i en top-down mode och tillåta ungefär en timme för gummi arabicum torka på frukt hud och lämnar en tunn film. Ta bort denna film med en pincett, är noga med att inte punktera tomater huden. Upprepa proceduren en gång till.
  3. Tillsätt filmerna till ampuller innehållande 1:1 (volym / volym) kloroform-vatten och blanda under tre minuter. Efter kraftig omrörning och fasseparation, pipettera ut kloroform fraktionerna och indunsta dem i separata vialer otäckta, vilket lämnar epicuticular vax. Tomaterna förblir fysikaliskt intakta. Doppa dem i kloroform under två minuter vid rumstemperatur och uppsamla den intracuticular vax efter indunstning av lösningsmedlet. Nu, skala tomaterna och behandla dem enzymatiskt (med cellulas och pektinas i natriumacetat-buffert) för att avlägsna cellulosa och pektin, respektive (såsom beskrivs i
  4. Om så önskas, utföra fullständig awaxning på dessa enzymatiskt isolerade nagelband genom Soxhlet-extraktion (se steg 2), med användning av tre lösningsmedel med varierande polaritet (metanol, kloroform och hexan, respektive).

4. Molekylär karakterisering av tomatfrukt kutin genom korspolarisation Magic-angle spinning med halvledare Kärnmagnetresonansspektrum (CPMAS ssNMR) 6

  1. Plats 4-6 mg fullt avvaxade tomat nagelbanden (cutins) i en 1,6 mm fastMAS zirconia rotor med hjälp av leverantören, medföljande packning verktyg. (Antingen slipade avvaxade tomat nagelbanden eller mycket små bitar av delvis avvaxade nagelbanden är lämpliga.) Se till att provet är packad jämnt, men inte för hårt, i rotorn. Efter att ha lagt på överdelen, måla hälften av locket med en svart färg tuschpenna för att underlätta mätningar av spinn.
  2. Justera mellanlägg av NMR spektrometer för minsta spektrallinje bredden vid halv höjd ennd kalibrera proton (1 H) och kol (13 C) 90 ° pulsbredder med en vanlig förening såsom adamantan.
  3. Använda glycin eller glutamin som modell föreningar erhålla maximal signalintensiteten genom att optimera alla parametrar (Hartmann-Hahn matchande effektnivåer, 1 H - 13 C kontakttid, heteronukleär 1 H frikoppling styrka) av korspolarisation magic-vinkel spinning (CPMAS) experiment. För spektra förvärvats till ett 1 H frekvens av 600 MHz, rekommenderade inkluderar 10 kHz eller 15 kHz spinning frekvens, en 3-sekunders fördröjning mellan förvärv och spinal heteronukleär protonavkopplingskanal 7 på en magnetisk fältstyrka motsvarar en frekvens av 185 kHz.
  4. Sätt inkopplingstrycket-packade rotorn in i sonden. Sedan placera sonden i magneten. Öka spinning hastighet upp till 10 kHz successivt för att kontrollera om en god prov packning och rotor stabilitet. Kontrollera den slutliga spinnstabilitet av rotorn till inom± 20 Hz.
  5. Justera inställning och matcha kondensatorer av sonden iterativt för att uppnå minsta möjliga ström reflektion vid både 1 H och 13 C-NMR frekvenser. Ställa den experimentella temperaturen till 25 ° C (eller rumstemperatur).
  6. Starta pre-optimerade CPMAS experiment motsvarande Hartmann-Hahn matchning tillståndet bestäms vid 10 kHz spinning frekvens.
  7. Skaffa 4096 transienter, vårdar spektrum med exponentiell (Lorentz) linjebreddning av 50-100 Hz, och göra en Fouriertransform att generera ett NMR-spektrum för signalstyrka vs kemiska skärmning (ppm).
  8. Referera till 13 C kemiska utvändigt skift med adamantan inställd på 38,4 ppm (-CH 2 - grupp) 8 som standard.
  9. Öka rotorn snurrar frekvensen till 15 kHz och upprepa CPMAS mätningen (steg 4,6-4,8) motsvarande Hartmann-Hahn matchning tillståndet bestäms vid denna senare spinning frekvens.
  10. RepEpå CPMAS experimenten (steg 4.1-4.9) med naturliga (vax) och delvis avvaxade prover frukt nagelband.

5. Sondera Surface Tomat Cuticle med Atomic Force Microscopy (Digital Instruments Nanoscope IIIa, förfaranden kommer att variera något mellan mikroskop) 6

  1. Slå på scanning probe-mikroskop (SPM) (Fig. 2) och se till att mikroskop toggle är inställd till kontakten Atomic Force Microscopy (AFM) läge.
  2. Manuellt höja SPM huvudet genom att vrida sina två användaren justerbara främre rattar. Lösgöra AFM tipholder från SPM huvudet genom att vrida klämskruven på baksidan av huvudet.
  3. Använd pincett för att ta bort den befintliga AFM utskjutande från tipholder sedan försiktigt ta en ny konsol kiselnitrid (AFM sond) från förpackningen och installera den i stället för den gamla konsolen. Använd en ljusmikroskop för att kontrollera att nyinstallerade AFM cantilever inte bryts.
  4. Fästa: ee tomat nagelband prov (en del av delvis avvaxade tomat nagelband ~ 10 mm x 10 mm) till en skiva av rostfritt stål (prov pucken) med dubbelhäftande tejp. Använda ett ljusmikroskop för att verifiera att hinnan ytan förblir plan och slät efter placering av provet på pucken.
  5. Placera pucken med tomat ytterhud provet på den magnetiska regionen vid den övre delen av SPM scannern.
  6. Ställ de främre två skruvarna manuella justering av skannern höga genom att vrida vreden, som den motoriserade Skruva tillbaka anpassning till ungefär samma nivå som de andra två främre skruvarna. Se till att alla tre skruvarna sätts tillräckligt högt för att undvika att bryta AFM spets när du placerar tipholder i SPM huvudet.
  7. Sätt tillbaka tipholder i SPM huvudet och fäst den genom att dra åt klämskruven på baksidan av huvudet.
  8. När du har slagit på laser, rikta lasern plats på AFM fribärande med centrala (y) och höger (x) laser rattar på toppen av huvudet.Övervaka den reflekterade laserstrålen på en bit papper för att positionera laserfläcken exakt vid utgången av AFM fribärande.
  9. Justera positionen för det rörliga spegeln iterativt med hjälp av fotodetektorn justeringsrattar för att uppnå maximal signal (SUM-signal), vilket garanterar att den reflekterade laserstrålen tas emot jämt av de fyra kvadranter fotodetektom.
  10. Sänk AFM spets genom att dra tillbaka de manuella justeringar främre skruvarna och den motoriserade baksidan justerskruven av SPM scannern visuellt övervaka synsätt AFM spets mot provets yta med ett inverterat mikroskop. Kontrollera att alla tre skruvar är på samma nivå för att undvika artefakter från exponering av ett lutande prov. Ta spetsen mot provet, men inte så nära att spetsen vidrör eller bryter igenom provets yta.
  11. Vid denna punkt, reflekterade laserljuset från AFM fribärande kommer studsa den rörliga spegeln till fotodetektorn. För kontakten AFM läge med en silicon nitrid AFM spets, ställa in utsignalen (vertikal deformation) spänning till -2 V till 0 V Börvärde och DIFF Signal (vertikal / horisontell skillnad) till 0 V genom att justera läget för spegeln.
  12. Med hjälp av Nanoscope mjukvaran, klicka på mikroskopet ikonen och välj lämplig profil (Kontakt mode AFM).
  13. Använda "Skanna Controls Settings" panel, ställ in avsökningshastighet och skanningsstorlek t.ex. 10 mikron skanningsstorlek och 2 Hz avsökningshastighet.
  14. Låt AFM spets att engagera provytan genom att klicka på delta-tip ikonen. Genom att styra den motoriserade baksidan skruv SPM basen, kommer programmet att sänka nu spetsen tills den hakar provets yta. Skanningen startar automatiskt när spetsen har anlitat ett framgångsrikt sätt.
  15. Övervaka skanningen med både bild och omfattning former av programvara, justera parametrar som börvärde, integrerad förstärkning, proportionella förstärkningen, skanningsstorlek, skanna hastighet, linjer och prover / line iterativt för att uppnå högstahögupplösta bilder. Börja skanna med ett stort z-axeln sortiment (data skala), sedan försiktigt minska uppgifter skalvärdet att observera bästa kontrast ytan funktioner på bilden. Minimera förekomsten av vita områden i den scannade bilden, vilket indikerar att höjden på de ytegenskaper överskrider den tillgängliga z-axeln intervallet.
  16. Fånga bilden för att spara datafilen, sedan bearbeta data med hjälp av tillplattande funktioner för att ta bort bildartefakter på grund av vertikala (Z) scanner drift, bågar bild, och vertikal förskjutning mellan linjer, 9 slutligen beräkna den genomsnittliga råhet. Efter att spara data, tillbaka AFM spetsen genom omkastning av verkan av den datorstyrda skruvmotor som användes för att låsa den. Bildbehandling kan utföras i offline bildanalys läge och / eller använda en annan dator.
  17. Använd de främre nedre grå metall knoppar av spetsen innehavaren att ändra x och y positionerna för scanning område, upprepa mätningen vid fem prov locaningar för att kontrollera reproducerbarhet, som ersätter AFM fribärande Om bildkvaliteten försämras.

6. Representativa resultat

Kemisk förskjutning analys av CPMAS 13 C NMR-spektra (figur 3) identifierade de huvudsakliga funktionella grupper närvarande i uttömmande avvaxade tomat ytterhud (kutin). De centrala kol-grupperna i kutin biopolyester befanns vara långkedjiga alifatiska (0-45 ppm), oxygenerade alifater (45-110 ppm), multiplicering-bundna och aromater (110-160 ppm) och karbonyler (160-220 ppm). De syresatta alkyldelar (CHO + CH2O) spelar en avgörande roll för att etablera kovalenta kopplingar mellan de monomera enheterna av kutin biopolymeren, och därigenom bilda den molekylära strukturen för inkoppling matrisen. Skillnader i relativa toppareor som observerats i det spektrala området mellan 45 och 100 ppm tyder på att den mutanta kutin har en relativt stor andel av tvärbindning formande CHO Structura l grupper jämfört med vildtyp inkoppling, noggranna kvantitativa mätningar med direkt polarisation (DPMAS) NMR 5 metoder stödjer denna slutsats (data visas ej).

CPMAS 13 C NMR-spektra visade också en gradvis minskande vax toppen vid 31 ppm (fig. 4), vilket indikerar den sekventiella avlägsnandet av epi-och intracuticular vaxer från inkoppling-vax komposit samtidigt som den huvudsakliga kemiska arkitektur inkoppling biopolymer. Parallellt AFM bildanalys (Fig. 5) visade ojämnheter på grund av den stegvisa utvinning av epi-och intracuticular vaxer från frukten nagelband, vilket innebär förändringar i organisationen av cuticular monteringen.

Figur 1
. Figur 1 Soxhlet extraktionsapparat (bildkälla: Wikipedia).

"/>
Figur 2. A) avsökning av sonden mikroskop. B) SPM huvudet (anpassad från AFM utbildning manual tillhandahålls av Digital Instruments).

Figur 3
Figur 3. 150 MHz CPMAS 13 C NMR-spektra av uttömmande avvaxade röda mogna nagelband tomatfrukt (cutins) från vildtyp (M82) och mutant (CM15) visar resonanser med kemiska skiften som motsvarar de funktionella grupperna i en tvärbunden hydroxifettsyra -baserade polyester och även några föröka bundna grupper. Alla spektra förvärvades med 10 kHz spinning frekvens.

Figur 4
Figur 4. 150 MHz 13 CCPMAS NMR-spektra för kommersiella röda mogna nagelband tomatfrukt uppvisar kompositionsförändringar vid sekventiella avlägsnandet av epicuticular och intracuticular växer genom gummi arabicum mekanisk extraktion och en two-minuters kloroform dip, respektive. Alla spektra förvärvades med 15 kHz spinning frekvens.

Figur 5
Figur 5. AFM-bilder och uppskattningar råhet för den partiellt awaxas kommersiellt tomat fjällskikt beskrivs i fig 4 efter den stegvisa avlägsnandet av epicuticular (vänster) och intracuticular (höger) vaxer.

Discussion

De protokoll som beskrivs häri möjliggör detaljerad molekylär och mikroskala karakterisering av en komplex svårbehandlad växtmaterial utan behov av destruktiv kemisk nedbrytning. För att undersöka blandningen av inkoppling biopolyester med olika lipider (vaxer) som styr den strukturella organisation cuticular församling, 10 genomförde vi och övervakas förfaranden för selektiv borttagning av epicuticular och intracuticular vaxer från heterogena cuticular blandningen. Solid-state C-13 NMR användes för att mäta extraktion av vax molekylära komponenter och atomkraftsmikroskopi tjänade till att undersöka samtidiga förändringar i ytråhet. 6,11 För att jämföra de tvärbindande förmåga cutins från odlade vildtyp och enkel-genen mutanta tomat frukter, var fast tillstånd 13 '^ C NMR också användas för att uppskatta det relativa antalet CHO och CH2O kemiska delar.

Ett antal av design-funktionens av detta protokoll är anmärkningsvärda. Som vaxmaterial omfattar ett brett spektrum av lipider, behandla frukten nagelband med en serie av lösningsmedel som har skilda polaritet är viktigt att uppnå fullständig avvaxning. Dessutom kan awaxning tid variera från 8 timmar till 24 timmar beroende på egenskaperna hos hinnan prover. För att extrahera epicuticular vaxer konsekvent från den intakta frukten nagelband, är det nödvändigt att applicera limmet beläggningen jämnt på ytan.

Solid-state CPMAS 13 C-NMR 12 är en snabb kvalitativ metod för identifiering av olika strukturella komponenter av mycket heterogena och olösliga vegetabiliska biopolymerer samtidigt deras ursprungliga fysikaliska egenskaper, 13 traditionell lösning-state NMR kan också användas för att karaktärisera de extraherade vax blandningar. Om kvantitativ uppskattning av funktionella grupper önskas för intakta växt polymerer, 5 avancerat hifi-ljud direkt polarisering Magic-vinkel spinning (DPMAs) 13 C-NMR 5,14 bör användas som en kompletterande metod. Exakt kvantifiering av de funktionella grupperna kräver en noggrann optimering av återanvänd gånger, excitation längder puls, och styrkan i heteronukleär frikoppling 15. Den heteronukleär frikoppling kan ställas in för en 1 H fältstyrka som sträcker sig från 50 kHz till 185 kHz med hjälp av TPPM 16 eller Spinal 7 metoder. Utöver dessa parametrar beror känslighet CPMAS mätningar på spin-lock tid och Hartmann-Hahn matchande tillstånd. 15 I stället för traditionella CPMAS kan en sluttande amplitud CP (RAMP-CP) teknik implementeras för att maximera korset -polarisering effektivitet genom att variera 1 H amplituden linjärt (~ 20-50%) eller tangentiellt medan amplituden på 13 C fältstyrka konstant under spin-lock period (eller vice versa). 17,18 Genomförande av CPMAS mätningarna vid minst två olika rotor-spinning frekvenser är viktigt att skilja spinning sidband från de största spektrala toppar.

Samtidiga AFM mätningar utförda i kontakt läget möjliggör direkt avbildning av nagelband yttillståndet med höga skanning hastigheter och hög upplösning, 19 till exempel vid sekventiell borttagning av vaxartade beståndsdelar. Rörelseresultatet AFM gäller att utnyttja (icke-kontakt)-läget kan användas som ett alternativ för utanpåliggande karakterisering av känsliga "mjuka" växtmaterial, undvika eventuella skador på grund av laterala (skjuvning) krafter och skrapning av provets yta. 5,20 I båda fallen , sekventiell förvärv av flera bilder av samma plats på ytan tjänar till att identifiera eventuella skador på ytan på grund av "sond-ytinteraktioner" i AFM mätningarna. 6,21 För optimal reproducerbarhet bör AFM sonder med fjäderkonstanter lämpliga för mjuka cuticular ytorna vara används och beständigheten i temperatur och luftfuktighet bör bibehållas. 6,15,20 22,23 för att spåra ytan topografi dessa utsökt komplexa makromolekylära församlingar. 1,2

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av amerikanska National Science Foundation # MCB-0741914 och MCB-0843627, ytterligare infrastrukturellt stöd gavs på City College of New York av National Institutes of Health 2 G12 RR03060-26 från National Center for Research Resources. Vi erkänner tacksamt att JKC Rose gruppen i Cornell University växtbiologi Institutionen för tillhandahållande av M82 (vild typ) och CM15 (mutant) tomat nagelband. Vi tackar Dr Spyros Monastiriotis från CCNY kemiteknik grupp Prof. Alexander Couzis för hans generösa hjälp med AFM experimenten. Vi tackar Ms Lauren Gohara för grafisk formgivning stöd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium acetate trihydrate Sigma-Aldrich S8625-500G
Pectinase TCI America P0026 EC 3.2.1.15; 10 U ml-1, store in refrigerator
Cellulase Sigma-Aldrich C1184-100KU EC232.734.4; 1.3 units/mg, store in refrigerator
Glacial Acetic acid Sigma-Aldrich A9967
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002-100G Extremely hazardous
Incubator/shaker New Brunswick Scientific Model No.G24 MFG No.M1036-000G
Vacuum Oven Precision Scientific 31566
Variac Controller
Sintered glass thimble (85 mm/25mm) VWR international 89056
Disposable extraction thimble ( 80 mm/ 25 mm) VWR international 28320
Methanol VWR international EMD-MX0485-7
Glass wool VWR international RK20789
Aluminum foil Fisher Scientific 01-213-100
Tweezers VWR international 82027-452
Chloroform VWR international EM-CX1050-1
Hexane Fisher Scientific H302-4
Nitrogen gas
Parafilm VWR international 52858
Paper towels VWR international 89002-984
Kim wipes VWR international 21905-026
Gum arabic Sigma-Aldrich G9752
1.6 mm fastMAS zirconia rotor Varian Inc., Agilent
NMR spectrometer Varian Inc., Agilent standard bore magnet
Glycine Sigma-Aldrich 50046 Model compound for CPMAS
Glutamine Sigma-Aldrich 49419 Model compound for CPMAS
Adamantane Sigma-Aldrich 100277 To calibrate 90° pulse in NMR
Multimode Scanning Probe Microscope (Nanoscope IIIA) Digital Instruments
Nanoscope software Digital Instruments Version 5.30r3sr3 (2005)
AFM probe (Nonconductive silicon nitride tip) Veeco Instruments, Inc. Model NP-20
Light microscope Digital Instruments
Magnetic puck Digital Instruments
Double sided tape VWR international
Fruit Peeler
Büchner funnel VWR international 89038

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dom#237;nguez, E., Heredia-Guerrero, J. A., Heredia, A. The biophysical design of plant cuticles: an overview. New Phytologist. 189, 938-949 (2011).
  2. Bargel, H., Koch, K., Cerman, Z., Neinhuis, C. Structure-function relationships of the plant cuticle and cuticular waxes - a smart material? Functional Plant Biol. 33, 893-910 (2006).
  3. Jetter, R., Schäffer, S. Chemical Composition of the Prunus laurocerasus Leaf Surface. Dynamic Changes of the Epicuticular Wax Film during Leaf Development. Plant Physiol. 126, 1725-1737 (2001).
  4. Vogg, G. Tomato fruit cuticular waxes and their effects on transpiration barrier properties: functional characterization of a mutant deficient in a very-long-chain fatty acid β-ketoacyl-CoA synthase. J. Exper. Botany. 55, 1401-1410 (2004).
  5. Isaacson, T. Cutin deficiency in the tomato fruit cuticle consistently affects resistance to microbial infection and biomechanical properties, but not transpirational water loss. Plant J. 60, 363-377 (2009).
  6. Round, A. N. The Influence of Water on the Nanomechanical Behavior of the Plant Biopolyester Cutin as Studied by AFM and Solid-State NMR. Biophysical J. 79, 2761-2767 (2000).
  7. Fung, B. M., Khitrin, A. K., Ermolaev, K. An Improved Broadband Decoupling Sequence for Liquid Crystals and Solids. J. Magn. Reson. 142, 97-101 (2000).
  8. Morcombe, C. R., Zilm, K. W. Chemical shift referencing in MAS solid state NMR. J. Magn. Reson. 162, 479-486 (2003).
  9. Fang, S. J., Haplepete, S., Chen, W., Helms, C. R., Edwards, H. Analyzing atomic force microscopy images using spectral methods. J. App. Phys. 82, 5891-5898 (1997).
  10. Pollard, M., Beisson, F., Li, Y., Ohlrogge, J. B. Building lipid barriers: biosynthesis of cutin and suberin. Trends. Plant Sci. 13, 236-246 (2008).
  11. Stark, R. E. NMR studies of structure and dynamics in fruit cuticle polyesters. Solid State Nucl. Mag. 16, 37-45 (2000).
  12. Schaefer, J., Stejskal, E. O. Carbon-13 nuclear magnetic resonance of polymers spinning at the magic angle. J. Amer. Chem. Soc. 98, 1031-1032 (1976).
  13. Sachleben, J. R., Chefetz, B., Deshmukh, A., Hatcher, P. G. Solid-State NMR Characterization of Pyrene-Cuticular Matter Interactions. Envir. Sci. & Tech. 38, 4369-4376 (2004).
  14. Zlotnik-Mazori, T., Stark, R. E. Nuclear magnetic resonance studies of cutin, an insoluble plant polyester. Macromolecules. 21, 2412-2417 (1988).
  15. Stark, R. E., Garbow, J. R. Nuclear magnetic resonance relaxation studies of plant polyester dynamics. 2. Suberized potato cell wall. Macromolecules. 25, 149-154 (1992).
  16. Bennett, A. E., Rienstra, C. M., Auger, M., Lakshmi, K. V., Griffin, R. G. Heteronuclear Decoupling in Rotating Solids. J. Chem. Phys. 103, 6951-6958 (1995).
  17. Metz, G., Wu, X. L., Smith, S. O. Ramped-Amplitude Cross-Polarization in Magic-Angle-Spinning NMR. J. Magn. Reson. Ser. A. 110, 219-227 (1994).
  18. Peersen, O. B., Wu, X. L., Smith, S. O. Enhancement of CP-MAS Signals by Variable-Amplitude Cross-Polarization - Compensation for Inhomogeneous B-1 Fields. J. Magn. Reson. Ser. A. 106, 127-131 (1994).
  19. lessandrini, A., Facci, P. AFM: a versatile tool in biophysics. Measurement Sci. & Tech. 16, 10-1088 (2005).
  20. Benítez, J. J., Matas, A. J., Heredia, A. Molecular characterization of the plant biopolyester cutin by AFM and spectroscopic techniques. J. Struct. Biol. 147, 179-184 (2004).
  21. Koch, K., Neinhuis, C., Ensikat, H. J., Barthlott, W. Self assembly of epicuticular waxes on living plant surfaces imaged by atomic force microscopy (AFM). J. Exper. Bot. 55, 711-718 (2004).
  22. Muller, D. J. AFM: A Nanotool in Membrane Biology. Biochemistry. 47, 7986-7998 (2008).
  23. Last, J. A., Russell, P., Nealey, P. F., Murphy, C. J. The Applications of Atomic Force Microscopy to Vision Science. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6083-6094 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics