كامل التثبيت الإرواء الحيوان للقوارض

Neuroscience
 

Summary

نحن هنا وصف منخفضة التكلفة، والسريع، وإجراء تثبيت للرقابة وموحدة تستخدم لامتصاص العرق 4٪ perfused عبر الأوعية الدموية: من خلال قلب فأر للحصول على الحفاظ على أفضل وجه ممكن من الدماغ.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564, doi:10.3791/3564 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

هدف التثبيت هو بسرعة وبشكل موحد المحافظة على الأنسجة في حالة الحياة مثل. في حين وضع الأنسجة مباشرة في أعمال مثبت جيدا لقطع صغيرة من الأنسجة، وعينات أكبر مثل الدماغ سليمة تشكل مشكلة لتثبيت غمر لأن مثبت لا تصل الى جميع مناطق الأنسجة في نفس المعدل 5،7. في كثير من الأحيان، والتغيرات في الاستجابة لنقص الأكسجة تبدأ قبل أن تتمكن من الحفاظ على النسيج 12. ميزة perfusing مباشرة مثبت من خلال الدورة الدموية هو أن هذه المادة الكيميائية يمكن أن تصل بسرعة كل ركن من أركان الحي باستخدام شبكة الطبيعية الأوعية الدموية. من أجل الاستفادة من الدورة الدموية أكثر فاعلية، لا بد من الحرص على تطابق الضغوط الفسيولوجية 3. من المهم أن نلاحظ أن الضغوط النفسية هي التي تعتمد على الأنواع المستخدمة. تقنيات لتثبيت نضح تختلف تبعا للنسيج إلى أن تكون ثابتة، وكيف ستتم معالجة الأنسجة تثبيت التالية. في هذا الفيديو، ونحن تصف منخفضة التكلفة، والسريع، وإجراء تثبيت للرقابة وموحدة تستخدم لامتصاص العرق 4٪ perfused عبر الأوعية الدموية: من خلال قلب فأر للحصول على الحفاظ على أفضل وجه ممكن من الدماغ لالمناعية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية (مقابل بالجاذبية النظم) هو أن يتم استغلال الدورة الدموية بأكبر قدر من الفعالية.

Protocol

1. إعداد مثبت

(انظر الجدول مثبت والمخازن.)

2. إعداد المخازن الإرواء

(انظر الجدول مثبت والمخازن.)

3. إعداد أجهزة والتخدير

  1. باستخدام ماء الاستحمام، عازلة نضح دافئ إلى 37 درجة مئوية. مكان صمام منفذ في كوب مملوء العازلة. ملء محقنة 50 مل مع العازلة، ونعلق على أنابيب مثبت. تدفق أنابيب مرارا بطرد وسحب العازلة.
  2. مسح سطر مع عازلة حتى يتم القضاء على جميع فقاعات الهواء في الأنبوب. من الأهمية بمكان لنجاح أي نضح ليس لديهم فقاعات الهواء في أي من الخطوط.
  3. إزالة المحاقن وربط مثبت بارافورمالدهيد 4٪ (درجة حرارة الغرفة) حاوية. لتجنب فقاعات الهواء في نهاية الأنابيب، ضغط على أنبوب فيما وضع الأنبوب في وعاء حتى قطرة من يبرز العازلة من تي نهايةس اتصل سطح السائل داخل الحاوية.
  4. إغلاق ميناء منفذ (نهاية إبرة). تحويل صمام العازلة (الأزرق) إلى نفس الموقف صمام مثبت (أبيض). وهذا سوف يسمح تدفق من خط العازلة فقط.
  5. فتح المنفذ منفذ وكرر الخطوة A1 خلال A3 لملء خط العازلة. بعد أن يتم القضاء على جميع فقاعات الهواء بالقرب من ميناء منفذ، وإزالة المحقنة وتوصيل الحاويات العازلة، مع الحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء في الأنبوب.
  6. نظام اختبار القدرة على الاحتفاظ الضغط بواسطة ضخ blub مقياس ضغط الدم والمطاط. هناك بعض المقاومة في العادة نتيجة لضغط الهواء في نظام.
  7. إعداد أدوات عملية جراحية من أجل سهولة الوصول. شغل الإبرة نضح مع عازلة للقضاء على احتمال من فقاعات الهواء.
  8. قبل الجراحة، ويدير خليط الكيتامين / زيلازين (ما يصل الى 80 من وزن الجسم ملغم / كغم من الكيتامين و 10 من وزن الجسم زيلازين ملغ / كلغ) عن طريق الحقن داخل الصفاق (27 إبرة قياس و 1 حقنة سم مكعب). سيتم تنفيذ إدارة إضافية من مخدر عند الضرورة أثناء كل عملية للحفاظ على متن طائرة من التخدير الجراحي.

4. نضح جراحة

  1. مرة واحدة للحيوان وصلت طائرة العمليات الجراحية في التخدير، ووضعه على صينية ضحلة مليئة الثلج المجروش. (استخدم إصبع قرصة استجابة طريقة لتحديد عمق التخدير. الحيوان يجب أن يكون غير قادر على الاستجابة قبل المتابعة).
  2. جعل شق 5-6 سم الجانبية من خلال إهاب وجدار البطن فقط تحت القفص الصدري. بعناية فصل الكبد من الحجاب الحاجز.
  3. جعل شق صغير في الحجاب الحاجز باستخدام المنحني، مقص حادة. لا يمكن للموقف، والضغط من إصبعك مساعدة في خفض القدرة على الحجاب الحاجز.
  4. مواصلة شق الحجاب الحاجز على طول من القفص الصدري لكشف التجويف الجنبي.
  5. وضع منحن، مقص حادة على طول جانب واحد من أضلاعه، وتشريد بعناية في الرئتين، وجعل مكعبتي من خلال القفص الصدري حتى الترقوة. جعل خفض مماثل في الجانب المقابل.
  6. رفع القص بعيدا، بعناية تقليم أي نسيج توصيله إلى القلب. المشبك غيض من القص مع مرقئ ووضع مرقئ على رأسه. عندما يوظف بشكل صحيح، الغدة الصعترية ترفع بعيدا عن القلب جنبا إلى جنب مع القص، وتوفير رؤية واضحة للسفن الكبرى.
  7. جعل شق صغير في نهاية الخلفي من البطين الأيسر باستخدام مقص القزحية.

الشكل 1
اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

  1. تمرير 15-قياس إبرة نضح حادة أو الزيتون الرؤوس، من خلال خفض البطين إلى الشريان الأبهر الصاعد. ينبغي للطرف أن تكون واضحة من خلال جدار الشريان الأورطي، وينبغي أن لا تصل إلى قوس الأبهر حيث الشرايين السباتية العضدية وتتباعد.
  2. استخدام مرقئ إلى تضييق القلب، وهذا يثبت إبرة، ويمنع تسرب. إذا رغبت في ذلك، يمكن استخدام مرقئ تعديلها لتضييق الشريان الأبهر حول الطرف إبرة (وهذه المرقأة تبقى في مكانها حتى يبدأ تشريح، ولكن يتم حذف من الرسوم التوضيحية في المستقبل من أجل الوضوح).
  3. وأخيرا، إجراء شق إلى الأذين الحيوان حق استخدام مقص القزحية لخلق كبير كمتنفس ممكن دون الإضرار الشريان الأورطي النازل. عند هذه النقطة الحيوان جاهزة للperfused.

5. نضح

  1. فتح وإرفاق المنفذ منفذ إلى إبرة قاعدة مع الحرص على عدم إدخال أي فقاعات الهواء.
  2. ضخ ما يصل لمبة مقياس ضغط الدم إلى الضغط من 80 ملم زئبق بسرعة وبشكل متساو. الحفاظ على هذا الضغط في جميع أنحاء المنطقة العازلة فترة التسريب. بدء موقت.
  3. ضبط زاوية إبرة. زاوية إبرة أمر بالغ الأهمية لتحقيق معدل التدفق الأقصى (لاحظ تغير تدفق مع تعديل زاوية).
  4. تبديل برتقاليإيه صمام (الأزرق) بعد الانتهاء تقريبا العازلة (200 مل). يجب على السائل أن يتم تشغيل واضحة. تطهير الكبد هو مؤشرا على نضح جيد. وينبغي أن يكون واضحا في الكبد في هذه المرحلة. تشير إلى وقت للسجلات.
  5. ينبغي التقيد الهزات التثبيت في غضون ثوان، وينبغي النظر في هذا الوقت الحقيقي لتثبيت. تشير إلى وقت للسجلات.
  6. يمكن للضغط أن يكون تدريجيا زيادة تصل إلى حد أقصى قدره 130 2 مم زئبق للحفاظ على معدل تدفق ثابت.
  7. إغلاق صمام مأخذ بمجرد الانتهاء تقريبا مثبت. تشير إلى نهاية الوقت للسجلات.
  8. يجب أن تكون الفئران شديدة في هذه المرحلة.
  9. ويجب جمع بارافورمالدهيد المستعملة والمخزنة للتخلص منها وفقا للوائح المؤسسة الخاصة بك.

6. تشريح 4،11

  1. إزالة الرأس باستخدام مقص.
  2. جعل شق خط الوسط على طول إهاب من الرقبة إلى الأنف وفضحالجمجمة.
  3. تقليم قبالة عضلة الرقبة المتبقية بحيث يتم كشفها قاعدة الجمجمة، وإزالة أي عضلة المتبقية باستخدام مقص أو rongeurs.
  4. وضع نهاية حادة من مقصا قزحية في ماغنوم الثقبة على جانب واحد، انزلاق المقص بعناية على طول السطح الداخلي للجمجمة.
  5. المقبل، وجعل قطع تمتد إلى الحافة البعيدة للسطح الجمجمة الخلفي. إجراء خفض مماثل في الجانب المقابل. استخدام rongeurs لمسح بعيدا الجمجمة حول المخيخ.
  6. الشريحة بعناية في المقص على طول السطح الداخلي للجمجمة كتلميح يسافر من الزاوية الظهرية الخلفية البعيدة إلى حافة الأمامية البعيدة من الجمجمة، ورفع حتى على شفرة كما انك قطع لمنع تلف الدماغ. كرر الجانب المقابل.
  7. rongeurs باستخدام قشر السطح الظهري من الجمجمة بعيدا عن الدماغ. تقليم بعيدا الجانبين من الجمجمة باستخدام rongeurs كذلك.
  8. باستخدام ملعقة، قطع المصابيح حاسة الشم والجهاز العصبي connecستعقد على طول السطح البطني للدماغ.
  9. ندف بلطف الدماغ بعيدا عن الرأس، وتقليم أي الدرة الذي يربط لا يزال الدماغ في الجمجمة باستخدام مقص القزحية.
  10. إزالة الدماغ ووضعه في قارورة من السوائل التي تحتوي على ما لا يقل عن 10X مثبت حجم الدماغ نفسه. دوامة القارورة في بعض الأحيان.

7. بعد تثبيت وتخزين

  1. الحفاظ على الدماغ في مثبت لمدة 24 ساعة في درجة مئوية 4، يحوم في بعض الأحيان.
  2. بعد 24 ساعة، وغسل الدماغ مع الفوسفات مخزنة المالحة من خلال تبادل لل3 مرات وسائل الإعلام ويحوم في كل مرة.
  3. ويمكن بعد ذلك يتم تخزينها في عقل الفوسفات مخزنة المالحة أو HBHS مع أزيد الصوديوم والاحتفاظ بها في 4 درجات مئوية.

8. ممثل النتائج

مؤشر أولي للنجاح نضح هو تطهير الحدود القصوى مثل الأنف والأذنين، والكفوف والأعضاء الداخلية مثل الكبد والغدة الصعترية (IHC العالم).تفتيش الإجمالية للدماغ يكشف عن فراغ الاوعية الدموية من الدم (أبيض إلى ظهور اللون الأصفر الشاحب). هذا سوف يكون صحيحا أيضا في المقاطع النسيجية خصص لتلطيخ والمناعية. المؤشر النهائي لنتائج نضح هو الشرط من التركيب الدقيق في الأنسجة. 1،6،7،8

إعداد مثبت:
تعد 8٪ الأوراق المالية لامتصاص العرق
  1. اضافة 40 لامتصاص العرق ز إلى 500 مل O. 2 درهم تسخين حل ل60-65 درجة مئوية مع التحريك (لا تتجاوز 65 درجة مئوية، وبذلك يمكن أن تؤثر سلبا على نجاح العملية المناعية).
  2. لمسح حل، وخفض الحرارة وإضافة 2-3 مل من هيدروكسيد الصوديوم 1.0 متر مع قطارة.
  3. مرشح ومخزن في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 في الشهر.
تعد 0،2 فوسفات الصوديوم العازلة م، ودرجة الحموضة 7.4
  1. لمخزون فوسفات أحادى الصوديوم، إضافة 27،8 ز ناه 2 PO 4 * H 2 O إلى 1 لتر O. 2 درهم
  2. لمخزون فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة، إضافة 28،4 ز نا 2 هبو 4-1 L O. 2 درهم
  3. إضافة 810 مل من الأوراق المالية أحادى إلى 190 مل من الأسهم ثنائي القاعدة.
إعداد 4٪ مثبت لامتصاص العرق
  1. إضافة أجزاء متساوية 8٪ الأسهم بارافورمالدهيد إلى 0.2M الصوديوم العازلة الفوسفات
  2. ملاحظة: يتم تحضير أفضل هذا الإصلاح الجديد، لا يزيد عن 72 ساعة مقدما.
إعداد الإرواء والمخازن التخزين:
التخزين المؤقت إعداد الفوسفات المالحة، ودرجة الحموضة 7.4
  1. 1 لتر درهم 2 O
  2. 9 ز كلوريد الصوديوم
  3. 144 ملغ KH 2 PO <فرعية> 4
  4. 795 ملغ نا 2 هبو 4
  5. فحص درجة الحموضة
التخزين المؤقت HEPES هانكس الحل (HBHS) مع درجة الحموضة أزيد الصوديوم 7.4
  1. 990 مل درهم 2 O
  2. 7.5 غرام كلوريد الصوديوم،
  3. 0،3 ز بوكل
  4. 0.06 غ KH 2 PO 4
  5. 0،13 ز نا 2 هبو 4
  6. 2 غرام سكر العنب / الجلوكوز
  7. 2.4 ز 10 ملم Hepes
  8. 0.1 غ MgCl 2 6 أجزاء درهم 2 O
  9. 0.05 غ MgSO 4 7 أجزاء درهم 2 O
  10. 0،165 ز CaCl 2 2 أجزاء درهم 2 O
  11. 90 ملغ نان 3
  12. فحص درجة الحموضة

الجدول رقم 1. إعداد تثبيتي، والمخازن.

الشكل 1
الشكل 1.

الشكل 2
الشكل 2. إعداد الإرواء أولا جهاز بيغن مع خط مثبت. تدفق أنابيب من فقاعات الهواء وملء مع عازلة عن طريق طرد سريعا وسحب العازلة في حقنة وذلك من خلال خط. إغلاق صمام في نهاية إبرة قبالة. وضع خط مثبت في زجاجة مثبت دون إدخال فقاعات الهواء.

الشكل (3)
الشكل 3. إعداد جهاز الإرواء الثاني. 1. فتح صمام في نهاية إبرة. 2. تحويل صمام العازلة (الأزرق) إلى موقف لتدفق. 3. تدفق أنابيب من فقاعات الهواء وملء مع عازلة عن طريق طرد سريعا وسحب العازلة مع الحقنة. 4. غلق صمام في نهاية إبرة. وضع أنابيب في زجاجة العازلة. اختبار الضغط للتأكد من اغلاق النظام الصحيحلاي من خلال تضخيم لمبة مقياس ضغط الدم ويراقب المقياس. الجهاز جاهز الآن لإجراء نضح.

الشكل 4
الشكل 4. جهاز الإرواء في موقف لتسليم العازلة.

الشكل 5
الشكل 5. الإرواء جراحة أولا أ) جعل شق جانبي طريق إهاب وجدار البطن. ب) إجراء شق في الحجاب الحاجز وخفض عبر الحجاب الحاجز تعريض القلب. إجراء تخفيضات موازية على جانبي الأضلاع حتى الترقوة. ج) المشبك غيض من القص مع مرقئ ووضع مرقئ على رأسه.

الشكل (6)
الشكل 6. الإرواء الثاني الجراحة. أ) أن يجتاز إبرة نضح من خلال خفض البطين إلى الشريان الأبهر الصاعد. ب) تأميننضح إبرة استخدام مجموعة واحدة من المرقأة إلى تضييق القلب. ويمكن أيضا أن هناك مجموعة ثانية من مرقئ تعديل لاستخدامها لتضييق الشريان الأبهر حول الطرف إبرة لمنع التسرب. باستخدام مقص قزحية جعل شق صغير في نهاية الخلفي من البطين الأيسر.

الشكل 7
الشكل 7. الإرواء مع مضخة الاحتياطي لمبة مقياس ضغط الدم إلى خلق ضغط في السطر. فتح صمام (1) ونعلق على محور إبرة. من المهم جدا للتأكد من تقديم أي فقاعات الهواء. ضخ ما يصل لمبة مقياس ضغط الدم إلى الضغط من 80 ملم زئبق، ويحافظوا على هذا الضغط في جميع أنحاء المنطقة العازلة فترة التسريب.

الشكل 8
الانتهاء تقريبا الرقم 8. الإرواء مع مثبت مرة واحدة العازلة (200 مل) تبديل صمام العازلة (1) لإتاحة الفرصة لتثبيتي في التدفق. ويمكن تدريجيا من الضغط يمكن زيادة تصل إلىالحد الأقصى من 130 ملم زئبق.

الشكل 9
الشكل 9. أولا تشريح أ) إزالة الرأس باستخدام زوج من مقص. ب) إجراء شق في الجلد على طول خط الوسط من الرقبة إلى الأنف وفضح الجمجمة. ج) تقليم قبالة عضلة الرقبة المتبقية حتى إن ما يتعرض له قاعدة الجمجمة. عقد رئيس بحيث فتحة كبيرة في سطح الجمجمة (ماغنوم الثقبة) يمكن الوصول إليه. إدراج بعناية في نهاية حادة من مقصا قزحية في ماغنوم الثقبة وإحداث القطع. كرر نفس المناورة عن الجانب المقابل. استخدام rongeurs لمسح بعيدا الجمجمة حول المخيخ.

الشكل 10
الرقم 10. الثاني تشريح. أ) الشريحة بعناية في المقص على طول السطح الداخلي للجمجمة. ترفع على الحافة كما كنت قطع لمنع تلف الدماغ. تكرر الشيء نفسه بالنسبة لالجانب المعاكس. استخدم rongeurs قشر الجمجمة بعيدا عن الدماغ. ب) مع التوضيح في الجمجمة وإزالة يتعرض الدماغ. ج) استخدام ملعقة لقطع بصيلات الشم والتوصيلات العصبية في الموقع معظم الأمامي من الدماغ. الدليل بعناية غيض ملعقة على طول الجانب السفلي من الدماغ إلى قطع الاتصالات لسهولة إزالة. إزالة الدماغ ووضعه في قارورة من مثبت.

Discussion

ملاحظات إضافية لعملية جراحية ناجحة:

  1. مرة واحدة تم اختراق الحجاب الحاجز، وتسبق في أسرع وقت، ونقص الأكسجة hypercapnia ستبدأ التغيرات الفسيولوجية التي قد لا رجعة فيه نخلط تحليل لاحق.
  2. عندما يتم إدخال الإبرة وفرضت في مكان، فإن الضغط المتبقية دفع الدم إلى قاعدة من الإبرة (فلاش باك). في الواقع، قد طرد بقوة أكبر الحيوانات في الدم. فمن الأهمية بمكان أن الدم على الأقل الوصول إلى قاعدة من الإبرة إلى تجنب إدخال فقاعات الهواء التي من شأنها أن يشكل عقبة لإتمام نضح. إذا لاحظت أي دم في قاعدة إبرة، وإزالة الإبرة وإعادة ملء مع المخزن عن طريق ربط منه إلى ميناء منفذ للتلاعب نضح. بمجرد أن يتم تشغيل العازلة من خلال التلميح، يمكن إعادة إدخال الإبرة في القلب.
  3. التنسيب المناسب للإبرة في الشريان الأورطي أمر بالغ الأهمية، فإنه لا ينبغي أن تصل إلى حد قوس الأبهر.
  4. إذا perfusions متعددة تجري أنه ليس من الضروري تيس الإعداد من البداية في كل مرة. يحتاج المستخدم أن يكون الحجم المناسب لعازلة على حد سواء ومثبت في كل زجاجة (200mls الحيوان / حل). ويمكن أيضا تعبئتها في زجاجات إذا لزم الأمر. الجانب الأكثر أهمية للنظر هو طرد خط نضح الذي يمتد من الإعداد لهذا الحيوان (صمام الإخراج). بعد الانتهاء من نضح، وسوف يكون هذا الخط لامتصاص العرق 4٪ في ذلك. إزالة أنابيب من الزجاجة العازلة واستخدام الحقنة 50 مل مملوءة بالماء لطرد مثبت. تأكد يتم وضع صمام منفذ في دورق جمع النفايات للتخلص السليم لامتصاص العرق. كرر ذلك ثلاث مرات. عبوة مع العازلة باستخدام نفس الأسلوب هو موضح في 2.3.
  5. هذا الأسلوب من أجل تثبيت قابل للتكيف مع درجة عالية من القدرة على تغيير كل العازلة وغيرها من المثبتات مثبت (مثل تلك التي تستخدم لم) وفقا لمتطلبات هذه التجربة.
  6. كما هو النظام كثيرا ما تستخدم لاستخلاص الأنسجة الحية. لهذاعملية واحدة يستخدم ببساطة تسليم العازلة فقط (وضعت زجاجة عازلة في حين لا تزال تعلق على النظام بأكمله في دلو الثلج وزجاجة مثبت هو الإعداد ولكن فارغة مختومة). هذا يؤكد على نضح العازلة البرد في الضغط الأمثل. من هنا يمكن أن تكيف النظام إلى ضخ الأصباغ يمكن حلها عن طريق إضافة إما صبغ مباشرة إلى المخزن المؤقت (في حال كانت الكمية ليست قضية) أو استخدام المحاقن مع الحد الأدنى من المخزن / حل في صبغ بين عازلة - مثبت الخطوة.
  7. في حالة الصب الأوعية الدموية، وعازلة للرصد الضغط خطوة حاسمة لكن بسبب اللزوجة وترسيخ طبيعة الحل الصب يجب أن تستخدم إما حقنة 50ml للتسليم المباشر أو مرفق التخلص منها ثانوية بالنسبة لجهاز (الأنابيب، صمام، وعقد يمكن استخدام حاوية) التي أدخلت على التفاعل مع النظام الحالي. سبق الصب مختبراتنا 'الأوعية الدموية في تصميم وتصنيع جهاز نضح. ولذلك لا يمكننا شأكلت من ان قياسات الضغط سيكون القياس الدقيق في موقع التسليم. قد الأرقام لا بد من تعديلها لتحقيق النجاح في تنفيذ السوائل اللزجة.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مركز تكنولوجيا الاتصالات العصبية (CNCT)، ومركز الموارد P41 بتمويل من المعهد الوطني للتصوير الطبية الحيوية والهندسة الحيوية (NIBIB، P41 EB002030) وبدعم من المعاهد الوطنية للصحة (NIH).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthetic:
Ketamine/xylazine mixture (Anesthetic may vary per laboratory / institution) Ketaset NDC 0856-2013-01 10 mL vial
Surgery:
Needle tip, 27 GA x 1.25" Materiel Services 25251
Large blunt/blunt curved scissors (~14.5 cm) Fine Science Tools 14519-14
Straight iris scissors Fine Science Tools 14058-11
Standard tweezers Fine Science Tools 11027-12
Pair of fine (Graefe) tweezers Fine Science Tools 11050-10
1 large hemostat forceps - curved or straight (~19 cm) surgicaltools.com 17.21.51
2 standard hemostat forceps - straight serrated (14 cm) Fine Science Tools 13013-14
1 modified hemostat (with 15-gauge hole filed through the tip) Fine Science Tools 13013-14
15-gauge blunt or olive-tipped needle (perfusion needle) Fisnar 5601137
Perfusion:
HyPerfusion system or equivalent
Phosphate buffered saline, pH 7.4
4% Paraformaldehyde in 0.1 M Phosphate Buffer, pH 7.4
Shallow glass or plastic tray, approximately 10" x 10"
Crushed ice
Water bath (37 °C)
Timer
50 ml syringe Medline Industries NPMJD50LZ
Dissection:
Pair of standard sharp/blunt straight scissors (~12 cm) Fine Science Tools 14054-13
Medium curved or straight rongeurs (14-16 cm) or skull bone removal pliers Fine Science Tools 16020-14
Straight iris scissors (~9 cm) Fine Science Tools 14058-11
Micro-spatula (double 2" flat ends, one rounded, one tapered to 1/8") Fine Science Tools 10091-12
Post-Fixation & Storage:
50 ml glass vial
40 ml HEPES-Buffered Hanks Solution (HBHS) with sodium azide (90mg/l)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cinar, O., Semiz, O., Can, A. A microscopic survey on the efficiency of well-known routine chemical fixatives on cryosections. Acta. Histochem. 108, 487-496 (2006).
  2. Fritz, M., Rinaldi, G. Blood pressure measurement with the tail-cuff method in Wistar and spontaneously hypertensive rats: Influence of adrenergic- and nitric oxide-mediated vasomotion. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 58, 215-221 (2008).
  3. Ikeda, K., Nara, Y., Yamorii, Y. Indirect systolic and mean blood pressure determination by anew tail cuff method in spontaneously hypertensive rats. Laboratory Animals. 25, 26-29 (1991).
  4. Jacobowitz, D. M. Removal of discrete fresh regions of rat brain. Brain Res. 80, 111-115 (1974).
  5. Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device. Journal of Neurosci. Meth. 12, 141-149 (1984).
  6. Jung-Hwa, T. ao-C. heng, Gallant, J., Brightman, P. E., Dosemeci, M. W., A,, Reese, T. S. Structural changes at the synapse after delayed perfusion fixation in different regions of the mouse brain. J. Comp. Neurol. 501, 731-740 (2007).
  7. Kasukurthi, R., Brenner, M. J., Morre, A. M., Moradzadeh, A., Wilson, Z. R., Santosa, K. B., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. Transcardial perfusion versus immersion fixation for assessment of peripheral nerve regeneration. J. Neurosci. Meth. 184, 303-309 (2009).
  8. Lamberts, R., Goldsmith, P. C. Fixation, fine structure, and immunostaining for neuropeptides: perfusion versus immersion of the neuroendocrine hypothalamus. J. Histochem. Cytochem. 34, 389-398 (1986).
  9. Ramos-Vara, J. A. Technical Aspects of Immunohistochemistry. Vet. Pathol. 42, 405-426 (2005).
  10. Shi, Z. R., Itzkowitz, S. H., Kim, Y. S. A comparison of three immunoperoxidase techniques for antigen detection in colorectal carcinoma tissues. J. Histochem. Cytochem. 36, 317-322 (1988).
  11. Walker, W. F. Vertebrate dissection. Sixth Ed, W.B. Saunders Comp. Philadelphia. (1980).
  12. Zwienenberg, M., Gong, Q., Lee, L. L., Berman, R. F., Lyeth, B. G. J. Neurotrauma. Monitoring in the Rat: Comparison of Monitoring in the Ventricle, Brain Parenchyma, and Cisterna Magna. 16, 1095-1102 (1999).

Comments

1 Comment

  1. Thank you for your nice JoVE article. I'm trying to put together a low cost perfusion system for training purposes and really liked your approach. Do you have a part list for the perfusion apparatus? If this was made by a shop at UMich or UW, would it be possible for me to either get the part list or order a replica?

    Sincerely,

    Mehrdad Jazayeri, Ph.D.
    Assistant Professor, Department of Brain and Cognitive Sciences
    Investigator, McGovern Institute for Brain Research
    MIT 46-6041
    43 Vassar Street
    Cambridge, MA 02139, USA
    Phone: 617-715-5418
    Fax: 617-253-5659
    Email: mjaz@mit.edu

    Reply
    Posted by: Mehrdad J.
    December 10, 2013 - 1:21 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics