ऊतक, immunohistochemistry धुंधला और डिजिटलीकरण की मानव प्रोटीन एटलस के भीतर उत्पादन

Biology
 

Summary

ऊतक प्रोटीन एक कुशल ऊतकों की एक भीड़ से समवर्ती जानकारी हासिल करने के लिए विधि के लिए अनुमति देता है. ऊतकों के प्रतिनिधि भागों एक एकल तेल ब्लॉक में इकट्ठा कर रहे हैं. ब्लॉक से धारा immunohistochemistry और प्रोटीन की अभिव्यक्ति पैटर्न के विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है. स्कैनिंग डिजिटल डेटा के वितरण के लिए इसी छवियों को उत्पन्न करता है.

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Kampf, C., Olsson, I., Ryberg, U., Sjöstedt, E., Pontén, F. Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas. J. Vis. Exp. (63), e3620, doi:10.3791/3620 (2012).

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Abstract

ऊतक माइक्रोएरे प्रौद्योगिकी (TMA) उच्च throughput कई ऊतकों और कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए साधन प्रदान करता है. तकनीक मानव प्रोटीन एटलस परियोजना के भीतर सामान्य मानव ऊतकों, कैंसर और सेल लाइनों में प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न के वैश्विक विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है. हम यहाँ 1 मिमी कोर के विधानसभा, microscopically चयनित प्रतिनिधि ऊतकों से प्राप्त एक एकल प्राप्तकर्ता TMA ब्लॉक में मौजूद है. संख्या और TMA ब्लॉक में कोर के आकार लगभग चालीस 2 मिमी कोर से 0.6 मिमी कोर के सैकड़ों के लिए अलग किया जा सकता है. TMA प्रौद्योगिकी का उपयोग कर के लाभ यह है कि डेटा की बड़ी राशि तेजी से एक एकल Immunostaining प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता से बचने के प्राप्त किया जा सकता है. महत्वपूर्ण बात है, केवल दुर्लभ ऊतक के एक सीमित राशि की जरूरत है, जो 1 2 बड़े रोगी साथियों के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है. लगभग 250 लगातार वर्गों (4 माइक्रोन मोटी) TMA ब्लॉक से काटा जा सकता है और immunohistochemical staini के लिए इस्तेमाल किया250 विभिन्न एंटीबॉडी के लिए विशिष्ट प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न को निर्धारित करने के लिए एनजी. मानव प्रोटीन एटलस परियोजना में एंटीबॉडी सभी मानव प्रोटीन की ओर उत्पन्न कर रहे हैं और 216 विभिन्न रोगियों, मानव कैंसर के 20 सबसे आम प्रकार का प्रतिनिधित्व करने से दोनों सामान्य मानव ऊतकों में इसी प्रोटीन प्रोफाइल 144 व्यक्तियों और कैंसर ऊतकों से प्राप्त किया. Immunohistochemically दाग गिलास स्लाइड TMA पर वर्गों के लिए उच्च संकल्प छवियों जिसमें से पैथोलॉजिस्ट की व्याख्या और immunohistochemistry का परिणाम व्याख्या कर सकते हैं बनाने के लिए स्कैन कर रहे हैं. इसी विकृति आधारित एनोटेशन डेटा के साथ एक साथ छवियाँ मानव प्रोटीन एटलस (पोर्टल के माध्यम से अनुसंधान समुदाय के लिए सार्वजनिक रूप से उपलब्ध बना रहे हैं www.proteinatlas.org ) (चित्रा 1) 3 4. मानव प्रोटीन एटलस एक नक्शा दिखा रहा है और मानव शरीर में प्रोटीन के रिश्तेदार बहुतायत वितरण प्रदान करता है. वर्तमान देखेंसायन प्रोटीन अभिव्यक्ति 12.238 अद्वितीय प्रोटीन, मानव जीनोम द्वारा इनकोडिंग प्रोटीन के 61% से अधिक करने के लिए इसी के लिए डेटा के साथ 11 लाख से अधिक छवियों.

Protocol

1. ऊतक माइक्रोएरे उत्पादन के लिए ऊतकों को तैयार करने के लिए (एनिमेशन 1)

  1. प्रासंगिक formalin निश्चित आयल इसी hematoxylin दाग ऊतक अनुभाग सहित एम्बेडेड सामग्री (ऊतक या सेल के नमूने) का चयन करें.
  2. मार्क ऊतक अनुभाग पर प्रासंगिक क्षेत्र. यह एक नया कटौती hematoxylin दाग तेल ब्लॉक करने के लिए इसी खंड की सिफारिश की है.
  3. डिजाइन टेम्पलेट TMA उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया. पूरे TMA अनुभाग और सेक्शनिंग समस्याओं पर एंटीबॉडी के कवरेज के रूप में तकनीकी समस्याओं की वजह से कलाकृतियों से बचने के लिए टेम्पलेट के भीतर नमूनों अनियमित. अभिविन्यास के लिए टेम्पलेट के लिए अतिरिक्त अभिविन्यास मार्करों जोड़ें.
  4. टेम्पलेट के अनुसार ऊतकों को व्यवस्थित करें.

2. मैनुअल ऊतक माइक्रोएरे उत्पादन (फिल्माने के लिए आवश्यक)

  1. ऊतक कोर के एक मानकीकृत लंबाई प्राप्त करने के लिए, जैसे ख़ंजर 4.5 मिमी (चित्रा 2) निशान करने में सक्षम हो. Guidelनमूना केन्द्रों के बीच की रिक्ति के लिए ines:
    मूल आकार 0.6 मिमी 0.8-1.0 मिमी
    1.8-2.0 मिमी मूल आकार 1.0 मिमी
    मूल आकार 1.5 मिमी 2.0-3.0 मिमी
    2.5-4.0 मिमी मूल आकार 2.0 मिमी
    यह तेल ब्लॉक के प्रत्येक पक्ष पर 2.5-3.0 मिमी मार्जिन छोड़ने के लिए आयल के खुर से बचने के लिए सिफारिश की है.
    1. चयनित करने के लिए इस्तेमाल किया जा घूंसे माउंट. हेक्स गर्तिका शिकंजा उस जगह में पंच धारण ढीला द्वारा शुरू करो. पंच सही ढंग से जब पंच हब में नाली प्लास्टिक वी ब्लॉक में मजबूती धातु की छड़ के खिलाफ रखा तैनात है. शिकंजा जकड़ना और सुनिश्चित करें कि धातु क्लिप के किनारे क्षैतिज है.
    2. प्राप्तकर्ता पंच छोड़ दिया करने के लिए रखा जाना चाहिए (हरे और लाल, वितरक के लिए विशेष में चिह्नित). दाता पंच, जो एक थोड़ा बड़ा व्यास, सही करने के लिए रखा जाना चाहिए (चित्रा 3) (हरे और नीले, वितरक के लिए विशेष में चिह्नित).
    1. X-और y-अक्षों के साथ घूंसे XY समायोजन knobs का उपयोग करके ले जाएँ. सही समायोजन घुंडी x-अक्ष के साथ घूंसे चलता रहता है और बाईं समायोजन घुंडी y-अक्ष के साथ घूंसे चलता है.
      वहाँ दोनों समायोजन पर knobs डिजिटल सुक्ष्ममापी readout की है है. इन सक्रिय कर रहे हैं जब knobs के चलती है.
    2. रीसेट → / शून्य ABS बटन दबाएँ.
      इंच और मिमी के बीच शिफ्ट → IN / मिमी बटन दबाएँ.
      छेद के बीच अंतरिक्ष 2.0 मिमी (छेद के केंद्रों के बीच मापा जाता है) हो सकता है जब एक 9x8 टेम्पलेट के लिए 1 मिमी पंच का उपयोग करना चाहिए.
    1. सुनिश्चित करें कि आप ब्लॉक में पंच नहीं धक्का नहीं है बहुत दूर नीचे, कैसेट मार और पंच को नष्ट करने, धारक में तेल के बिना एक कैसेट और कैसेट के नीचे से ऊपर 1 मिमी प्राप्तकर्ता पंच के नीचे स्थिति सेट पर गहराई रोक पेंच का उपयोग करकेZ गाइड के ऊपरी बाएँ कोने (चित्रा 3).
    2. धारक में प्राप्तकर्ता ब्लॉक रखो और छोटी पेचकश का उपयोग करने के लिए शिकंजा जकड़ना. तंग करने के लिए दृढ़ मत शिकंजा या पैराफिन कैसेट से ढीला तोड़ सकता है.
    3. प्राप्तकर्ता ब्लॉक में प्राप्तकर्ता नीचे पंच धक्का लगभग 5 मिमी और पंच में संभाल का उपयोग करने के लिए पंच आगे और पीछे एक बार बारी बारी से (चित्रा 3). 5 मिमी गहरे छेद हो जब पंच के रूप में दूर संभव के रूप में नीचे ब्लॉक में धक्का होगा.
    4. धीरे धीरे नीचे धक्का दबाव को राहत देने, ताकि स्प्रिंग्स पंच को स्थानांतरित कर सकते हैं. पंच खाली और आयल कोर त्यागें ख़ंजर का प्रयोग करें.
  2. बुर्ज हटो लिए दाता पंच (चित्रा 3) के लिए स्विच.
  3. प्राप्तकर्ता ब्लॉक धारक पर दाता खंड (चित्रा 3) के साथ दाता ब्लॉक पुल रखें.
    1. दाता punc पुशदाता ब्लॉक के चयनित क्षेत्र में ज. इसी hematoxylin और लाल भामसान रंग दाग स्लाइड जहां ब्याज क्षेत्र ऊतक कि जांचा जा रहा है का पता लगाने के लिए चिह्नित किया गया है का उपयोग करें. मैन्युअल रूप से अपने बाएँ हाथ के साथ स्थिति में दाता ब्लॉक पकड़ और अपने दहिने हाथ के साथ धक्का मुक्का. ध्यान दें कि आप ख़ंजर पर धक्का नहीं करना चाहिए. गहराई रोक नहीं दाता ब्लॉक के लिए उचित स्थिति में पंच गति ब्लॉक, इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि आप जब सेकंड का चिह्न ख़ंजर पर दिख रहा है धक्का बंद.
    2. एक बार पंच (चित्रा 3) पर संभाल घुमाएँ. धीरे धीरे नीचे की ओर दबाव जारी है जबकि अभी भी दाता ब्लॉक पुल पर दाता ब्लॉक पकड़.
    3. दाता ऊतक अधिमानतः 0.5 मिमी प्राप्तकर्ता कोर से कम छिद्रित है. इस प्रक्रिया प्राप्तकर्ता ब्लॉक सतह पर कोर के एक समायोज्य संरेखण सुनिश्चित करने के लिए, बहुमूल्य प्रतिनिधि ऊतक के नुकसान से बचने जाएगा.
  4. पुल और दाता ब्लॉक निकालें. बनानासुनिश्चित करें कि दाता पंच छेद है कि पहले बनाया गया था (4 अंक) के साथ गठबंधन किया है. आप सेट शिकंजा का उपयोग कर यदि दाता पंच और प्राप्तकर्ता ब्लॉक में छेद गठबंधन नहीं कर रहे पंच स्थिति को समायोजित करना चाहिए.
  5. ध्यान से पंच नीचे धक्का जब तक इसकी टिप प्राप्तकर्ता ब्लॉक में छेद के शीर्ष तक पहुँच जाता है. हालांकि इस स्थिति धारण, ख़ंजर का उपयोग करने के लिए छेद में ऊतक कोर खाली. कोर सतह ब्लॉक की सतह के साथ संरेखण में होना चाहिए.
  6. प्राप्तकर्ता पंच बुर्ज वापस ले जाएँ.
  7. XY समायोजन knobs के साथ अगले स्थान में ले जाएँ.
  8. ऊपर बिंदु 4c से दोहराएँ जब तक कि सरणी पूरा हो गया है.
  9. जब पूरे प्राप्तकर्ता ब्लॉक समाप्त हो गया है, तो प्राप्तकर्ता ब्लॉक धारक में शिकंजा ढीला. सेंकना 40 मिनट के लिए ब्लॉक 42 में डिग्री सेल्सियस. सेक्शनिंग एक गिलास स्लाइड पर नीचे का सामना करना पड़ क्षेत्र के साथ ब्लॉक रखो. ब्लॉक के साथ एक टेस्ट ट्यूब धारक (या अन्य उपयुक्त निर्माण) और टी में जगह के शीर्ष पर कांच स्लाइड प्लेसवह पहले से गरम ओवन. पाक के बाद, ओवन से टेस्ट ट्यूब धारक को हटा दें और धीरे से गिलास स्लाइड पथपाकर द्वारा ब्लॉक की सतह समतल.
  10. 10 मिनट के लिए एक ठंडा थाली पर गिलास स्लाइड के साथ ब्लॉक रखें.
    TMA भर में प्रतिनिधि ऊतक प्रत्येक 50 वें खंड पर एक गुणवत्ता नियंत्रण सुनिश्चित किया जाता है.

3. कैसे धारा tmas (2 एनिमेशन) के लिए.

  1. अनुभाग अंतरण प्रणाली (एचएम 355S, Microm) के साथ एक सूक्ष्म तक्षणी का उपयोग करके 4 माइक्रोन मोटी वर्गों कट. प्रणाली सभी मौजूदा रोटरी microtomes के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रणाली एकीकृत हस्तांतरण पुल, एक गर्म पानी के स्नान और एक नियंत्रण इकाई के साथ एक ब्लेड वाहक होते हैं. ब्लेड से वर्गों गीला स्थानांतरण सतह पर पानी के स्नान में एक हस्तांतरण के पुल के माध्यम से सरकना.
  2. वर्गों पानी के स्नान से लिया जाना चाहिए तुरंत बाद वे बाहर फैला है, संवेदनशील ऊतक स्पॉट (eg. स्तन और मस्तिष्क की तरह लिपिड अमीर ऊतकों) के पिघलने से बचने के. पीएलएCE के एक superfrost गिलास स्लाइड पर अनुभाग. समय वर्गों पानी में छोड़ा जा सकता है इस्तेमाल किया लच्छेदार और पानी का तापमान तेल के प्रकार पर निर्भर करता है. हमारी प्रयोगशाला से HistoLab उत्पाद अटल बिहारी, जो की 56-58 डिग्री सेल्सियस सी और हम 37-39 के एक पानी स्नान तापमान की सिफारिश ° पिघल बिंदु है पैराफिन मोम का उपयोग करें
  3. एक स्लाइड धारक में रात पर कमरे के तापमान (आर टी) में सुखाने के लिए स्लाइड रखें.
  4. स्लाइड 50 डिग्री सेल्सियस में 12-24 घंटे के लिए पकाया जाता है. अनुसूचित जनजातियों आप एक ब्रश उदाहरण का उपयोग करके ब्लेड से एक पानी स्नान करने के लिए मैन्युअल अनुभाग परिवहन के बिना एक microtom का प्रयोग.

4. टेस्ट और immunohistochemistry के लिए टाइट्रेट करना प्रक्रिया (3 एनिमेशन)

प्रत्येक एंटीबॉडी विशेष रूप से डिजाइन ऊतकों और विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं का एक मिश्रण युक्त tmas का उपयोग कर एक मानकीकृत परीक्षण प्रक्रिया के अधीन है. उद्देश्य प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए एक व्यक्ति और अनुकूलित Immunostaining के प्रोटोकॉल का आकलन है. शुरू में एक कमजोर पड़ने, चींटी पर आधारितibody स्टॉक एकाग्रता प्राथमिक एंटीबॉडी का परीक्षण किया है. इस परीक्षण धुंधला के परिणाम के लिए प्रोटोकॉल के आगे और dilutions के अनुकूलन का मार्गदर्शन करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

  1. और xylene और वर्गीकृत आसुत पानी के लिए इथेनॉल में deparaffinization जलयोजन को पूर्व Immunostaining के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं.
  2. एक अवरुद्ध करने के लिए कदम endogeneous peroxidase बुझाने के लिए 0.3% में किया जाता है, 95% इथेनॉल में 5 मिनट के लिए एच 2 2 हे.
  3. गर्मी प्रेरित मिलान रिट्रीवल (HIER) के एक पुनर्प्राप्ति बफर 6 पीएच में किया जाता है, पर दाब बॉयलर (Decloaking कक्ष, Biocare मेडिकल) 4 मिनट के लिए गर्मी स्रोत के रूप में 125 ° सी का उपयोग के बाद उबलते पूरा, स्लाइड दाब बॉयलर में रहते हैं और कर रहे हैं करने के लिए 90 शांत करने की अनुमति दी डिग्री सेल्सियस HIER के लिए कुल प्रसंस्करण समय लगभग 45 मिनट है.
  4. यदि कोई निर्णायक परिणाम प्रारंभिक परीक्षा में प्राप्त है, और परीक्षण मनाया धुंधला 5 6 पैटर्न पर आधारित कर रहे हैं. एक प्रायोगिक अध्ययन, HPA उच्च throughput सेट अप के भीतर पता चला,कि सबसे उपयोगी प्रतिजन पुनर्प्राप्ति जहां HIER 6 पीएच, लेकिन proteinase, माइक्रोवेव, और अधिक या कम पीएच के साथ बफर में उबलते के साथ पूर्व ऊष्मायन जैसे अन्य पुनर्प्राप्ति विधियों पाठ्यक्रम का इस्तेमाल किया जा सकता है. आईएचसी हालत जैसे बदल प्रतिरक्षी ऊष्मायन बार, एंटीबॉडी dilutions और (थपका) Diaminobenzidine ऊष्मायन बार बदल द्वारा धुंधला हो जाना पैटर्न और अधिक निर्णायक परिणाम दे सकते हैं.

5. धुंधला कार्यक्रम, 480 Autostainer (थर्मो फिशर साइंटिफिक)

सभी incubations आरटी पर किया जाता है और इस प्रोटोकॉल भी वही अभिकर्मकों के साथ एक मैनुअल स्थापना के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

  1. धो बफर में कुल्ला.
  2. अल्ट्रा वी ब्लॉक के साथ 5 मिनट के लिए ऊष्मायन.
  3. धो बफर में कुल्ला.
  4. 30 मिनट के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन.
  5. धो बफर (X2) में कुल्ला.
  6. लेबल 30 मिनट के लिए घोड़े की मूली peroxidase बहुलक के साथ ऊष्मायन.
  7. धो बफर (X2) में कुल्ला.
  8. थपका समाधान में विकासशील10 मिनट के लिए.
  9. धो बफर (X2) में कुल्ला.
  10. 5 मिनट के लिए * Mayers hematoxylin में Counterstaining. जब एक प्रगतिशील धुंधला विधि का उपयोग कर Mayers hematoxylin जैसे तीव्रता पर निर्भर करता है और कोई भेदभाव आवश्यक है. एक प्रतिगामी धुंधला विधि जैसे हैरिस hematoxylin ऊतकों से अतिरिक्त डाई हटाने के क्रम में करने के लिए एक संरचना दबाव का चिह्न भेदभाव की आवश्यकता है.
  11. नल का पानी * में कुल्ला.
  12. लिथियम कार्बोनेट पानी में कुल्ला, संतृप्त समाधान से 1 मिनट के लिए * 01:05 पतला.
  13. * 5 मिनट के लिए पानी के नल में कुल्ला.
  14. स्लाइड वर्गीकृत इथेनॉल में निर्जलित हैं और स्लाइड (PERTEX, Histolab) coverslipped कर रहे हैं

सभी अभिकर्मकों स्लाइड प्रति 300 μl की मात्रा पर लागू कर रहे हैं.
* 10-14 कदम एक histostaining साधन (Autostainer एक्स्ट्रा लार्ज, Leica) में किया जाता है और coverslipping अतिरिक्त एक coverslipper प्रणाली (स्वचालित कांच coverslipper CV5030, Leica) में किया जाता है.

6. कैसे स्कैन के लिएएक स्लाइड

स्लाइड स्कैनिंग की विधि डिजिटल स्कैनर का उपयोग किया जा रहा पर निर्भर है, केवल इस प्रोटोकॉल को परिभाषित करता है कि कैसे एक स्वचालित स्कैनिंग प्रणाली Aperio XT (Aperio प्रौद्योगिकी) का उपयोग कर स्लाइड स्कैन करने के लिए. मानव प्रोटीन एटलस सेट अप के लिए 20x बढ़ाई ऊतक और कोशिकाओं के लिए 40x का उपयोग किया जाता है. स्वचालित स्कैनिंग ध्यान ऊतक की विविधता और विभिन्न ऊतकों TMA में शामिल की संख्या के कारण समस्याओं का सामना कर सकता है.

  1. स्वच्छ से गंदगी, गोंद गिलास स्लाइड और coverslip और खंड के बीच हवाई बुलबुले के लिए जाँच करें. हवा बुलबुले गोड़ा स्लाइड के मामले में.
  2. एक रैक में रखो स्लाइड और डिजिटल स्कैनर में रैक जगह है. 20x बढ़ाई TMA स्कैन समय लगभग 6 मिनट है. Aperio से एक सॉफ्टवेयर के हित के क्षेत्र का चयन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. फोकस बिंदु चयन स्वत: सॉफ्टवेयर के भीतर किया जाता है. मैन्युअल रूप से स्कैन क्षेत्र और ध्यान केंद्रित अंक का चयन भी संभव है.
  3. छवि घंटे के बादके रूप में उत्पन्न किया गया यह मूल्यांकन और आईएचसी धुंधला की टिप्पणी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. छवियाँ प्रयोग का एक परिणाम के फ़ाइल के रूप में रहते हैं और विचार विमर्श के लिए सहयोगियों को वितरित किया जा सकता है और आगे डेटा प्रकाशित करने के लिए इस्तेमाल किया. छवियों में Aperio से एक आज़ादी से उपलब्ध सॉफ्टवेयर में देखा जा सकता है.

7. अपने पसंदीदा प्रोटीन के लिए मानव प्रोटीन एटलस में खोज कैसे करें

  1. ब्राउज़ www.proteinatlas.org.
  2. अपने पसंदीदा प्रोटीन, Ensembl आईडी, UniProt परिग्रहण संख्या या HGNC नाम जैसे इंसुलिन का नाम दर्ज करें.
  3. सारांश पृष्ठ पर दर्ज करें और सामान्य ऊतक और अंग सारांश के लिए नीचे स्क्रॉल. सिंहावलोकन अग्न्याशय में प्रोटीन अभिव्यक्ति से पता चलता है.
  4. अधिक ऊतक डेटा "पर क्लिक करें. आप सामान्य ऊतकों में प्रवेश देखने के लिए जहां आप देख सकते हैं सभी ऊतकों के अंग के अनुसार क्रमबद्ध शामिल.
  5. अग्न्याशय पर 3 एक ही प्रोटीन की ओर निर्देशित एंटीबॉडी के लिए आईएचसी परिणाम देखने के लिए क्लिक करें. एक ही देखनेछवि पर क्लिक करें अग्न्याशय का लिए gh संकल्प छवि.
  6. कैंसर ऊतकों, कोशिकाओं और मानव प्रोटीन एटलस के भीतर आगे की मान्यता डेटा में प्रोटीन अभिव्यक्ति के बारे में अतिरिक्त जानकारी मानव प्रोटीन एटलस वेबसाइट ब्राउज़िंग के द्वारा पाया जा सकता है.

8. प्रतिनिधि परिणाम

एक एनीमेशन के लिए ऊतक माइक्रोएरे उत्पादन के लिए ऊतकों को तैयार. 1 एनिमेशन देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

2 एनिमेशन कैसे अनुभाग tmas. 2 एनिमेशन देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

एनीमेशन 3. में immunohistochemistry तकनीक का वर्णन है. 3 एनिमेशन देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

चित्रा 1
चित्रा 1 मानव प्रोटीन एटलस अपसला भीतर प्रक्रिया की समग्र योजना.

चित्रा 2
चित्रा दाता 2. ऊतक कोर के मानकीकृत लंबाई के लिए चिह्नित ख़ंजर 4.5 मिमी उदा.

चित्रा 3
चित्रा 3 मैनुअल ऊतक microarrayer.

चित्रा 4
चित्रा 4 उत्पादन tmas के विभिन्न गुणवत्ता के उदाहरण हैं. (ए) एक सीधे और ठीक पंक्तियों और स्तंभों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से तेल के किनारे के बीच पर्याप्त स्थान के साथ गठबंधन TMA. (बी) कुछ कोर के साथ एक TMA भी संभावित कठिनाइयों में जिसके परिणामस्वरूप जब सेक्शनिंग किनारे के करीब. (सी) TMA कि टी के लिए बेक किया हुआ हैऊ लंबे समय से सही टेम्पलेट के बिना एक ढह TMA में जिसके परिणामस्वरूप.

चित्रा 5
चित्रा 5 Hematoxylin और लाल भामसान रंग दाग tmas. (ए) सीधे और गठबंधन स्तंभों और पंक्तियों के साथ एक अच्छी तरह से कटौती अनुभाग. एक बुरा या गंदा ब्लेड का उपयोग करना (बी) के बंटवारे या संकुचित वर्गों (सी) में परिणाम सकता है.

चित्रा 6
चित्रा 6 एंटीबॉडी का अनुमापन. (ए) केंद्र कोशिकाओं रिएक्शन लिम्फ नोड में एक बेहतर titrated पृष्ठभूमि के बिना एक विशिष्ट cytoplasmic धुंधला (भूरे रंग में दिखाया गया है) में जिसके परिणामस्वरूप एंटीबॉडी से पता चलता है. (बी) ऊतक अनुभाग कमजोर धुंधला से पता चलता है. नकारात्मक या कमजोर धुंधला पाया जाता है जब प्राथमिक एंटीबॉडी की एकाग्रता बहुत कम है या यदि लक्ष्य प्रोटीन immunostained ऊतकों में मौजूद नहीं है है. (सी) ऊतक अनुभाग प्राथमिक एंटीबॉडी के बहुत उच्च एकाग्रता के उपयोग के कारण overstained है. घसन्दूक subcellular स्थान से बाहर हो जाना करने के लिए, जेट और झूठी धनात्मकता पार के कारण का निर्धारण करने में कठिनाई में रंग का परिणाम है.

Discussion

Immunohistochemistry द्वारा अब तक tmas के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया आवेदन है. आईएचसी और tmas के संयोजन के कई अलग सेटिंग्स में इस्तेमाल किया जा सकता है, उदाहरण के लिए प्रोटीन 7 8 ऊतकों में अभिव्यक्ति पैटर्न और 10 9 कोशिकाओं, biomarker खोज बड़े रोगी साथियों 11 12 और अधिक बुनियादी ट्यूमर जीव विज्ञान से ऊतकों के नमूनों पर आधारित अध्ययन के उच्च throughput स्क्रीनिंग अध्ययन, सहित विभिन्न phenotypes / जीनोटाइप, भेदभाव चरणों, प्रगति और 13 मेटास्टेसिस. Tmas का उपयोग करने का एक लाभ यह है कि बड़े साथियों से सामग्री एक समय में विश्लेषण किया जा सकता है, दोनों मूल्यवान जैविक सामग्री की बचत और यह सुनिश्चित करने के अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रयोगों. इसके अलावा, TMA प्रौद्योगिकी के उपयोग अभिकर्मक लागत और प्रयोगशाला प्रसंस्करण समय पर बचाता है. के रूप में एक TMA केवल ऊतक के एक सीमित मात्रा में होता है, ऊतक विविधता है एक मुद्दा है. ऊतक और को संबोधित किया प्रश्नों के प्रकार पर निर्भर करता है, कई नमूने specime ही जरूरत हो सकती हैएन. ट्यूमर ऊतकों के लिए, प्रत्येक नमूना से दो से चार कोर के उपयोग के रूप में यह पूरे ऊतक 13 14 वर्गों के प्रतिनिधित्व में एक सटीकता के एक उच्च डिग्री में परिणाम दिखाया गया है की सिफारिश की है. ऊतक संरचना के आधार पर घूंसे का व्यास 2 से 0.6 मिमी मिमी से लेकर समायोजित किया जा सकता है. ऊतकों जटिल और दोनों कई अलग अलग सेल प्रकार, संरचना और अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स से बना रहे हैं. प्रत्येक अलग ऊतक वसा की चर राशि युक्त प्रकार की संरचना, रक्त वाहिकाओं, संयोजी ऊतक, उपास्थि आदि, छिद्रण और अलग कोर के लिए इकट्ठा करने की जरूरत दबाव को प्रभावित करेगा. यह महत्व का इसलिए है इरादा प्रयोगों के लिए परिभाषित ऊतकों के साथ एक TMA निर्माण से पहले प्रक्रिया के सभी चरणों में, सामग्री है कि किसी भी मूल्य का नहीं है पर अभ्यास.

जब एक TMA ब्लॉक के भीतर विभिन्न ऊतकों की एक किस्म सेक्शनिंग ब्लॉक की संरचना के लिए उच्च गुणवत्ता वाले वर्गों को प्राप्त करने की क्षमता को प्रभावित कर सकता है. Certain ऊतकों, जैसे त्वचा, अस्थि मज्जा, वसा मस्तिष्क, और स्तन, TMA बनावट में अंतर प्रभावशाली कैसे वर्गों नहाने के पानी में बाहर खिंचाव के प्रभाव के कारण कठिन ब्लॉक के सेक्शनिंग प्रस्तुत करना और विभिन्न कठोरता कैसे ब्लेड आदि से कट जाता है इसलिए यह इसी तरह की सुविधाओं के साथ समूह के ऊतकों के लिए सिफारिश की एक TMA में लिपिड अमीर ऊतक जैसे, जब लागू. कैंसर ऊतकों का बहुमत इस अर्थ में हैं समरूप है, जो कैंसर tmas की सेक्शनिंग की सुविधा. माइक्रोएरे कोर स्थिर करने के लिए एक वैकल्पिक विधि सेक्शनिंग जब ऊतकों की विषम प्रकार के साथ एक TMA से निपटने के नियोजित किया जा सकता है. एक चिपकने वाली टेप के उपयोग में sectioned TMA में कोर और बाहर गिर नुकसान से बचने के लिए सहायक हो सकता है. चिपकने वाली टेप का उपयोग सावधानी से नियोजित किया जाना चाहिए, के बाद से टेप sectioned कोर की मोटाई को प्रभावित करने और बाद में भी कर सकते हैं आईएचसी 15 धुंधला का परिणाम है. मानव प्रोटीन एटलस में स्थापना 9x8 TMA टेम्पलेट (मार्कर को छोड़कर) कोर की गिरफ्तारीई इस्तेमाल किया. यह महत्व का है वर्गों के अधिक से अधिक संख्या में प्राप्त करने और रखने सभी ब्लॉक भर प्रतिनिधित्व ऊतकों. अभिकर्मकों और स्कैनिंग समय बचाने के लिए, 2 वर्गों 9x8 की एक अधिकतम टेम्पलेट की अनुमति एक गिलास स्लाइड पर रखा जाता है.

प्रोटीन जानकारी के लिए प्रमुख भंडार, यूनिवर्सल प्रोटीन संसाधन 16 20.300 लगभग समीक्षा मानव प्रोटीन प्रविष्टियों, जिनमें से केवल लगभग 66% प्रोटीन के स्तर पर सबूत है शामिल हैं. इसके अलावा जीन के लिए जो प्रोटीन के स्तर पर अस्तित्व का सबूत है की बहुमत के लिए, वहाँ दुर्लभ या प्रोटीन समारोह और अभिव्यक्ति के वितरण पर कोई जानकारी नहीं है. भविष्य के लिए एक महत्वपूर्ण चुनौती वितरण पैटर्न का विश्लेषण और मानव ऊतक के विभिन्न प्रकार में इन अज्ञात प्रोटीन के रिश्तेदार बहुतायत है. Uniprot, Ensembl, PubMed के से प्रकाशित डेटा के रूप में डेटाबेस से जानकारी एक गाइड के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है स्थापित करने के लिए अगर immunohistochemical धुंधला पैटर्न के लिए एंटीबॉडी का उपयोगवार्ड इरादा लक्ष्य प्रोटीन की वास्तविक प्रोटीन प्रोफाइल अज्ञात प्रोटीन का प्रतिनिधित्व करते हैं. इसके अलावा, कई अन्य मान्यता रणनीतियों प्रतिरक्षी कार्यक्षमता को सुनिश्चित करने की जरूरत है उदाहरण एंटीबॉडी प्रोटीन, पश्चिमी धब्बा, immunofluorescence, इम्युनो - तेज़ी और पुल से नीचे प्रयोगों में कार्यक्षमता के लिए,. शायद प्रतिरक्षी कार्यक्षमता के सत्यापन के लिए सबसे महत्वपूर्ण उपकरण के लिए बनती एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए है, यानी एक ही लक्ष्य प्रोटीन पर दो अलग एंटीबॉडी अलग, गैर अतिव्यापी epitopes के खिलाफ उठाया, परख - विशेष 17 परिणाम की तुलना.

संकलित सूचना के आधार पर, एंटीबॉडी परीक्षण किया है और कर रहे हैं आईएचसी मानकों और परीक्षण और मानव प्रोटीन एटलस परियोजना में 35.000 एंटीबॉडी से अधिक मान्य से अनुभव के अनुसार titrated. अधिक प्रोटीन प्रोफाइल के साथ सभी जीनों के 20% के लिए, बनती एंटीबॉडी (2 या अधिक एक ही प्रोटीन पर गैर अतिव्यापी epitopes की ओर एंटीबॉडी) से डेटा के लिए एक बेहतरीन esti निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैइसी प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न का दोस्त. बनती एंटीबॉडी विशिष्ट immunohistochemistry आधारित प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न को मान्य करने के लिए एक अंतिम रणनीति प्रदान करते हैं. इस रणनीति के मूल्यवान है क्योंकि भीड़ अलग मूल स्क्रीनिंग में शामिल के ऊतकों के पार जेट के लिए जोखिम बढ़ जाती है. यह भी उल्लेखनीय है कि कुछ ऊतकों में सामान्य हैं जैसे मैक्रोफेज, चिकनी पेशी, गुर्दे में बाहर tubules और जिगर में hepatocytes के धुंधला पृष्ठभूमि दिखाने प्रवण जाना चाहिए. अतिरिक्त मुद्दों पर विचार के लिए अभिलेखीय सामग्री से लिया ऊतकों के लिए ऊतक प्रसंस्करण की तकनीक में समय के साथ, जो विविधताओं झूठी नकारात्मक या अनुचित सकारात्मक आईएचसी धुंधला पैटर्न में परिणाम कर सकते हैं शामिल. इस घटना का भी बहुत बड़ा वर्ग विश्लेषण में सामना करना पड़ा है. दोनों नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण महत्वपूर्ण हैं और जब भी संभव इस्तेमाल किया जाना चाहिए. कार्यात्मक विश्लेषण, मजबूर अभिव्यक्ति के साथ सेल लाइनों और इसी tr के विशिष्ट दस्तक नीचे गहरे अध्ययन के लिएanscripts (siRNA प्रौद्योगिकी) नियंत्रण बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. आईएचसी में इष्टतम परिणामों के लिए, यह महत्वपूर्ण है के लिए परीक्षण और प्रतिजन पुनर्प्राप्ति सिस्टम का उपयोग करें, क्योंकि formalin निर्धारण लाती है विभिन्न रासायनिक संशोधनों पार से जोड़ने, शिफ़ 18 प्रतिजन मास्किंग अड्डों की hydrolysis जैसे.

अंत में, एंटीबॉडी आधारित TMA प्रौद्योगिकी और आईएचसी रोजगार प्रोटिओमिक्स प्रोटीन अभिव्यक्ति एक बड़े पैमाने पर डेटा उत्पन्न करने के लिए एक शक्तिशाली रणनीति है. सामान्य मानव ऊतकों और कैंसर में मानव प्रोटीन अभिव्यक्ति का एक नक्शा बनाने के मानव प्रोटीन एटलस परियोजना को स्थापित किया गया है. इस परियोजना का उद्देश्य 2015 तक एक व्यापक मानव प्रोटीन एटलस के एक पहला मसौदा प्रस्तुत है. सामान्य अंगों और ऊतकों में प्रोटीन प्रोफाइल उपलब्ध कराने के अलावा, इस प्रयास भी नैदानिक ​​biomarker खोज के प्रयासों सहित जैव चिकित्सा अनुसंधान परियोजनाओं के लिए एक प्रारंभिक बिंदु प्रदान करता है. अंतिम लक्ष्य मानव जीनोम अनुक्रम के शीर्ष पर एक अगली सूचना परत जोड़ने के लिए है कि वाईविभिन्न राज्यों रोग के अंतर्निहित जीव विज्ञान की एक गहरी समझ के लिए महत्वपूर्ण हो जाएगा, और उपन्यास निदान और उपचार उपकरण विकसित करने के लिए एक आधार प्रदान करते हैं.

Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgements

इस काम नूट और ऐलिस Wallenberg नींव से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. अपसला, स्टॉकहोम, और भारत में मानव प्रोटीन एटलस केन्द्रों की पूरी कर्मचारी उनके मानव प्रोटीन एटलस उत्पन्न करने के प्रयासों के लिए स्वीकार कर रहे हैं. लेखकों के लिए विशेष रूप से TMA उत्पादन के साथ सहायता के लिए सहायता के लिए फ्रैंक Hammar और Sofie Gustafsson तस्वीरें और Elené के Karlberg के साथ शुक्रिया अदा करना चाहता हूँ जब फिल्माने.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wash buffer Thermo Fisher Scientific, Inc. TA-999-TT
Citrate buffer pH6 Thermo Fisher Scientific, Inc. TA-250-Pm1X
Antibody diluent Thermo Fisher Scientific, Inc. TA-125-UD
UltraVision LP HRP polymer Thermo Fisher Scientific, Inc. TL-125-HL
DAB plus substrate system Thermo Fisher Scientific, Inc. TA-125-HDX
Ultra V Block Thermo Fisher Scientific, Inc. TA-125-UB
Primary Antibody Enhancer Thermo Fisher Scientific, Inc. TL-125-PB
Mayers hematoxylin Histolab 01820
PERTEX Histolab 00871.0500
Manual tissue micro arrayer Estigen, Beecher Instrument MTA-1
Waterfall microtome Thermo Fisher Scientific, Inc. Microm HM 355S
Automated image scanner Aperio Technologies XT
Automated slide staining system Thermo Fisher Scientific, Inc. Autostainer 480S-2D
Automated slide staining system for deparafinization and dehydration Leica Microsystems Autostainer XL
Automated glass coverslipper Leica Microsystems CV5030
Decloaking chamber Biocare Medical DC2008INTEL

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References

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