Biology
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3 डी सफेद वसा ऊतक संरचना के दृश्य का उपयोग कर पूरे माउंट धुंधला
Chapters
Summary November 17th, 2018
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वर्तमान अध्ययन का ध्यान वसा ऊतक वास्तुकला और सेलुलर घटक के 3 डी इमेजिंग के लिए एक आदर्श विधि के रूप में पूरे माउंट immunostaining और दृश्य तकनीक का प्रदर्शन है ।
Transcript
यह विधि आदिपोज जीव विज्ञान क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रश्नों के उत्तर देने में मदद कर सकती है, जैसे कि कैसे इंटरसेलुलर इंटरैक्शन और एडीपोज ऊतक शरीर विज्ञान उपवास और मोटापे जैसी विभिन्न मेटाबोलिक स्थितियों पर बदलते हैं। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह मूल एडीपोज 3 डी संरचना को बेहतर ढंग से संरक्षित करता है और पारंपरिक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए आमतौर पर आवश्यक लंबे प्रसंस्करण चरणों से बचाता है। यद्यपि यह विधि आदिपोस ऊतक की संरचना में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है, लेकिन मस्तिष्क को पूरे माउंट धुंधला करके, तंत्रिका तंत्र जैसे अन्य अंग प्रणालियों पर भी लागू किया जा सकता है।
आम तौर पर, इस विधि के लिए नए व्यक्ति संपत्ति ऊतक साइटों को प्राप्त करने में कठिनाइयों, उचित निर्धारण अवधि और इष्टतम एंटीबॉडी सांद्रता खोजने के कारण संघर्ष करेंगे। विच्छेदन पूरा होने के बाद, एक घंटे के लिए बर्फ से कमरे के तापमान में 1% पैराफॉर्मलडिहाइड में ऊतक नमूनों युक्त पकवान स्थानांतरित करें। फिर ऊतकों को जल्दी धोने के लिए या तो 12 या 24-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट में स्थानांतरित करें।
यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि पूरे माउंट धुंधला प्रक्रिया विच्छेदन के तुरंत बाद शुरू करना चाहिए और प्रत्येक चरण के बीच कोई ठहराव अंक नहीं हैं। पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 20 और 25 झुकाव प्रति मिनट के बीच एक गति के साथ 22 डिग्री पर झुका एक शेखर पर PBS-0.3T के साथ ऊतकों को धोएं । इस धो को दो अतिरिक्त बार दोहराएं।
इसके बाद, 5% पशु सीरम युक्त बफर को अवरुद्ध करने के लगभग 0.5 मिलीलीटर जोड़ें। एक घंटे के लिए पिछली स्थितियों का उपयोग कर एक शेखर पर थाली इनक्यूबेट। अवरुद्ध समाधान को एएसपिरेट करें, और प्रत्येक कुएं में 1% पशु सीरम के साथ पीबीएस-0.3T में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के मिलीलीटर पर जोड़ें।
थाली को रात भर एक शेकर पर चार डिग्री सेल्सियस पर 22 डिग्री के झुकाव और प्रति मिनट 20 से 25 झुकाव की गति के साथ इनक्यूबेट करें । अगले दिन, पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ऊतकों को धोने के लिए पीबीएस-0.3T का उपयोग करें। इस धो को दो अतिरिक्त बार दोहराएं।
फिर, प्रत्येक अच्छी तरह से उपयुक्त और पतला माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 0.5 और एक मिलीलीटर के बीच जोड़ें। एल्यूमीनियम पन्नी में थाली लपेटें और यह एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एक शेखर पर इनक्यूबेट । इसके बाद, प्लेट को दो बार पीबीएस-0.3T के साथ कमरे के तापमान पर पांच मिनट प्रति धोने के लिए धोएं।
यदि तटस्थ लिपिड दाग के दौरान तरल बूंदों के दृश्य की आवश्यकता होती है, तो पांच मिनट तक चलने वाले प्रत्येक धोने के साथ 1x पीबीएस के साथ दो बार धोएं। PBS में पतला तटस्थ लिपिड दाग जोड़ें, और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट । इमेजिंग शुरू करने के लिए, 60 मिलीमीटर ग्लास कवर स्लिप द्वारा 24 पर ऊतक फ्लैट बिछाने के लिए संदंश का उपयोग करें।
यदि डीएपीआई के साथ नाभिक धुंधला वांछित है, तो एक बढ़ते माध्यम की एक से दो बूंदें जोड़ें जिसमें ऊतक को पूरी तरह से जलमग्न करने और इसे सूखने से रोकने के लिए DAPI शामिल है। इसके बाद स्लाइड को उल्टे कॉन्फोकल लेजर माइक्रोस्कोप सिस्टम पर रखें। कई फोकल विमानों पर पूरे माउंट दाग ऊतक की छवियों को प्राप्त करने के लिए, वांछित आवर्धन पर चार से छह माइक्रोमीटर के कदम आकार के साथ गहराई में 100 से 150 माइक्रोमीटर के जेड स्टैक प्रदर्शन करते हैं।
इस अध्ययन में, पूरे माउंट धुंधला ऊतक वास्तुकला को संरक्षित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। कई प्रसंस्करण चरणों और खंडों को शामिल करने वाले तरीकों के विपरीत, जिससे एडीपोज ऊतक आकृति विज्ञान का विरूपण हो सकता है, पूरे माउंट धुंधला विधि आदिपोसाइट्स की आकृति विज्ञान को संरक्षित कर सकती है, परिणामों की व्याख्या करते समय सटीकता सुनिश्चित कर सकती है। एडिपोस ऊतक के अतिसत्पारण से फिक्सेटिव-प्रेरित फ्लोरेसेंस होता है, जिसे समान क्षेत्रों को ओवरलैप करके इंगित किया जा सकता है, जैसे कि टायरोसिन हाइड्रोक्सिलेज़ और पेकैम-1 संकेतों में यहां देखा जाता है।
ठीक से तय, पूरे माउंट दाग नमूने, हालांकि, अलग और अलग संकेत दिखाते हैं, यह दर्शाता है कि ये संकेत ऑटोफ्लोरेसेंस नहीं हैं। इमेजिंग पूरे माउंट दाग आदिपोज ऊतक विभिन्न प्रयोगात्मक परिस्थितियों में रूपात्मक परिवर्तनों की मात्रा के लिए अनुमति देता है। विशेष रूप से, एडीपोज ऊतक अत्यधिक संवहनी है, जो ऊर्जा स्तर में तेजी से परिवर्तन पर मेटाबोलिक होमोसेस्टेसिस मध्यस्थता में महत्वपूर्ण है।
उदाहरण के लिए, C57 काले 6J चूहों, जो उपवास के 24 घंटे से गुजरते हैं, एक काफी छोटे एडीपोसाइट आकार को प्रदर्शित करते हैं, जो लिपोलिसिस को इंगित करता है, और लगातार खिलाए गए चूहों की तुलना में ऊंचा रक्त वाहिका घनत्व में एक प्रवृत्ति। iDISCO + के साथ एडिपोस ऊतकों को साफ करने से एडीपोज ऊतक ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी हो जाते हैं। ऊतक समाशोधन के माध्यम से चले गए एडिपोस ऊतकों की इम्यूनोलबेलिंग एक ही आवर्धन पर ऊतक समाशोधन के बिना पूरे माउंट धुंधला में मनाया की तुलना में बहुत सघन तंत्रिका arborization से पता चलता है ।
इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, पीएफए में कमरे के तापमान पर एक घंटे से अधिक समय तक अपने नमूनों को ओवरफिक्स न करना याद रखना महत्वपूर्ण है, अन्यथा, इससे पृष्ठभूमि ऑटोफ्लोरेसेंस में वृद्धि होगी। हालांकि, अगर नमूनों को चार डिग्री सेल्सियस पर तय किया जाता है तो यह निर्धारण अवधि लंबे समय तक हो सकती है । इस प्रक्रिया के बाद, इमेजजे का उपयोग करके क्वांटिफिकेशन जैसे अन्य तरीकों को अतिरिक्त प्रश्नों का उत्तर देने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि कैसे सेलुलर वास्तुकला, जैसे एडिपोसिट साइटें और रक्त वाहिका घनत्व, विभिन्न शारीरिक स्थितियों के जवाब में बदलते हैं।
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