Author Produced

Neuroblast Test: Akım Sitometri Kullanımı Farklılaşan Nöral Kök Hücre Döl nöronal Progenitör Hücrelerinin üretilmesi ve zenginleştirilmesi için bir Testi

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Bu video protokolü akış sitometrisi teknolojisi kullanılarak fiziksel (boyutu ve iç boyu) ve floresan özelliklerine bağlı olarak kök sinir hücrelerini yenilenebilir bir kaynaktan (NSC'lerde) den nöronal progenitör hücre üretimi ve daha sonra saflaştırma için yeni bir yöntem gösterilmektedir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (62), e3712, doi:10.3791/3712 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Nöral kök hücreler (NSC'lerde) izole ve genişletilebilir büyük ölçekli, neurosphere testi kullanılarak ve merkezi sinir sistemi (MSS) üç ana hücre tiplerine diferansiye; yani, astrositler, oligodendrosit ve nöronlar. Bu özellikler nöral kök ve progenitör hücreler, uyuşturucu taraması, neurotoxicology ve elektrofizyoloji gibi in vitro çalışmalar ve birçok nörolojik hastalıklarda hücre replasman tedavisi için kullanılması için hücre paha biçilmez bir yenilenebilir kaynak haline getiriyor. Ancak pratikte, MGK döl, nöronlar ve oligodendrosit düşük üretim ve farklılaşma klinik uygulamaları sınırlamak takip astrositlerin baskın heterojen. Burada, floresans aktive hücre ayırma (FACS) teknolojisi kullanılarak mürin NSC soyu ile olgunlaşmamış nöronların kuşak ve sonraki temizleme için yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntemi kullanarak, zenginleştirilmiş nöronal progenitör hücre popülasyonu zekâ elde edilebilirherhangi bir fark astrosit ve iyi niyetli MGK kirlenme olduğu görüldü. Prosedürü MGK döl izole ve akım sitometri teknolojisini kullanarak fiziksel (boyut ve iç karmaşıklık) ve floresan özelliklerine göre olgunlaşmamış nöronal hücrelerin izolasyonu ve zenginleşmesi ile takip neurosphere testi kullanılarak E14 fare ganglionik tubera, genişletilmiş farklılaşma içerir. Genel olarak, MGK döl ayırt etmek neurospheres ve 6-8 gün üretmek için 5-7 gün sürer ve çok olgunlaşmamış nöronal hücrelerin saf izole.

Protocol

1. Temel Hücre Kültürü ile Devam Etmeden Önce Kurma

  1. NeuroCult NSC Bazal Orta ve NeuroCult NSC Proliferation Takviyeler tam NSC orta yapmak için, sırası ile, 9:1 oranında karıştırılmaktadır.
  2. Bir 37 ° C'de su banyosu orta ısınması için kullanılır.
  3. Isıyla inaktive fetal buzağı serumu (FCS), uygun miktarda çözdürüldü.
  4. Epidermal büyüme faktörü (10 mcg / ml EGF), temel fibroblast büyüme faktörü (10 mcg / ml b-FGF) ve fosfat% 0.2 heparin solüsyonu dahil stok büyüme faktörü çözümleri uygun miktarda tuz (PBS) çözdürülen tamponlu.
  5. Doku kültürü matara (T25, T75 veya & T175) MGK genişlemesi ve farklılaşması için gereklidir.
  6. Doku kültürü 96 ve 24 kuyucuğu tedavi ve cam lamelleri sıralanmış hücreleri kaplama için gereklidir.

2. NSC'lerde izolasyonu ve Genişleme (Pasajlanması)

  1. Nöral kök ve ataları fare b izole ve genişletilmişAyrı bir protokol 1, 2 3'te tarif edildiği gibi yağmura.
  2. Neurospheres (birincil veya geçişli neurospheres) altkültür (çapı 150-200 mikron) için hazır olduğunuzda, orta içeren küreler uygun bir boyut steril doku kültürü tüpüne aktarılır ve 5 dakika 800 rpm (110 g) santrifüj edilir oda sıcaklığında.
  3. Süpernatan kaldırılır ve orta küreler önceden ısıtılmış% 0.05 tripsin-EDTA 1 ml içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiştir.
  4. 2-3 dakika için 37 ° C'de su banyosunda inkübasyondan sonra, soya fasulyesi tripsin inhibitörü eşit hacimde tripsin aktivitesi durdurmak için hücre süspansiyonu ilave edilir.
  5. Tripsin tamamen inaktive edilmiş olduğundan emin olmak için, hücre süspansiyonu hafifçe aşağı yukarı 3-5 kez pipetle ve.
  6. 5 dakika boyunca 800 rpm (110 g) santrifüj sonra, süpernatan kaldırılır ve hücre tam NSC ortamın 1 ml içinde tekrar süspanse edilir.
  7. Hücre süspansiyonu 10μl trypa 90 ul ile karıştırılırn mavi bir hücre sayımı yapmak.
    Not: Diğer uygun hücre dilüsyonları de kullanılabilir.
  8. Aşağıda tarif edildiği gibi hücreleri daha sonra altkültürü 1, 2 ya da farklılaşma için kullanılmaktadır.

3. Nöral Kök ve Progenitör Hücre Farklılaşma, Neuroblast Assay (NBA)

  1. Ayrışmış neurospheres kaynaklanan Hücreler 20 ng / ml EGF, 10 ng / ml bFGF,% 0.2 heparin 1 ul / ml,% 5 ile desteklenmiş tam NSC ortamda 2-3 x 10 5 hücre / ml 'lik bir konsantrasyonda kaplanir ısı uygun bir boyut doku kültürü balonuna FCS inaktive. 5 ml orta T75 için T25, 20 ml ve T175 şişeler için 40 ml için kullanılır.
    Not: FCS hücreleri sıkıca substrat eklemek neden olur ve NBA kültürü için kaplama şişeler için bir ihtiyaç vardır.
  2. Külture matara sonra 3-4 gün süreyle% 5 CO 2 ile 37 ° C nemli inkübatörde inkübe edilir. Bu dönemde MGK döl yüzeye tutunur ve hücre monolayer olarak çoğalırlar sırasında, proliferasyon aşamasında denir.
  3. Kültür% 90-95 birleşmiş, her şişenin orta olduğunda herhangi bir büyüme faktörleri olmaksızın% 5 FCS ile desteklenmiş tam MGK orta geçilir.
  4. Kültür şişeler tekrar başka bir 3-4 gün için% 5 CO 2 ile 37 ° C nemli inkübatörde inkübe edilir. Bu dönem nöronal ataları bir astrositik monolayer üstünde görünür ve olgunlaşmamış nöronal hücrelerin koloniler yapmak için çoğalırlar sırasında, farklılaşma aşaması denir. Farklılaşma aşamasının günde 4-5, kültür akış sitometrisi teknolojisi kullanılarak neuroblast hücrelerin izolasyonu için hazırdır.

4. Akım Sitometri için Hücre Hazırlık

TrypsiniWHO

  1. Farklılaşma aşamasının günde 4-5 soyundan NSC farklılaşma kültürü kültürden FCS kaldırmak için PBS uygun bir miktarda (T25 için 2 ml, T75 için 4 ml ve T175 şişesinde 8 ml) ile bir defa yıkanır.
    Not: FCS bloklar Tripsin-EDTA aktivitesi.
  2. Daha sonra, önceden ısıtılmış% 0.05 tripsin-EDTA (T25 için 2 ml, T75 için 4 ml ve T175 şişesinde 8 mi) yeterli bir miktarda hücre mono tabakasında kapsayacak şekilde, her şişesine eklendi ve 1-2 dakika süreyle inkübe edilir 37 ° C inkübatör nemlendirilmelidir.
  3. Şişeye kültürü üzerinde Tripsin-EDTA etkisini değerlendirmek için mikroskop altında kontrol edilir. Şişe daha sonra tek elle tutulan ve balonun altındaki hücreleri çıkarmak için diğer elinizle sıkıca tutulur.
  4. Soya fasulyesi tripsin inhibitörü eşit hacimde tripsin aktivitesi gidermek için balona ilave edilir. Hücre süspansiyonu yavaşça tripsin inaktivasyon sağlamak ve homojen bir tek hücre elde etmek için aşağı yukarı pipetlenir ve birsüspansiyon.
    Not: Alternatif olarak,% 5 FCS ile takviye orta tripsin aktivitesi gidermek için kullanılabilir.
  5. Non-ayrışmış topaklar kaldırmak için, hücre süspansiyonu, 40-mikron boyutunda gözenekli filtreden geçirilir.
  6. Hücre süspansiyonu daha sonra 5 dakika boyunca 800 rpm (110g) santrifüj edilir, süpernatan kaldırılır ve hücre tam NSC orta uygun bir hacmi içinde tekrar süspanse edilir.
  7. Hücre süspansiyonu bir son hacim hücre yoğunluğu 2-3x10 6 -cells/ml aşmayacak şekilde ayarlanır. Yüksek hücre yoğunluğu akım sitometri makine akışı tıkanmaya neden olabilir.
  8. Sadece fiziksel özelliklerine göre nöronal hücrelerin izole etmek isterseniz, şimdi bölüm 4 açıklanan sıralama FACS geçebilirsiniz.
  9. Sıralama önce, Propidium iyodür (PI, Sigma, PBS içerisinde 500 ug / ml), 1 ul / ölü hücreleri çıkarmak için hücre süspansiyonu ml 'lik bir konsantrasyonda eklenir.

Cel Canlıl immün

Daha yüksek bir NBA kültürden tek bir hücre hasat nöronal hücre saflığı, PSA-NCAM (erken olgunlaşmamış nöronal progenitörlerin bir işaretleyici) ve sonra nöronal popülasyondan pozitif hücreleri için boyanmış edilebilir elde etmek için FACS makinası kullanılarak izole edilebilir.

  1. Bir hücre sayımı yapıldıktan sonra, NBA kültürden tek bir hücre süspansiyonu dört gruba ayrılmıştır:
    • Yalnız Hücreler grubunda, parametreler ve kapıları (0.5-1 x 10 6 hücre) ayarlamak için bir kontrol olarak hizmet vermektedir.
    • Hücreler artı PI, parametreler ve kapıları (0.5-10 x 10 6 hücre) ayarlamak için bir kontrol olarak hizmet vermektedir. Bu gruptan PI negatif hücreler hücreleri fiziksel özelliklerine göre de sıralanabilir.
    • Ayrıca parametreleri ve kapıları (1-2 x 10 6 hücre) ayarlamak için bir kontrol olarak hizmet İkincil yalnız (İzotip kontrol) grubu.
    • Ulaşmak için PSA-NCAM için lekeli immün grubu (8-10 x 10 6 hücre)olgunlaşmamış nöronal hücre, bir daha arıtılmadan. Sıralama üzerine ölü hücreleri çıkarmak için, PI de bu gruba eklenir.
  2. Immün başlatmak için hücre 5 dakika boyunca 800 rpm (110 g) santrifüj edilir. Süpernatan kaldırılır ve hücre tam NSC orta 100 ul içinde tekrar süspanse edilir.
  3. Fikoeritrin (PE) konjuge anti-PSA-NCAM antikoru PSA-NCAM için boyanmış üzere hücre süspansiyonu için 05-10 Ekim / ml x 10 hücreleri 6 arasında bir oranda eklenir. Aynı şekilde, bir PE konjuge fare IgG1 izotip kontrolü antikoru izotip kontrolü hücre süspansiyonu ilave edilir. Kullanılacak antikorun konsantrasyonunu ilgili antikor spesifikasyon kağıda talimatları izleyin. Hücre süspansiyonu daha sonra yavaşça karıştırılır ve karanlıkta 10-15 dakika oda sıcaklığında inkübe edilir.
  4. Hücre süspansiyonu (PSA-NCAM ve izotip kontrolü tüpler), sonra 5 dakika boyunca 800 rpm (110 g) santrifüj edilir, süpernatan kaldırılır ve hücre yeniden suspe olan birkomple NSC ortamın 1 ml nded.
  5. Numunelerinden aşırı un-sınırlı antikorlar kaldırmak için, adım 4 2-3 kez tekrarlanır.
  6. Sonra tekrar süspanse Propidium iyodür (PI, Sigma, PBS içerisinde 500 ug / ml) hücre süspansiyonları, 1 ul / ml (hücreleri artı PI, izotip kontrolü ve bir konsantrasyonda eklenir, orta uygun bir hacminde hücre PSA- flow sitometri ile analiz edildiğinde NCAM lekeli örnekleri) ölü hücreleri çıkarmak.
  7. Tam orta 1 ml içeren 15 ml steril falcon tüpleri farklı hücre popülasyonu doğru sıralanır hücreleri toplamak için hazırlanmıştır.

5.. Olgunlaşmamış Nöronlar floresan aktive Hücre Sıralama (FACS)

  1. FACS makine akım sitometri tesisi uzman teknisyen ile kullanım kılavuzuna talimat dayalı kurulur.
  2. Fosfat (PBS) veya başka uygun bir çözüm dependin tamponluüretici talimatları g, 90 mikron meme aracılığıyla 28 PSI kılıf sıvısı olarak kullanılabilir.
  3. Sistem üzerinde fark basınç sıralama tetik oranı 2500 olayları / saniye aşmadığı gibi ayarlanır.
  4. Tek başına hücrelerinden hücre süspansiyonu grubu FACS makinesi aracılığıyla gerçekleştirilir.
  5. İlk olarak, hücreler (olaylar), boyutu (Forward Scatter (FSC) ışık) karşı farklı hücre popülasyonu ayırt etmek için iç karmaşıklığı (Side Scatter (SSC) ışık) göre çizilir. Bunu yapmak için, FSC ve SSC için gerilim parametreleri hücreleri akış sitometrisi plot görülebilir şekilde ayarlanması gerekmektedir.
  6. Hücre kümeleri ve çiftler dışlamak için, hücrelerin ilk forward scatter alanı (FSC-A) karşı forward scatter darbe genişliği (FSC-W) ve tek hücre nüfus 1 (P1) gibi kapılı olduğu dayalı çizilmiştir. Daha sonra P1 hücreleri yan dağılım alanı (SSC-A) karşı tarafında dağılım darbe genişliği (FSC-W) ve tek hücre gat bu kez dayalı çizilirnüfusu 2 (P2) olarak ed. Bu iki ardışık kapıları, kümeleri veya çiftleri (yüksek FSC darbe genişliği ve yüksek SSC darbe genişliği) kuran dahil edilmektedir.
  7. Ölü veya zarar görmüş hücreleri dışlamak için, tek hücre (P2) FSC-A ve tek bir canlı hücre nüfus bağımlı olduğu karşısında PI reaktivite göre çizilir.
  8. Tek canlı hücreleri hücre boyutu ve iç ayrıntı göre farklı hücre popülasyonu ayırt etmek için FSC karşı SSC göre çizilir. Bu aşamada iki ana hücre popülasyonlarının FSC düşük SSC düşük (P3) ve FSC yüksek SSC Yüksek (P4) hücre popülasyonu olarak gated vardır.
  9. Sıralamak için FSC düşük SSC düşük nüfus ile PSA-NCAM immün-reaktif olgunlaşmamış nöronal hücrelerin kontrolden ilk FSC düşük SSC düşük nüfus (artı PI ve izotip kontrol hücreleri) grupları FSC-A versus PE immunoreaktivitesi göre çizilen ve olumsuz bir hücreleri (P5) kapılı, ve PSA-NCAM den sonra pozitif hücrelerlekeli grubu nüfus 6 (P6) olarak gated vardır.
  10. Gerekli tüm kapıları ayarladıktan sonra ilgi hücreleri 1ml MGK besiyeri içeren 15 ml steril doku kültürü tüpler halinde sıralanır.
  11. Sıralanır hücreleri daha sonra, 5 dakika süreyle 1200 rpm (240 g) santrifüj edilir.
  12. Süpernatant atılır ve pellet gerçekleştirilir vasatı (pelet boyutuna bağlı olarak) ve hücre sayımı, uygun bir hacmi içinde tekrar süspanse edilir.
  13. Hücreler daha sonra,% 5 FCS ve 20 ng / ml insan rekombinant BMP4 5 ile 20-30 x 10 3 hücrelik bir yoğunlukta / kuyu tam NSC orta 200-250 ul içinde, poli-L-Ornithine kaplanmış 96-kuyucuklu plaklar içinde kaplanir .

Not: katın 96 kuyuları, poli-L-Ornithine çalışma solüsyonu için 100 ul (1.5 ml Poli-O ve steril PBS 8.5 ml), her oyuğa ilave edilir ve plaka, en azından biri için bir 37 ° C inkübatöründe inkübe edilir saat. Sonra, steril PBS ile Poli-O kaldırılır ve her oyuğa üç kez yıkanır(PBS 10 dakika süre ile de, her zaman kalsın). Poli-L-Ornithine / kuyu 24-kuyucuklu plaklar kullanılması durumunda çözeltisi çalışma 500 ul kullanabilir.

  1. Hücreler daha sonra sıralama soğuk% 4 paraformaldehit kullandıktan sonra farklı zaman noktalarında sabit ve farklı hücre popülasyonlarının doğru sıralanır hücre fenotipi değerlendirmek için uygun nöronal ve glial hücre belirteçleri için boyanmış edilir.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Neuroblast assay (NBA) farklılaşma kültürde, kaplama hücrelerin doku kültürü yüzeye tutunur ve bir tek tabaka olarak büyür. Ilk hücre kaplama yoğunluğuna bağlı olarak, kültürü 3-4 gün sonra% 90-95 konfluent kültür dönüşecektir. Bu aşamada, özellikle astrositik hücre monolayer üst 4,5 üzerinde küçük yuvarlak nöronal progenitör hücreler (Şekil 1) ile görüntülenebilir altında olabilir. Bir büyüme faktörü ücretsiz orta orta geçtikten sonra, nöronal progenitör hücrelerin başlatmakhızla bölünen ve 4-5 gün içinde astrositik tek tabakalı (Şekil 2) üstüne olgunlaşmamış neuroblast hücreleri kümeleri oluşturmak. Hücre boyutunu (FSC) ve iç ayrıntı (SSC) (Şekil 3) dayalı FSC düşük SSC düşük ve FSC yüksek SSC yüksek; farklılaşma aşamasında 4-5 gün ayrışmış NBA kültür Flow sitometri analizi, iki ana hücre popülasyonu gösterir. FSC yüksek SSC yüksek nüfus doğru sıralanır hücreler çoğunlukla iken sıralı hücrelerin immün floresan analizi, nöronal hücrelerin esas FSC düşük SSC düşük nüfus (bunların% 75'den fazla β-III tubulin ifade ile) yer olduğunu gösteriyor immünoreaktif astrositler (Şekil 4) GFAP. Kadar yakın homojenlik (% 97) ve immatür nöronal hücrelerin saflaştırma FSC düşük SSC düşük nüfus (Şekil gelen PSA-NCAM IR hücrelerin pozitif seçimi ile elde edilebilir3, 4). E14 fare ganglionik tubera izole NSC'lerde üretilen zenginleştirilmiş nöronal hücrelerin farklılaşması üzerine bir GABAerjik fenotip ve ekspres DARPP-32, orta dikenli nöronların bir göstergesi, (Şekil 5) edinirler.

Şekil 1
Proliferasyon sahne 4. günde E14 fare sinir kök hücrelerinden Şekil 1. Neuroblast tahlil kültürü. Bu tek tabakalı kültüre düz astrositik hücreler (ok başları) altında ve üstünde yuvarlak nöronal progenitör hücreleri (oklar) oluşur. Orijinal büyütme; 20 x.

Şekil 2
A) Faz kontrast, B) immünofloresan boyama:. Farklılaşma aşamasında 4. günde E14 fare sinir kök hücrelerinden Şekil 2 Neuroblast tahlil kültürü. Olgunlaşmamış nöronal hücrelerin (kümelenme Not A oklar (B A, GFAP boyama ok başları) üstüne B> ve β III tubulin boyama). Orijinal büyütme; 20 x.

Şekil 3
. Şekil 3 Temsilcisi tür araziler: A). FSC vs çiftler ve ölü hücreleri dışlanması önce SSC tür arsa. B, C). FSC ve SSC darbe genişlik. GE'ye dayalı çiftler dışlanması için Sıralama araziler). Ölü ve hasar görmüş hücrelerin Dışlama Propidium İyodür immünreaktivite dayanmaktadır. E). Çiftler ve ölü hücreleri dışlandıktan sonra FSC vs SSC arsa, FSC düşük SSC düşük ve FSC yüksek SSC yüksek nüfus olarak adlandırılan iki ana nüfus gösteriyor. F, G). Sıralama araziler FSC düşük SSC düşük nüfus ile PSA-NCAM IR olgunlaşmamış hücreler izole etmek.


Hücrelerinden Şekil 4. Temsilcisi mikrograflarından Kaplama sonrası farklı topluluklarda bir gün sıralanır. A) FSC düşük SSC düşük nüfus (bu hücreler nöronlar olan fazla% 75). B) FSC yüksek SSC yüksek nüfus (bu hücrelerin çoğunluğu astrositler vardır ). C) PSA-NCAM FSC düşük SSC düşük nüfus (hemen hemen tüm sıralı hücrelerin nöronlar vardır) + 'den sıralanmış hücreler. Orijinal Büyütme; 20 x.

Şekil 5,
Şekil 5. Sıralandı immatür nöronlar GABAerjik nöronlar (A) ve ekspres DARPP-32 (B), orta dikenli nöronlar için bir belirteç içinde farklılık gösterir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tanımlanan sinir hücre popülasyonu izole yeteneği (yani nöron, astrositler ve oligodendrosit) nöral kök hücrelerin klinik uygulama (NSC'lerde) ile ilişkili bazı engelleri çözebilir. İlk olarak, tamamen donör hücrelerinin başlangıç ​​nüfusu karakterize mümkün kılmaktadır. İkincisi, bizim hastalığın doğasına ve aşama bağlı olarak, belirli bir oranı ile, belirli bir hücre tipinde ya da farklı hücre tipleri bir kombinasyonunu kullanmak için olanak sağlar. Son olarak, zenginleştirilmiş ön farklılaşmış sinir hücresi ataları ile büyük ölçüde kontrol dışı çoğalması ve iyi niyetli MGK 6 içeren heterojen nöral öncüleri ile ilişkili tümör oluşumunu azaltabilirsiniz. Genellikle sinir kök hücrelerin farklılaşması% 5-10 nöronal hücrelerde ve% 80'den daha fazla astrositler neden olacaktır. Farklılaşma NBA yöntemi kullanarak, nöronal hücrelerin oranı% 20-30 kadar artacak ama hala astrositlerin çok ve diğer kök ve p varBir in vitro saf nöronal hücrelerin çalışma veya nörolojik hastalıkların hayvan modellerinde kendi terapötik etkilerini incelemek niyetinde olsaydı arzu olmayabilir kültüründe rogenitor hücreleri. Bu protokol, biz olgunlaşmamış nöronal hücrelerin 5 arındırmak için MGK döl ayırt fiziksel ve floresan özellikleri yapısında farklılıklar yararlandı. Bizim akış sitometri arınma yöntemi tespit astrositler ve un-farklılaşmış iyi niyetli nöral kök ve progenitör hücreler ile 20-30% 75-97% kadar nöronal hücrelerin yüzdesini artırır.

Insan NSC'lerde Bu metodoloji uygulanması nörolojik hastalığı nöronal hücre replasman tedavisi yarar olabilir. Bu yaklaşım da son derece gibi ilaç tarama, neurotoxicology gelişim çalışmalarında ve elektrofizyoloji gibi nöronal progenitör hücreler saflaştırılmış gerek in vitro çalışmalar için yararlı olabilir.

Sürekli ge yapabilmek içinE14 fare ganglionik tubera üretilen NSC'lerde yüksek kaliteli immatür nöronlar nerate, bizim önerimiz:

  1. Küreleri çok büyük büyümesine izin vermemek. Büyük neurospheres daha fazla hücre ölümü ve daha az nörojenik yetenekleri ile ilişkilidir.
  2. Fazla 2-3 dakika küreler trypsinize için değil. Fazla 3 dakika boyunca tripsin bırakarak hücreleri zarar verir ve bunların nörojenik randıman düşer.
  3. Çoğalan tek tabakalı aşırı konfluent haline gelmesine izin vermemek. Bu normal farklılaşma süreci etkileyebilir. Kültürü yaklaşık% 90 konfluense ulaştığında daima, orta geçin.
  4. Kültür sıralamadan önce günde bir orta değişikliği vermek için. Bu tür bir şartlı orta gününde toplandı ve kaplama hücreleri için kullanılabilir. Bu orta sıralaması olgunlaşmamış nöronal hücrelerin hayatta kalmak ve daha olgun bir fenotip elde etmek için yardımcı olacaktır astrositik hücrelerden tanımlanamayan çözünür faktörlerin bir sürü içerir.
  5. Bu t dezavantajları olarakTeknoloji, akım sitometri makine tür ve ayrıca mantar, bakteri hücre ölümü üzerine hücrelerine zarar ve neden olabilir kesme kuvvetinin de dahil olmak üzere bazı riskleri ile ilişkili olabilir ama hücre süspansiyonu geçen. Kuvveti kesme tarafından zarar görmesini önlemek için, uygun bir hızda hücre sıralama ve sıralama tetik oranı 2500 olayları / saniye fazla girmemesine sağ kılıf sıvısı (PBS tavsiye edilir) ve doğru büyüklükte memeleri (90-100 mikron) kullanmanızı öneririz. Kontaminasyonu önlemek için cihaz sıralamadan önce dezenfektan reaktifler kullanılarak temizlenmesine emin olmak ve aynı zamanda toplama ortamda antibiyotik kullanmayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Bu çalışma Overstreet Vakfı'nın fon tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
NeuroCult NSC Basal Medium Medium Stem Cell Technologies 05700
NeuroCult NSC Proliferation Supplements Medium supplement Stem Cell Technologies 05701
%0.05 trypsin-EDTA Reagent GIBCO, by Life Technologies 25300-062
Soybean trypsin inhibitor Reagent Sigma-Aldrich T6522
Pen/Strep Reagent GIBCO, by Life Technologies 15140-122
*MEM Reagent GIBCO, by Life Technologies 41500-018 HEM component
*HEPES Reagent Sigma-Aldrich H4034 HEM component
*Distilled water Reagent GIBCO, by Life Technologies 15230-147
Cell strainer Sieve BD Biosciences 352340
T25 flask Culture ware Nalge Nunc international 136196
T80 flask Culture ware Nalge Nunc international 178905
15 ml tubes Culture ware BD Biosciences 352096
50 ml tubes Culture ware BD Biosciences 352070
EGF Growth factor R&D Systems 2028-EG
b-FGF Growth factor R&D Systems 3139-FB
Heparin Growth factor Sigma-Aldrich H4784 Reconstituted in PBS
Anti-PSA-NCAM-PE Antibody Miltenyi Biotec 130-093-274
PE- Conjugated mouse IgG1 Isotype control antibody BD Biosciences 556029
Heparin Growth factor Sigma-Aldrich H4784 Reconstituted in PBS
HrBMP-4 Growth factor R&D Systems 314-BP-010
Poly-L-Ornithine Reagent Sigma-Aldrich P4957
Fetal Calf Serum Medium Supplement GIBCO, by Life Technologies 10099-141
GFAP Antibody Dako Z0334
B-III tubulin Antibody Promega Corp. G7121
*To make HEM, mix 1 x 10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393 (2010).
  2. Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (47), e2457 (2011).
  3. Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells. Methods. Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).
  4. Scheffler, B. Phenotypic and functional characterization of adult brain neuropoiesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9353-9358 (2005).
  5. Azari, H. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS One. 6, e20941-e20941 (2011).
  6. Amariglio, N. Donor-Derived Brain Tumor Following Neural Stem Cell Transplantation in an Ataxia Telangiectasia Patient. Plos Medicine. 6, 221-231 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics