Conditietraining protocol en Longitudinale Prestaties Testen voor Drosophila melanogaster

Biology
JoVE Journal
Biology
AccessviaTrial
 

Summary

We beschrijven de eerste duurtraining protocol voor een belangrijk genetisch model soorten,

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Tinkerhess, M. J., Ginzberg, S., Piazza, N., Wessells, R. J. Endurance Training Protocol and Longitudinal Performance Assays for Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (61), e3786, doi:10.3791/3786 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Een van de meest urgente problemen van de moderne medische onderzoekers is het stijgende niveau van obesitas, met als gevolg stijging van de daarmee samenhangende aandoeningen zoals diabetes en hart-en vaatziekten 1-3. Een belangrijk onderwerp van onderzoek naar deze geassocieerde gezondheidsproblemen betreft de rol van uithoudingsvermogen te oefenen als een heilzame interventie.

Oefening training is een goedkope, niet-invasieve ingreep met een aantal gunstige resultaten, met inbegrip van vermindering van overtollig lichaamsvet 4, verhoogde gevoeligheid voor insuline in de skeletspier 5, verhoogde anti-inflammatoire en antioxidatieve reacties 6, en een verbeterde contractiele capaciteit in cardiomyocyten 7. Lage intensiteit oefening is bekend dat het mitochondriale activiteit en biogenese in de mens 8 en muizen te verhogen, met de transcriptionele coactivator PGC1-α als een belangrijke tussenstap 9,10.

Despite het belang van bewegen als middel voor de bestrijding van een aantal belangrijke leeftijd gerelateerde ziekten, hebben uitgebreide longitudinale genetische studies echter belemmerd door het ontbreken van een duurtraining protocol voor een kortstondige genetische modelsoorten. De verscheidenheid van genetische tools beschikbaar voor gebruik met Drosophila, samen met de korte levensduur en goedkoop onderhoud, maken het een aantrekkelijk model voor de verdere studie van deze genetische mechanismen. Met dit in gedachten hebben we een nieuw apparaat, bekend als de Power Tower, voor grootschalige oefening-opleiding in Drosophila melanogaster 11. De Power Tower maakt gebruik van het vliegen 'instinctieve negatieve geotaxis gedrag herhaaldelijk veroorzaken een snelle klimmen. Elke keer dat de machine liften, dan daalt, het platform van vliegen, zijn de vliegen veroorzaakt te klimmen. Vliegen blijven zolang de machine in bedrijf is of totdat ze te moe om te reageren reageren. Zo kan de onderzoeker gebruik maken van deze machine om simultaneous training om grote aantallen vergelijkbare leeftijd en genetisch identieke vliegen. Daarnaast beschrijven we de bijbehorende tests nuttig om longitudinale verloop van de fly cohorten te volgen tijdens de training.

Protocol

1. Power Tower installatie en bediening

  1. De kracht toren wordt op een rechthoekig stuk multiplex dat geklemd een tabel. Een 4,5 rpm aandrijving van Grainger rust op de top van vier 2 "x6" boards en een ¾ inch multiplex. De motor, een AC / DC snelheidsregeling, een zekering, en een aan / uit schakelaar via een kabel verbonden in een tijdsgewricht doos.
  2. Om de motor te koelen is er een opening 3 inch in diameter gesneden in een verticale ½ inch stuk triplex. Aan de ene kant wordt een 3 inch ventilator aan de multiplex, en anderzijds een 3 inch diameter metalen cilinder wordt gehecht.
  3. Een maat draaiarm een ​​roller aangebracht op het uiteinde is verbonden met de motor. De motor en bijgevoegde arm draaien in rechtse richting, waardoor een kant van een gebogen ¾ inch vierkante buis papier dat de multiplex bevestigd met een scharnier. Een wiel is bevestigd aan de bovenzijde van de buis bestand onder het platform om deze rollen tegen het platform dat directly erboven.
  4. De duwt neer op een uiteinde van de buis bestand en tilt het andere uiteinde, waardoor een twee-niveau platform (figuur 1D). Wanneer de rol op de arm de buis bestand wist het mogelijk de arm terug naar de uitgangspositie, daalt de platform naar beneden (figuur 1F).
  5. De platforms bestaan ​​uit rekken die zijn geplaatst op de top van multiplex en beveiligd door bungee-koorden die zijn aangesloten op schroef ogen. De platforms schuiven op en neer langs de lade schuiven die verbonden zijn aan de multiplex met beugels.
  6. Flacons worden geplaatst in de rekken en vastgezet met een vierkant scherm dat wordt op zijn plaats gehouden met een bungee-koorden.
  7. Een piepschuim kussen bevindt zich onder het platform om de schok van de daling te temperen.
  8. De kracht van de motor zodanig geregeld dat een volledige rotatie is 15 seconden.

2. Oefening protocol

  1. Vliegen zijn ondergebracht in een 25 ° C incubator met 50% luchtvochtigheid en een 12-uurs licht / donker cyclus. Both oefening opleiding en beoordeling van de capaciteit voor lichaamsbeweging worden uitgevoerd in een 25 ° C temperatuur-gecontroleerde ruimte.
  2. Vliegen worden verzameld en op leeftijd gematchte binnen 1-2 dagen na elkaar. Een minimum van 240 vliegen is nodig voor longitudinale monitoring van het uithoudingsvermogen en de negatieve geotaxis (klimmen) vermogen, twee fysiologische indicatoren die het effect van fysieke training te geven. Longitudinale bewaking zorgt isolatie van teweeggebrachte verandering ten opzichte van de beginwaarden voor elk cohort, zonder verstorende effecten van verschillen tussen de cohorten. Vliegen voor extra experimenten moeten worden verzameld als nodig is.
  3. Na het verzamelen, zijn vliegen verdeeld in 120 experimentele vliegen, die zal worden onderworpen aan de oefening regime, en 120 controle vliegen, die niet zal worden uitgeoefend. De vliegen worden opgeslagen in flacons van 20 vliegt per stuk. De flacons van de experimentele vliegen zijn aangesloten met stevige celluloseacetaat Flugs en de flesjes van de controle (niet-uitgeoefende) vliegen zijn aangesloten met een zachte spons stoppen, which kan worden ingedrukt om de vliegen te immobiliseren, terwijl op de Power Tower. Spons wordt gebruikt voor immobilisatie omdat de adaptieve grootte eenvoudig te plaatsen nabij de bodem van de flacon. De zachtere spons materiaal zorgt ook voor letsel als gevolg van de meer solide Flugs.
  4. Vliegen op de Power Tower worden opgeslagen en uitgeoefend in injectieflacons die 5 ml van voedsel, die hen voorziet van een zachtere landing dan vliegen die worden uitgeoefend in lege flacons bevatten. Het eten is meestal samengesteld uit 10% sucrose, 10% gist, en 2% agar in water, hoewel we niet zien vliegen om vaak te eten in de loop van een training. Als lege flacons worden gebruikt tijdens de training, wordt het percentage van de vliegen die letsels gaat een sterk toegenomen.
  5. De Power Tower wordt gebruikt in een temperatuur-gecontroleerde ruimte die wordt gehandhaafd op 25 ° C. Experimentele vliegen worden op de Power Tower en gemaakt om te klimmen. Controle vliegen worden ook geplaatst op de Power Tower, maar de spons stop wordt gedrukt naar beneden in de vial ongeveer 3 mm boven de vliegen om bewegingen te beperken. Deze groep dient als controle voor de eventuele gevolgen van de Power Tower die geen verband houden met uit te oefenen. Hoewel enige ruimte bestaat nog steeds voor deze vliegen om te manoeuvreren, hebben we herhaaldelijk opgemerkt dat vliegen onder deze omstandigheden lopen heel weinig en niet aantonen dat er een fysiologische reactie uit te oefenen. Het kan ook wenselijk zijn om een ​​extra controle groep die niet op de Power Tower geheel omvatten.
  6. Vliegen worden uitgeoefend gedurende vijf opeenvolgende dagen per week, gebruik te maken van een oplopende schema (figuur 2). In week een van de vliegen worden uitgeoefend gedurende 2 uur per sessie, week twee voor 2,5 uur per sessie, en week drie voor 3 uur per sessie. Hoewel andere behandelingen zijn getest, dit protocol produceert consistente resultaten voor heel genotypen en onder uiteenlopende omstandigheden. Dit protocol is echter onderworpen aan een breed scala van mogelijke schommelingen die een bepaald experiment zou kunnen passen.

3. Oefening en bewegingsapparaat Vermoeidheid

  1. Tijd om vermoeidheid tijdens uithoudingsvermogen te oefenen is een nuttige fysiologische indicator om te bevestigen en / of kwantificeren de inspanningscapaciteit van een bepaald cohort. Vermoeidheid assays in de lengterichting worden uitgevoerd cohorten die wordt gebruikt in opleiding experimenten. Testen kan zowel voor de training uitgevoerd, na de voltooiing van de opleiding protocol, of beide. Andere tussenliggende tijd kunnen worden toegevoegd indien het in kaart brengen incrementele vooruitgang tijdens de training gewenst is. De vermoeidheid assay kan ook gebruikt worden om te bewegen uithoudingsvermogen meten als reactie op behandeling dan de training protocol, zoals voeding verandering (Figuur 3B).
  2. Vermoeidheid tests moeten worden uitgevoerd op een dag tijdens het trainen niet plaatsvindt. Zowel de experimentele en controle vliegen worden geplaatst op de Power Tower in flacons van 20 per stuk en maakte te klimmen tot vermoeid. Vermoeidheid wordt erkend als het uitblijven van een negatieve geotaxis stimulus reageren met klimmen gedrag. Vermoeidheid gedragsproblemenr wordt gescoord door visuele waarneming.
  3. Een flacon van vliegen wordt beschouwd als "vermoeid" bij 5 of minder vliegen in staat zijn om hoger zijn dan 2 centimeter te klimmen gedurende vier opeenvolgende druppels. Vermoeide flacons worden verwijderd uit de Power Tower, terwijl het nu nog steeds, en de tijd van verwijdering wordt vastgelegd. Tijden van verwijdering kan worden uitgezet als een geneste histogram, of als een "time-to-failure" plot. Een voorbeeld van data geplot als een "tijd te storingvrij" plot is weergegeven in figuur 3B.
  4. Flacons worden gecontroleerd interval van 10 minuten voor een maximum van 10 uur (Figuur 3B).

4. Oefening, Leeftijd, en bewegingsapparaat Ability

  1. Omdat deze training protocol is gebaseerd op geïnduceerde loopgedrag, een primaire test voor kwantificeren van effecten van training is om de lengte te meten verandering van de gemiddelde loopsnelheid tijdens de training. In de loop van de opleiding, zijn 120-fly cohorten van uitgeoefend en niet uitgeoefende vliegen dagelijks getest op hun reactie op een negatieve geotaxis stimulus. De RING techniek described in Gargano et al.. (2005) wordt gebruikt om de vliegen 'klimvermogen 12 te meten. Kortom, deze techniek meet gemiddelde hoogte beklommen door een flacon met vliegen gedurende een bepaalde tijd na inductie van negatieve geotaxis. De hoogte klom gedurende een bepaalde tijd is gelijk aan het beklimmen snelheid. De metingen worden uitgevoerd voordat u vliegen op de machine voor dagelijkse training, om complicaties te voorkomen van vermoeidheid na run van de dag.
  2. In onze standaard protocol, zijn vliegen uitgeoefend voor een totaal van drie weken en klimmen mogelijkheid wordt onderzocht op een totaal van vijf weken: drie weken tijdens de training-training en twee weken na beëindiging van de oefening (figuur 2). Hierdoor kan de onderzoeker in kaart te brengen of de effecten van lichaamsbeweging op de mobiliteit blijven bestaan ​​na het stoppen van het programma.
  3. Vier foto's van het dagelijks elk cohort de ring van de prestaties worden gebruikt voor de analyse van klimvermogen. Zes flesjes worden opgenomen in elke foto. Negatieve geotaxis wordt opgewekt, en het gebruik van eengetimede camera, een foto wordt genomen na een bepaald aantal seconden. We gebruiken meestal twee seconden, hoewel dit kan variëren naargelang experimentele omstandigheden. Voor elke foto, is elke flacon verdeeld in vier kwadranten van gelijke hoogte, en beeldverwerking software wordt gebruikt om elke vlieg wijs een score op basis van het kwadrant is bereikt binnen de gestelde periode. Vliegen die klim naar de bovenste kwadrant krijgen een score van 4, vliegt in de volgende hoogste kwadrant krijgt een 3, vliegt in de op een na hoogste kwadrant krijgen een 2, en vliegt in de laagste kwadrant krijgen een 1. Vliegen die niet af te klimmen van de bodem te allen krijgen een score van 0.
  4. Voor elke flacon in een bepaalde foto wordt een "klimmen index" gegenereerd door het gemiddelde van de scores van alle vliegen in die flacon. Elke flacon van de indices van de vier foto's worden vervolgens gemiddeld tot een definitieve klimmen index voor die dag te geven.
  5. Alle negatieve geotaxis experimenten zijn in de lengte uitgevoerd. De resultaten zijn genormaliseerd to de eerste "pre-oefening" score om het effect van de cohort variatie te verminderen in klimvermogen en markeer de relatieve lengte-verandering in het beklimmen van een cohort van de capaciteit als gevolg van fysieke training. De eerste score wordt bepaald door het gemiddelde van de eerste drie dagen klimmen indices en krijgt een waarde van 1. Na proeven vervolgens uitgedrukt als percentage van de aanvankelijke index.

5. Representatieve resultaten

Wild-type vliegen te reageren op een endurance-protocol met een verminderde leeftijd gerelateerde daling van de klimvermogen, dat zich blijft voordoen na het einde van de opleiding, zoals die in de lengterichting RING testen over vijf weken oud zijn (Figuur 3A). Deze vertraagde afname negatieve geotaxis een standaard fenotypische respons die kan dienen als een positieve controle om na te wild-type oefening reactie normaal optreedt. Deze dataset wordt gepresenteerd als een voorbeeld van hoe de inductie van uitoefening door de Power Tower programma kan worden gebruikt als gedrag ingang. Het vermogen van verschillende genetische of omgevingsfactoren moduleren daartoe kan worden bepaald.

Omgekeerd kan de Power toren worden gebruikt als uitgang in verschillende experimentele modellen. Zo kan genotype, dieet of andere omstandigheden worden gevarieerd. Dan kan het effect van deze variaties op inspanningsfysiologie worden getest met behulp van de Power Tower. Hier wordt tonen een voorbeeld van deze aanpak. Bij vliegt met een variërende percentage saccharose in hun dieet werden getest tijd vermoeidheid, verhoogd saccharose gecorreleerd met verhoogde uithoudingsvermogen (Figuur 3B).

Figuur 1
Figuur 1. De werking van de Power Tower. (AC) De motor gebogen arm met daaraan roller klok mee tot het in contact komt met de gebogen vierkante buis. (D, E) naar beneden duwt de gebogen vierkante buis , Waardoor het platform dat is beladen met flacons van vliegen op te tillen. (F) Als de arm wist de buis van het platform mag weer naar beneden vallen, waardoor de vliegen om terug te keren naar de bodem van de flacon.

Figuur 2
Figuur 2. Aanbevolen Oefening protocol. Vliegen onderworpen aan de training-protocol zijn gemaakt om te oefenen voor vijf dagen per week op grond van een drie weken lang opgevoerd regime, dat geleidelijk verhoogt de duur van de oefening van de eerste 2 uur met 30 minuten per week. Standaard analyses zijn vermoeidheid testen voor en na de oefening programma en RING testen van week 1 tot en met week 5. Alle assays worden uitgevoerd in duplo evenveel uitgeoefende vliegen als negatieve controle. Andere diverse fysiologische of biochemische tests kunnen worden uitgevoerd, zoals bepaald door de onderzoeker.

3786fig3.jpg "/>
Figuur 3. Endurance oefening verandert meerdere aspecten van mobiliteit. (A) RING-testen uitgevoerd lengterichting over leeftijden in een enkel paar van de mannelijke Y 1 W 67C23 cohorten. Dezelfde leeftijd, genetisch identiek uitgeoefend en niet-uitgeoefende controle vliegen werden dagelijks gemeten voor de gemiddelde snelheid klimmen. De resultaten worden uitgedrukt in termen van een klim-index die de gemiddelde klimhoogte genormaliseerd op de eerste drie dagen gemeten. Oefening opgeleide vliegen toonde een verminderde leeftijd gerelateerde daling van de negatieve geotaxis vermogen ten opzichte van dezelfde leeftijd niet-uitgeoefende broers en zussen over de eeuwen heen (2-way ANOVA, p <0,005). (B) Vermoeidheid testen uitgevoerd voor 8 uur op dezelfde leeftijd vrouwelijke Canton S vliegen blijkt een significant effect van dieet sacharosegehalte op tijd aan vermoeidheid (Log-rank, p <0,0001). Voorafgaand aan experiment werden vliegen gevoed met een gist / sucrose / agar dieet, met 10% gewicht / volume gist concentratie, en een wisselend percentagede voeding sucrose. Vijf flacons van 20 vliegen elk werden getest voor elk dieet. Grafiek geeft aan hoeveel flesjes nog vijf of meer vliegen draait op een bepaald tijdstip te hebben. Deze resultaten kunnen statistisch en grafisch worden behandeld als een overleving (of tijd tot falen) curve, met een "mislukking" voor een flacon wordt gedefinieerd als een punt in de tijd waarin minder dan vijf vliegen nog steeds om te reageren op negatieve geotaxis stimulus. Merk op dat veel andere mogelijke opzet van de studie en statistische behandelingen mogelijk zijn, en gegevens behandeling en waardering moeten worden afgestemd op individuele doelen te passen.

Discussion

Het algemeen protocol hier gepresenteerd is succesvol geweest in het documenteren van fysiologische effecten na een opleiding. Toch zijn er verschillende gebieden in dit protocol zijn onderhevig aan wijziging van het bijzonder experimentele behoeften te passen. Zo kan de lengte van training en aantal periodes mogelijk worden gevarieerd om het programma meer of minder moeilijke, zo gewenst. De hoogte van de houder waarin negatieve geotaxis vermogen wordt gemeten kan worden aangepast aan de beschikbare ruimte voor verbetering gedocumenteerd verhogen. Verschillende methoden van het automatiseren van kwantificering van het beklimmen van snelheid kan ook van toepassing zijn. In principe kan alle software programma kunnen onderscheiden een vlieg uit de achtergrond worden gebruikt om het verzamelen van gegevens te versnellen.

Sommige aspecten van het protocol mag alleen worden aangepast met grote voorzichtigheid, echter. Bijvoorbeeld, voorlopige experimenten zijn sterke aanwijzingen dat minstens een dag rust per week heeft de neiging om aldus een grotere Improvement dan niet aflatende dagelijkse oefening. Daarnaast zijn circadiane ritmes en de temperatuur bekend is bij de beweging van koudbloedige dieren beïnvloeden. De tijd die training plaatsvindt kan worden gevarieerd, maar altijd stroken binnen bepaalde groepen onder vergelijking om de mogelijkheid van verstorende werking van het dag-/nachtritme voorkomen. De temperatuurregeling is ook essentieel, en we raden een speciale kamer bij een constante temperatuur naar het huis van fitnessapparatuur. Ten slotte moet mannen en vrouwen worden gehouden en gemeten afzonderlijk, om het potentieel van verstorende effecten van de vruchtbaarheid en de sekseverschillen in de inspanningscapaciteit te voorkomen.

Mogelijke toepassingen van deze methodiek zijn alleen beperkt door de fantasie van de onderzoeker. In voorbereidend werk, hebben we gebruik gemaakt van deze methode in drie grote toepassingen:

  1. Om het effect van uithoudingsvermogen te oefenen te meten over verschillende aspecten van wild-type biologie over leeftijden.
  2. To meten van het effect van uithoudingsvermogen te oefenen op specifieke mutant fenotype.
  3. Om te screenen op genetische factoren die nodig zijn om de voordelen van de oefening uit te voeren

Elk van deze toepassingen omvat een groot aantal specifieke mogelijkheden. Op basis van onze voorlopige ervaring, mutant fenotype hebben de neiging te variëren met de uitoefening niveau zo veel als ze variëren met voeding. Het gebruik van ongewervelde modellen om beter inzicht in de relatie tussen voeding, beweging, fysiologie en veroudering is misschien wel de belangrijkste algemene toepassing van dit protocol.

Disclosures

Wij hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van de NHLBI naar RW.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dayton Gearmotor Grainger 1LRA6A
Raco Electrical Box Grainger 5A052
Raco Cover Grainger 5A053
Cooper Bussmann Fuse Grainger 6F043
Cooper Bussmann Fuse Holder Grainger 1DD33
Carling Technologies Switch Grainger 2X464
Dayton Control, AC/DC Speed Grainger 4X796
Flugs for Narrow Plastic Vials Genesee Scientific 49-102

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wild, S., Roglic, G., Green, A., Sicree, R., King, H. Global Prevalence of Diabetes: Estimates for the year 2000 and projections for 2030. Diabetes Care. 25, 1047-1053 (2004).
  2. Flegal, K. M., Carroll, M. D., Ogden, L. C., Johnson, C. L. Prevalence and Trends in Obesity Among US Adults. JAMA. 288, 1723-1727 (1999).
  3. Hubert, H. B., Feinleib, M., McNamar, P. M., Castelli, W. P. Obesity as an Independent Risk Factor for Cardiovascular Disease: A 26-year Follow-up of Participants in the Framingham Heart Study. Circulation. 67, 698-977 (1983).
  4. Ross, R., Dagnone, D., Jones, P. J. H., Smith, H., Paddags, A., Hudson, R., Janssen, I. Reduction in obesity and related comorbid conditions after diet-induced weight loss or exercise-induced weight loss in med – A randomized, controlled trial. Annals of Internal Medicine. 133, 92-103 (2000).
  5. Goodyea, L. J., Kahn, B. B. Exercise Glucose Transport, and Insulin Sensitivity. Annual Review of Medicine. 49, 235-261 (1998).
  6. Linke, A., Adams, V., Schulze, P. D., Erbs, S., Gielen, S., Fiehn, E., Mobius-Winkler, S., Schubert, A., Schuler, G., Hambrecht, R. Antioxidative Effects of Exercise Training in Patients With Chronic Heart Failure. Circulation. 111, 1763-1763 (2005).
  7. Kemi, O. J., Ellingsen, O., Smith, G. L., Wisloff, U. Exercise-induced changes in calcium handling in left ventricular cardiomyocytes. Frontiers in Bioscience. 13, 356-368 (2008).
  8. Wang, H., Hiatt, W. R., Barstow, T. J., Brass, E. P. Relationships between muscle mitochondrial enzyme activity and oxidative capacity in man: alterations with disease. Eur. J. Appl. Physiol. 80, 22-27 (1999).
  9. Wu, Z., Puigserver, P., Andersson, U., Zhang, C., Adelmant, G., Mootha, V., Troy, A., Cinti, S., Lowell, B., Scarpulla, R. C., Spiegelman, B. M. Mechanisms Controlling Mitochondrial Biogenesis and Respiration through the Thermogenic Coactivator PGC-1. Cell. 98, 115-124 (1999).
  10. Goto, M., Terada, S., Kato, M., Katoh, M., Yokozeki, T., Tabata, I., Shimokawa, T. cDNA Cloning and mRNA Analysis of PGC-1 in Epirtrochlearis Muscle in Swimming-Exercised Rats. Biochemical and Biophysical Research Communications. 274-350 (2000).
  11. Piazza, N., Gosangi, B., Devilla, S., Arking, R., Wessells, R. Exercise-Training in Young Drosophila melanogaster Reduces Age-Related Decline in Mobility and Cardiac Performance. PLoS ONE. 4, e5886-e5886 (2009).
  12. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40, 386-395 (2005).

Comments

3 Comments

  1. Very creative and useful experimental design.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 13, 2012 - 9:48 PM
  2. I have a question.... which software do you use for scoring flies in the climbing assay?
    Thank you very much, Carlo Breda

    Reply
    Posted by: carlo b.
    February 12, 2013 - 4:09 AM
  3. we use software made by our neighbor, Scott Pletcher, called climber. However, you could also use various other kinds of software, including freeware such as NIH Image. Anything that can distinguish dark dots from a white background could work for this purpose.

    Reply
    Posted by: Robert W.
    February 12, 2013 - 9:27 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics