إعداد الخلايا متعلق بالنخاع الشوكي المكثف المشتقة (MDSC) من الفئران الحاملة للورم ساذجة والبنكرياس باستخدام التدفق الخلوي والفرز الآلي المغناطيسي خلية المنشط (AutoMACS)

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هذا هو أسلوب سريع وشامل للالمناعي الظاهري متعلق بالنخاع الشوكي الخلايا المشتقة المكثف (MDSC) وإثراء GR-1

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Nelson, N., Szekeres, K., Cooper, D., Ghansah, T. Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS). J. Vis. Exp. (64), e3875, doi:10.3791/3875 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

MDSC هي مجموعة من السكان غير متجانسة من غير ناضجة الضامة، الخلايا الجذعية والمحببة التي تتراكم في الأجهزة اللمفاوية في الحالات المرضية بما في ذلك العدوى الطفيلية، والالتهابات، الصدمة، مرض الطعم ضد المضيف والسكري والسرطان 1-7. في الفئران، MDSC صريحة ماك-1 (CD11b) وGR-1 (Ly6G وLy6C) مستضدات سطح 7. من المهم أن نلاحظ أن تدرس جيدا في MDSC المضيفين الحاملة للورم مختلف حيث يتم توسيع كبير هم وقمع المضادة للورم الاستجابات المناعية مقارنة مع نظرائهم من السذاجة 7-10. ومع ذلك، تبعا للحالة المرضية، وهناك مجموعات سكانية فرعية مختلفة من MDSC مع آليات متميزة وأهداف قمع 11،12. ولذلك، طرق فعالة لعزل السكان MDSC قابلة للحياة هي مهمة في توضيح الآليات الجزيئية المختلفة للقمع في التجارب المختبرية والحية.

في الآونة الأخيرة، ومجموعةوذكرت مجموعة hansah توسيع MDSC في نموذج سرطان البنكرياس الفئران. لدينا الحاملة للورم MDSC عرض فقدان التوازن، وزيادة وظيفة قمعية مقارنة MDSC ساذجة 13. النسب المئوية MDSC هي أقل بشكل ملحوظ في مقصورات اللمفاوية من الفئران السذاجة مقابل الورم الحاملة لل. وهذا هو التحذير الرئيسية، مما يعيق في كثير من الأحيان تحليلات مقارنة دقيقة لهذه MDSC. لذلك، وإثراء GR-1 + الكريات البيض من الفئران السذاجة قبل الإسفار الفرز خلية المنشط (FACS) يعزز نقاء، والسلامة، ويقلل كثيرا من الوقت نوع. ومع ذلك، والإثراء من الكريات البيض + GR-1 من الفئران الحاملة للورم هو اختياري لأن هذه هي في وفرة لنظام مراقبة الأصول الميدانية السريعة الفرز. ولذلك، في هذا البروتوكول، وصفنا أسلوبا كفاءة عالية من المناعي الظاهري MDSC وإثراء GR-1 + الكريات البيض من الطحال من الفئران ساذجة لفرز MDSC في الوقت المناسب. يتم تلقيح مناعيا C57BL / 6 الفئران مع اوربا Panc02 الفئرانLLS تحت الجلد في حين الفئران السذاجة تلقي 1XPBS. ما يقرب من 30 يوما بعد التلقيح، ويتم حصاد الطحال ومعالجتها إلى وحيدة الخلية تعليق باستخدام خلية تفكك غربال. ثم يتم Splenocytes خلايا الدم الحمراء (RBC) هي lysed وملطخة 1 قسامة من هذه الكريات البيض باستخدام ملون تألقي مترافق أجسام مضادة ضد ماك-1 و 1 غ إلى النسب المئوية نمط ظاهري مناعي MDSC باستخدام التدفق الخلوي. في تجربة موازية، وملطخة الكريات البيض كله من الفئران السذاجة مع الأجسام المضادة GR-1-مترافق فلوري، حضنت مع PE-MicroBeads واختيارها بصورة إيجابية باستخدام الفرز الآلي المغناطيسي خلية المنشط (autoMACS) برو فاصل. المقبل، وملطخة 1 قسامة من GR-1 الكريات البيض + مع الأجسام المضادة-1 ماك لتحديد الزيادة في نسب MDSC باستخدام التدفق الخلوي. الآن، وهذه الكريات البيض المخصب + GR1 مستعدون لنظام مراقبة الأصول الميدانية فرز MDSC لاستخدامها في تحليل مقارن (السذاجة مقابل الورم الحاملة لل) في في والمجراة في المختبر

Protocol

قبل البدء، وإعداد الحلول التالية:

3٪ وسائل الإعلام تلطيخ (SM):

-3٪ الجنين مصل بقري (FBS) في المؤسسة العامة لتحلية 1X الفوسفات عازلة (PBS)

MACS العازلة (MB):

- 0.5٪ الزلال من المصل البقري (BSA) في 1XPBS

1. حصاد الطحال من الفئران

  1. حقن تحت الجلد 6-8 أسبوع من C57BL سن / 6 الفئران (هارلان) مع 1.5 × 10 5 الفئران Panc02 الخلايا علقت في 100 برنامج تلفزيوني 1X ميكروليتر (الحاملة للورم، مرض السل). السيطرة على الفئران (ساذج) على 100 1XPBS ميكرولتر.
  2. ما يقرب من 4 أسابيع حقن آخر، الموت ببطء الفئران خنقا غاز ثاني أكسيد الكربون.
  3. حصاد الطحال من الفئران عن طريق تشريح حادة باستخدام ملقط ومقص ثم يزن باستخدام ميزان. الطحال في مكان منفصل، وصفت 50 مل أنابيب مخروطية الشكل التي تحتوي على 1 × برنامج تلفزيوني.

2. إنشاء Suspensio وحيدة الخليةن من الكريات البيض من الطحال

يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات في بيئة معقمة تحت غطاء السلامة البيولوجية والخلايا والأجسام المضادة أبقى على الجليد.

  1. تجميع خلية تفكك غربال بإضافة شاشة شبكة في افتتاح كأس نحو القاع. ثم، تضاف حلقة الاحتفاظ في المنطقة مترابطة مع الجانب فترة زمنية محددة واستخدام المفتاح الدائري لإحكام الطوق الاحتفاظ، وبالتالي عقد الشاشة في مكان. وضع غربال تجميعها في طبق بتري تحتوي على 10 مل 1 × برنامج تلفزيوني.
  2. الطحال تجمع واستخدام مدقة الزجاج لطحن الطحال ضد شاشة شبكة للخلية تفكك غربال والى طبق بيتري. كرر لكل مجموعة من الفئران المعالجة.
  3. مرشح تعليق الخلية في أنبوب 50 مل مخروطي باستخدام خلية ميكرون 70 مصفاة وماصة 5 مل المصلية. الطرد المركزي في 12000 دورة في الدقيقة (250-300 XG) لمدة 5 دقائق.
  4. إزالة وطاف بيليه resuspend في 5 مل العازلة × 1 تحلل RBC في الطحال. الماصة صعودا وهبوطا بقوة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. وقف رد فعل من خلال إضافة 20 مل من برنامج تلفزيوني × 1. الماصة صعودا وهبوطا بقوة. الطرد المركزي في 12000 دورة في الدقيقة (250-300 XG) لمدة 5 دقائق.
  5. إزالة وطاف بيليه resuspend في 20 مل العقيمة PBS × 1. الماصة صعودا وهبوطا بقوة.
  6. عد الخلايا باستخدام التريبان زرقاء وعدادة الكريات وresuspend في تركيز المطلوب في SM 3٪ حتى 50 ميكرولتر ما يعادل 5x10 الخلايا 6 5-1x10 (1x10 7 خلية / مل - 2x10 7 خلية / مل).

3. سطح الخلية تلطيخ / المناعي الظاهري من MDSC باستخدام التدفق الخلوي

  1. تسمية آبار لوحة 96-جيدا أسفل الخامس للرقابة ونماذج تجريبية والبقع واحد لضوابط التعويض (لا وصمة عار، NS؛ ماك-1-FITC؛ GR-1-APC ودابي).
  2. إضافة 5x10 1x10 5-6 خلايا تعادل 50 ميكروليتر / جيد من splenocytes إلى الآبار كل منها في لوحة V-96-أسفل أيضا. نبذلوحة في 12000 دورة في الدقيقة (250-300 XG) لمدة 5 دقائق.
  3. تعد "ماستر ميكس" (MM) من نادي الفأر بلوك دينار بحريني (الجرذ مكافحة فأر CD16/32 ريتوكسيماب) المخفف في SM 3٪، في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل على الجليد. كنقطة انطلاق، واستخدام 1 بلوك التيسير ميكروغرام في SM 3 في المائة عن الحجم النهائي من 50 ميكرولتر، لكل بئر.
  4. إزالة بعناية طاف من كل بئر من لوحة V-96-أسفل بشكل جيد من قبل لوحة للقلب بسرعة فوق ومرة ​​أخرى، أكثر من حاوية النفايات أو بالوعة دون انقطاع من الكريات الخلية.
  5. دوامة، أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة التيسير MM بلوك لمدة 5 ثوان، وإضافة 50 ميكروليتر لجميع الكريات في لوحة V-96-أسفل أيضا. مزيج جيد من قبل pipetting بلطف صعودا ونزولا، وترك العينات في آبارهم. احتضان لوحة لمدة 15 دقيقة في الظلام على الجليد. لوحة أجهزة الطرد المركزي في 12000 دورة في الدقيقة (250-300 XG) لمدة 5 دقائق.
  6. تعد "ماستر ميكس" (MM) من ملون تألقي مترافق الأجسام المضادة المخفف في SM 3٪ في أنبوب microcentrifuge 1.5ml على الجليد، في حين أن العينات احتضان مع كتلة لكرة القدم. وينبغي معاير الأضدادلتحديد التخفيفات الأمثل لتلطيخ الاجراءات. كنقطة بداية، تجمع بين تخفيف 1:25 من ماك FITC-1 و 1:20 تخفيف من GR-APC-1 في SM 3 في المائة عن الحجم النهائي من 50 ميكرولتر، لكل نموذج جيد.
  7. إزالة بعناية طاف من كل بئر من 96-جيدا أسفل-V كما هو موضح سابقا.
  8. دوامة، أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة ملم من الأجسام المضادة تلطيخ فلوري، مترافق لمدة 5 ثوان، وإضافة 50 ميكروليتر إلى مراقبة وكريات التجريبية. مزيج جيد من قبل pipetting بلطف صعودا ونزولا. عن واحد وصمة عار التعويضات، إضافة إلى تخفيف 1:25 من ماك FITC-1، 1:20 تخفيف من GR-APC-1 و 75 نانوغرام / مل من دابي، في SM 3 في المائة عن الحجم النهائي من 50 ميكروليتر لكل بئر إلى الآبار الخاصة بكل منها. إضافة 50 ميكرولتر SM 3٪ لغير ملوثين جيدا (لا اللطخة). تخلط جيدا واحتضان خلايا في 96-V-جيدا لوحة أسفل لمدة 30 دقيقة في الظلام على الجليد.
  9. التسمية FACS أنابيب (5 مل، 12 مم × 75 مم البوليسترين أنابيب أسفل وإيابا) لتتوافق مع كل بئر في لوحة 96-V-أسفل جيدا. إضافة 200 ميكروليتر SM 3٪ لكل FACSأنبوب.
  10. لوحة أجهزة الطرد المركزي في 12000 دورة في الدقيقة (250-300 XG) لمدة 5 دقائق وإزالة supernatants. غسل الكريات وذلك بإضافة 100 ميكروليتر SM 3٪ لكل بيليه ومزيج جيد من قبل pipetting بلطف صعودا ونزولا. لوحة أجهزة الطرد المركزي في 12000 دورة في الدقيقة (250-300 XG) لمدة 5 دقائق. تكرار غسل الخطوة مرة واحدة أكثر.
  11. إزالة بعناية طاف من كل بئر من 96-جيدا أسفل-V كما هو موضح سابقا. Resuspend كل بيليه في SM ميكرولتر 100 3٪، وتخلط جيدا.
  12. نقل 100 ميكروليتر بيليه معلق من كل بئر من لوحة V-96-أسفل جيدا لأنبوب من نظام مراقبة الأصول الميدانية وصفت على التوالي.
  13. قبل تحليل التدفق الخلوي، إضافة 75 نانوغرام / مل دابي لمراقبة ونماذج تجريبية ودابي واحدة تحكم تعويضات وصمة عار.
  14. أداء اكتساب تدفق البيانات cytometric النسب المئوية MDSC. أداء التعويض باستخدام السلبية (أي سيطرة وصمة عار)، والضوابط واحدة إيجابية. تشكيل لمؤامرة نقطة الذي يعرض المبعثر إلى الأمام (FSC) مقابل الجانب (SSC) في نطاق السجل بحيث الكريات البيض من السكانويمكن تحديد الفائدة. رسم بوابة كبيرة على كل الكريات البيض، مع استبعاد كتل الحطام ومع أدنى إلى الأمام والتشرذم الجانب. من هذا الباب الرئيسي، وخلق مؤامرة نقطة جديد يعرض أمن الدولة مقابل دابي وبوابة على خلايا دابي-(حي). حدد هذه الفئة من السكان بوابات حديثا، وخلق نقطة مؤامرة التي تعرض ماك-1 مقابل 1 غ وعلى بوابة إيجابي الخاص مزدوجة (ماك-1 + GR-1 +) MDSC.

4. المغناطيسي إثراء GR-1 + الكريات البيضاء

  1. قسامة 1x10 7 الكريات البيض غير ملوثين المتبقية في أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية وصفت بشكل مناسب وأجهزة الطرد المركزي في 12000 دورة في الدقيقة (250-300 XG) لمدة 5 دقائق.
  2. إعداد ملم غرام-1-PE الضد في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. لمدة تصل إلى 10 7 خلايا، واستخدام الموارد الوراثية تخفيف 1:10-1-PE الأجسام المضادة في 50 ميغابايت ميكرولتر، لكل عينة. بالنسبة لأعداد أكبر خلية، زيادة حجم وفقا لذلك. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لمدة 5 ثوان، إضافة إلى الكريات البيض في أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية، واحتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية في الظلام. أضف 2 مل من ميغابايت إلى أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية، الطرد المركزي في 12000 دورة في الدقيقة (250-300 XG) لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف.
  3. إعداد MM المضادة للPE MicroBeads في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. لمدة تصل إلى 10 7 خلايا، استخدم تخفيف 01:04 المضادة للPE MicroBeads في 200 ميغابايت ميكرولتر، لكل عينة. بالنسبة لأعداد أكبر خلية، زيادة حجم وفقا لذلك. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لمدة 5 ثوان، إضافة إلى الكريات البيض في أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية، واحتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية في الظلام.
  4. أضف 2 مل من ميغابايت إلى أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية، الطرد المركزي في 12000 دورة في الدقيقة (250-300 XG) لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف. Resuspend بيليه في 3 مل من بينالي الشارقة. تصفية من خلال مصفاة ميكرون 70 إلى جديد، وصفت أنبوب 50 مل مخروطي.
  5. إعداد ورئيس سيارات فاصل برو أجهزة ماكينتوش. إعادة ملء الزجاجات مع جميع الحلول المناسبة وإفراغ زجاجة من النفايات، وإذا لزم الأمر. بدوره على صك ودراسة وضع حاويات السوائل والعمود (ق) بعد التهيئة. وينبغي أن تكون جميع الرموز الخضراء. في القائمة، حدد "الفصل" من أعلى شريط القوائم تليها "غسل الآن" من شريط أدنى القائمة. حدد "شطف" من خيار المنبثقة تليها "تشغيل" لبدء عملية فتيلة. وبمجرد الانتهاء بنجاح عملية فتيلة، فإن صك ثم عرض على انه "جاهز للفصل" في ظل الحالة القائمة.
  6. اختيار مناسب رف أنبوب مبرد لأحجام الأنابيب ومكان 50 مل أنبوب مخروطي مع الخلايا المسماة مغناطيسيا في صف، أنبوب 50 مل مخروطي لجمع جزء سلبي في صف B و 15 مل أنبوب مخروطي الشكل لجمع جزء إيجابي في صف جيم
  7. اختيار "POSSEL_S" فصل خلية برنامج لاختيار إيجابي من الخلايا المستهدفة وصفت في وضع حساس من العينات. يتم الاحتفاظ الخلايا المستهدفة وصفت مغناطيسيا على العمود automats؛ يتم الافراج الخلايا غير المسماة في أنبوب جمع جزء سلبي في صف باء على تراجع الآلي من المغناطيس، وسوف يتم الافراج عن الخلايا المستهدفة وصفت في أنبوب جمع إيجابي في C صف من أنبوب رف.

> 5. بعد فرز تحليل GR-1 + الكريات البيضاء اليورانيوم

  1. إعادة فرز الأصوات GR-1 + و GR-1 - الكسور باستخدام التريبان الزرقاء وعدادة الكريات أ. Resuspend الخلايا في تركيز المطلوب في المتوسط ​​تلطيخ 3٪ حتى 50 ميكرولتر ما يعادل 5x10 الخلايا 6 5-1x10 (1x10 7 خلية / مل - 2x10 7 خلية / مل)، وتحويل 50 ميكروليتر إلى أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية في المقابل وصفت.
  2. إعداد ملم ماك-1 فقط، حتى التخفيف 01:25 في SM 3 في المائة عن الحجم النهائي من 50 ميكروليتر لكل عينة. وصمة عار الخلايا وإعداد التعويضات وصمة عار واحد من GR-PE FITC ماك-1، ودابي لتحليل التدفق الخلوي. إضافة 200 ميكروليتر SM 3٪ ودابي صبغ البقاء كما هو موضح سابقا.
  3. أداء اكتساب تدفق البيانات cytometric لتحديد GR-1 + و GR-1 - النسب المئوية ومقارنة أيضا النسب المئوية MDSC تخصيب اليورانيوم قبل وبعد autoMACS.

6. ممثل النتائج

هنا نعرض ص epresentative النتائج لتخصيب autoMACS من الكريات البيض + GR-1 من الطحال، مجمعة ساذجا لنظام مراقبة الأصول الميدانية لاحق من فرز MDSC (الشكل 1). تم صبغ 1x10 6 الكريات البيض ساذجا مع ماك FITC-1 والأجسام المضادة GR-1-APC لتحديد النسب المئوية MDSC باستخدام أداة LSRII دينار بحريني، وذلك قبل الفرز autoMACS. تم صبغ ثم 1x10 7 الكريات البيض ساذجا مع المضادة للGR-1-PE الأجسام المضادة وMicroBeads PE-لتخصيب اليورانيوم من الكريات البيض + GR-1 باستخدام فاصل برو autoMACS. بعد autoMACS التخصيب، GR-1 النسب المئوية في GR-1 + و GR-1 - تم تقييم الكسور جمعها باستخدام التدفق الخلوي. أزيلت 1x10 6 GR-1 + الكريات البيض وملطخة ماك-1-FITC الأجسام المضادة لتحليل ومقارنة نسب MDSC من اليورانيوم، تجمع الكريات البيض المخصب من السذاجة عدم، مجمعة الحاملة للورم الكريات البيض من قبل التدفق الخلوي.

fig1.jpg "/>
تخصيب AutoMACS الرقم 1. من السذاجة الكريات البيض + GR-1 لنظام مراقبة الأصول الميدانية MDSC الفرز. كانت تحصد الطحال من الفئران الحاملة للورم البنكرياس والسذاجة ومعالجتها إلى وحيدة الخلية تعليق. تدفق تحليل الخلوي من سطح الكريات البيض ساذجا ملطخة ماك-1 و GR-1-الأضداد فلوري مترافق، وذلك قبل لتخصيب autoMACS (A). تدفق تحليل الخلوي من GR-1 + (ب) والصف 1 - (ج) في مرحلة ما بعد الكسور autoMACS تخصيب خلايا + GR-1 من السذاجة leuckocytes المجمعة ملطخة GR-1-PE الأجسام المضادة والمعادية للMicroBeads PE. تدفق تحليل الخلوي من MDSC وغرام 1 + النسب المئوية بعد autoMACS تخصيب GR-1 + خلايا الكريات البيضاء من السذاجة المجمعة (D) بالمقارنة مع غير المخصب الكريات البيض المجمعة من الفئران الحاملة للورم (E) (الفئران ساذجا، ن = 5 ؛ الفئران الحاملة للورم، ن = 3). MDSC والنسب المئوية GR-1 هي بوابات في المؤامرات كفاف ممثل ورسوم بيانية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هذه هي طريقة مفصلة لتجهيز وimmunophentyping السكان MDSC التي تنطبق على الأنسجة اللمفاوية المختلفة من مختلف النماذج الحيوانية. على وجه الخصوص، يمكن استخدام تخصيب autoMACS لعزل السكان الكريات البيض المختلفة بما في ذلك استنزاف-1 غرام من splenocytes وتنقية الدم النخاعي من مجموعات فرعية من splenocytes والغدد الليمفاوية والعزلة من العدلات نخاع العظم 14 و تنقية من CD8 + الخلايا التائية من الطحال الغدد الليمفاوية و 15. بغض النظر عن عدد السكان خلية من الفائدة، ومطلوب توليد وحيدة الخلية تعليق من الكريات البيض من أنسجة اللمفاوية المطلوب لتلطيخ سطح الأمثل، وتدفق تحليل الخلوي، والإثراء autoMACS والفرز نظام مراقبة الأصول الميدانية. في هذا البروتوكول، وكنا ميكانيكية التفكك لإنشاء تعليق خلية واحدة من الكريات البيض. ومع ذلك، باستخدام انزيم الهضم مثل D كولاجيناز هو أيضا بديل مناسب لهذا البروتوكول لزيادةالعائد من الكريات البيض من الطحال أو الأجهزة اللمفاوية الأخرى 5.

التدفق الخلوي هو أسلوب مهم لكريات الدم البيضاء المناعي الظاهري. ولذلك، من الاستعداد الكافي للالتدفق الخلوي وإثراء يتطلب أيضا استخدام مخازن مناسبة لتعليق الخلية والتخفيف من الكواشف الأجسام المضادة. العديد من البروتوكولات بالتناوب بين FBS وديوان الرقابة المالية لإعداد وسائل الاعلام وتلطيخ عازلة أجهزة ماكينتوش. ومع ذلك، هذه الكواشف هي أيضا متاحة تجاريا من شركات مثل eBioscience Pharmingen دينار بحريني، وبيوتيك Miltenyi. كما أوضح بيوتيك Miltenyi وeBioscience، على حد سواء جيش صرب البوسنة ومنع FBS غير محددة ملزمة عندما تلطيخ الكريات البيض مع ملون تألقي مترافق الأجسام المضادة. الأهم من ذلك، نسب منخفضة من البروتينات الحيوانية هذه المصل الحفاظ على سلامة ومنع تراكمها من الكريات البيض 16. ومع ذلك، من واقع تجربتنا، BSA تعمل على نحو أفضل لتلطيخ الأمثل وأفضل حل لتخصيب autoMACS من FBS وغير recommenدائرة التنمية الاقتصادية في البروتوكول وصفها.

في هذا البروتوكول، وتتميز نحن MDSC الفئران باستخدام CD11b-FITC وGR-1-APC الأجسام المضادة فلوري، مترافق والتدفق الخلوي. لا بد من معايرة هذه الأجسام المضادة قبل استخدامها للحد من ارتفاع تلطيخ مضان الخلفية لمنع غير الأمثل النتائج. وبالإضافة إلى ذلك، عند اختيار الأجسام المضادة لتدفق متعدد الألوان تحليل الخلوي والتداخل الطيفي المحتملة للfluorochromes هو أيضا عامل آخر حاسم للنظر 17،18. ولذلك، تسيطر على تعويضات في شكل بقع لون واحد عن كل الأجسام المضادة fluorochome مترافق من الخرز مصلحة أو التعويض، ويمكن تصحيح لقضايا التداخل الطيفي 18. وهناك اعتبار آخر مهم لدقة النتائج التدفق الخلوي هو استخدام الأصباغ جدوى. يمكن أن الخلايا الميتة غير محدد ربط الأجسام المضادة، وبالتالي خلق نتائج ايجابية كاذبة 19. في هذا البروتوكول، ونحن استخدام الحمض النووي وصمة عار، كما دابي صبغة حيوية للاستبعاد الخلايا الميتة من تحليلاتنا لأنها تكمل أفضل لوحة من ملون تألقي، مترافق مع الأجسام المضادة المستخدمة تداخل الأطياف الحد الأدنى. ومع ذلك، يمكن استخدام الأصباغ جدوى أخرى مثل 7-D Aminoactinomycin (7-AAD) وpropidium يوديد (بي) مع وسائل تلطيخ صفت اعتمادا على لوحة من الأجسام المضادة المستخدمة. حاليا، هناك أيضا عددا من البقع يمكن حلها خلية ميتة المتاحة التي تسمح لتكون ثابتة الخلايا الملون وpermeabilized دون أن تفقد القدرة على التمييز جدوى (إينفيتروجن). عموما، وتقنيات التلوين الأخرى مهمة أيضا لدقة تدفق تحليل الخلوي. على سبيل المثال، في هذا البروتوكول، واستخدام لوحات V-96-أسفل جيد يسمح لكميات صغيرة ومركزة من الخلايا والكواشف لاستخدامها في تحليل النسب MDSC والكريات البيض باستخدام التدفق الخلوي. استخدام مزيج ماجستير (MM) النهج هو أيضا تقنية هامة لوضع العلامات المناعي على قدم المساواة من الكريات البيض في أحجام صغيرة باستخدام إما 96-V-جيدا أسفل ررآتش أو أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية. هذه التقنيات تقلل من خطر التلوث عبر العينات، والحفاظ على أجسام مضادة عقيمة وتقليل كمية من الكواشف والأجسام المضادة المستخدمة.

فاصل برو autoMACS يسمح للعزلة فعالة وآلية للسكان الخلية من عينات متعددة، في أي نوع من الأنواع. في هذا البروتوكول، يتم استخدام العلامات المغناطيسي غير مباشر من الكريات البيض باستخدام GR-1-PE الأجسام المضادة والمغناطيسية MicroBeads PE لتخصيب autoMACS من الكريات البيض + GR-1. يمكن تعديل هذا الإجراء لفصل autoMACS باستخدام MicroBeads إلى الأجسام المضادة الأولية الأخرى ملون تألقي مترافق، والمعقدة البيروكسيديز unconjugated لإثراء مختلف السكان الخلية 20. ومع ذلك، في هذا الإجراء، ونحن نوصي بشدة باستخدام PE-مترافق الأجسام المضادة والمعادية للPE-microbeads مقابل FITC على سبيل المثال، كما يقال للجزيء PE لديها مواقع متعددة ملزمة، مما أدى إلى وضع البطاقات المغناطيسية أقوى وأفضل (Miltenyi بيوتيك ). آخر فossible تعديل على هذا البروتوكول هو استخدام الوسم المغناطيسي مباشرة كما أن هناك طائفة واسعة من MicroBeads MACS لعزل الماوس والبشرية والكريات البيض الفئران (Miltenyi بيوتيك). ومع ذلك، ووضع العلامات المغناطيسي غير مباشر باستخدام الأجسام المضادة ملون تألقي مترافق أساسي يسمح لتقييم التدفق الخلوي من جزيئات اليورانيوم المنضب أو الكريات البيض دون الحاجة لتلطيخ إضافية. وهناك أيضا مجموعة متنوعة من فواصل MACS المتاحة ولكن فاصل برو autoMACS النظام هو مفيد لأنه يتيح للفرز، عالية السرعة الآلي لمدة تصل إلى ست عينات للاختيار لطيف من الكريات البيض قادرة على البقاء إلى حد كبير، بالمقارنة مع فواصل MACS دليل. ومع ذلك، دليل MACS فواصل هي بدائل مناسبة للفاصل برو autoMACS، إذا كانت متوفرة. وإلى مزيد من إثراء السذاجة GR-1 + الكريات البيض، وتعديل محتمل في هذا البروتوكول تكون لإعادة تشغيل جزء التي تم جمعها بصورة إيجابية باستخدام عمود autoMACS جديدة على فاصل autoMACS برو. تخصيبمن GR-1 لا ينصح + الحاملة للورم الكريات البيض باستخدام فاصل برو autoMACS في هذا البروتوكول منذ هذه النتائج في الحد بشكل كبير من انتعاش من الكسور-1 غرام مثل هذه الخلايا تميل إلى التمسك الأعمدة خلال تخصيب اليورانيوم في مقابل الكريات البيض ساذجا . ولذلك، فإن هذا البروتوكول توصي بقوة تجميع الحاملة للورم الكريات البيض لنظام مراقبة الأصول الميدانية لاحق من فرز MDSC قابلة للحياة.

قبل التخصيب، تجمع الكريات البيض ساذجة والمجمعة يمكن أن تستخدم الحاملة للورم الكريات البيض لتطبيقات المستقبل مثل السرعة المنخفضة FACS فرز لعزل السكان MDSC. تم تصميمه خصيصا لهذا البروتوكول للتحايل على نظام مراقبة الأصول الميدانية مملة والوقت المناسب لفرز MDSC من الفئران السذاجة، التي من المقرر أن النسب أقل بكثير من MDSC. AutoMACS تخصيب اليورانيوم من الكريات البيض + GR-1 من الفئران ساذجة ثم يسمح لنظام مراقبة الأصول الميدانية السريعة ومريحة وفعالة من فرز MDSC قابلة للحياة وظيفية لاستخدامها في في الجسم الحي وفي التجارب المختبرية. الفرز مباشرة من خلية وأعرب المتواضع السكان مثل MDSC السذاجة هي عملية غير فعالة للغاية مع أوقات فرز طويلة، وارتفاع التكاليف وانخفاض استرداد الخلية وقدرتها على البقاء. إعداد وautoMACS تخصيب اليورانيوم من الكريات البيض + GR-1 من الفئران السذاجة يستغرق حوالي 45 دقيقة وزيادة نسب MDSC أكبر من أمثالها-4 (الشكل 1). هذا تخصيب يقلل من الوقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية من فرز ما يقرب من 12 ساعة لغير المخصب الكريات البيض إلى ما يقرب من 20-30 دقيقة لعزل ما لا يقل عن 6 1x10 قابلة للحياة MDSC المخصب، من الكريات البيض ساذجا المجمعة. ولكن الكريات البيض، FACS فرز MDSC قابلة للحياة من غير المخصب، مجمعة من الفئران الحاملة للورم تتطلب وقتا أقل بسبب وفرة زيادة نسب MDSC استجابة لعبء الورم. من المهم أن نلاحظ أن ويمكن بعد ذلك فرز MDSC الكريات البيض وغيرها من أن تستخدم في كل من المقايسات وظيفية مثل ردود فعل متباينة الكريات البيض (عالم حواء) 21 في الجسم الحي تجارب نقل بالتبني وكذلك في غير وظيفية بما في ذلك فحوصات qRT-PCR 22، 23 و لطخة غربية cytospin / تحليلات المجهري 14. عموما، يمكن تعديل هذا البروتوكول بالنسبة المناعي الظاهري وتخصيب الكريات البيضاء للمناعة وغيرها من الأنسجة اللمفاوية أو الدم المحيطي من الجرذان والفئران والبشر ليتم استخدامها في عدد كبير من المجراة في وفحوصات المختبر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نعترف التدفق الخلوي USF مرفق الأساسية. نود أن نشكر الدكتور دنيس كوبر لتقاسم الموارد. ونود أيضا أن نشكر مايا كوهين، بندلتون لورا لاتور وديانا لما قدموه من مساعدة في إعداد وتصوير هذا الفيديو. NN بدعم من جبهة الخلاص الوطني FG-LSAMP جسر لتنمية الموارد البشرية دكتوراه زمالة # 0929435. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الجمعية الأميركية للسرطان المؤسسية للبحوث غرانت # مركز السرطان 93-032-13/Moffitt منحت لTG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X Phosphate Buffered Saline Thermo Scientific Hyclone SH30028.02 Ca2+/Mg2+/Phenol Red-free
Albumin from Bovine Serum (BSA) Sigma-Aldrich A7906 Let BSA dissolve undisturbed in PBS; Sterile Environment
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Scientific Hyclone SV3001403HI Heat Inactivated; Sterile Environment
Rat anti-mouse CD16/32 monoclonal antibody (Fc Block) BD Biosciences 553142 Sterile Environment
Anti-mouse CD11b (Mac-1) FITC eBioscience 11-0112 Sterile Environment
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) APC eBioscience 17-5931 Sterile Environment
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) PE eBioscience 12-5931 Sterile Environment
DAPI Invitrogen D1306 Serial Dilution Sterile Environment
Cell Dissociation Sieve Sigma-Aldrich CD1-1KT Autoclave before use
70-μm strainer BD Biosciences 352350 Sterile Environment
1X RBC Lysis Buffer eBioscience 00-4333-57 Warm to room temperature before use; Sterile Environment
Petri dishes Fisher Scientific 08-757-12 Sterile Environment
50ml conical tubes Thermo Fisher Scientific, Inc. 339652 Sterile Environment
5ml 12X75mm polystyrene round bottom tubes BD Biosciences 352054 Known as FACS tubes; Sterile Environment
96-well V-bottom plates Corning 3897 Sterile Environment
Trypan Blue Cellgro 25-900-CI Sterile Environment
PE MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801 Sterile Environment
AutoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec 130-092-545
AutoMACS Columns Miltenyi Biotec 130-021-101
AutoMACS Running Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goni, O., Alcaide, P., Fresno, M. Immunosuppression during acute Trypanosoma cruzi infection: involvement of Ly6G (Gr1(+))CD11b(+) immature myeloid suppressor cells. Int. Immunol. 14, 1125-1134 (2002).
  2. Zhu, B. CD11b+Ly-6C(hi) suppressive monocytes in experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Immunol. 179, 5228-5237 (2007).
  3. Makarenkova, V. P., Bansal, V., Matta, B. M., Perez, L. A., Ochoa, J. B. CD11b+/Gr-1+ myeloid suppressor cells cause T cell dysfunction after traumatic stress. J. Immunol. 176, 2085-2094 (2006).
  4. Ghansah, T. Expansion of myeloid suppressor cells in SHIP-deficient mice represses allogeneic T cell responses. J. Immunol. 173, 7324-7330 (2004).
  5. Paraiso, K. H., Ghansah, T., Costello, A., Engelman, R. W., Kerr, W. G. Induced SHIP deficiency expands myeloid regulatory cells and abrogates graft-versus-host disease. J. Immunol. 178, 2893-2900 (2007).
  6. Yin, B. Myeloid-derived suppressor cells prevent type 1 diabetes in murine models. J. Immunol. 185, 5828-5834 (2010).
  7. Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nat. Rev. Immunol. 9, 162-174 (2009).
  8. Gallina, G. Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells. J. Clin. Invest. 116, 2777-2790 (2006).
  9. Zhao, F. Increase in frequency of myeloid-derived suppressor cells in mice with spontaneous pancreatic carcinoma. Immunology. 128, 141-149 (2009).
  10. Greten, T. F., Manns, M. P., Korangy, F. Myeloid derived suppressor cells in human diseases. Int Immunopharmacol. 11, 802-806 (2011).
  11. Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Immunol. 181, 5791-5802 (2008).
  12. Ribechini, E., Greifenberg, V., Sandwick, S., Lutz, M. B. Subsets, expansion and activation of myeloid-derived suppressor cells. Med. Microbiol. Immunol. 199, 273-281 (2010).
  13. Pilon-Thomas, S. Murine Pancreatic Adenocarcinoma Dampens SHIP-1 Expression and Alters MDSC Homeostasis and Function. PLoS One. 6, (2011).
  14. Panopoulos, A. D. STAT3 governs distinct pathways in emergency granulopoiesis and mature neutrophils. Blood. 108, 3682-3690 (2006).
  15. Preynat-Seauve, O. Extralymphatic tumors prepare draining lymph nodes to invasion via a T-cell cross-tolerance process. Cancer Res. 67, 5009-5016 (2007).
  16. Davies, D. Cell separations by flow cytometry. Methods Mol. Med. 58, 3-15 (2001).
  17. Maecker, H., Trotter, J. Selecting reagents for multicolor BD flow cytometry. Postepy Biochem. 55, 461-467 (2009).
  18. Bagwell, C. B., Adams, E. G. Fluorescence Spectral Overlap Compensation for Any Number of Flow Cytometry Parameters. Annals of the New York Academy of Sciences. 677, 167-184 (1993).
  19. Perfetto, S. P. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).
  20. Safarik, I., Safarikova, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 722, 33-53 (1999).
  21. Collazo, M. M. SHIP limits immunoregulatory capacity in the T-cell compartment. Blood. 113, 2934-2944 (2009).
  22. Mack, E., Neubauer, A., Brendel, C. Comparison of RNA yield from small cell populations sorted by flow cytometry applying different isolation procedures. Cytometry. A. 71, 404-409 (2007).
  23. Strauss, L., Czystowska, M., Szajnik, M., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. Differential responses of human regulatory T cells (Treg) and effector T cells to rapamycin. PLoS One. 4, e5994 (2009).

Comments

2 Comments

  1. very good

    Reply
    Posted by: jin f.
    July 1, 2012 - 10:01 AM
  2. excellent

    Reply
    Posted by: Somayeh A.
    January 24, 2014 - 10:22 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics