Isolement de la chromatine par purification d'ARN (CHIRP)

L’objectif général de l’expérience suivante est de déterminer les régions d’ADN associées à un ARN non codant spécifique à l’aide de la QPCR ou du séquençage à haut débit. Ceci est réalisé en réticulant les cellules pour piéger les interactions natives D-N-A-R-N-A in vivo. Dans un deuxième temps, les cellules sont lysées et soumises à une sonication pour solubiliser le lysat cellulaire et la chromatine pure en petits fragments.

Ensuite, des oligo-oligos antisens biotinylés sont ajoutés au lysat cellulaire afin d’enrichir spécifiquement les complexes R-N-A-D-N-A d’intérêt, des résultats sont obtenus qui élucident l’identité des sites génomiques liés à l’ARN non codant sur la base de la QPCR ou du séquençage à haut débit. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que R-N-A-D-N-A FISH, est que le chirp permet des cartes à l’échelle du génome des sites de liaison d’ARN non codants à des résolutions proches de la paire de bases. Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’ARN non codant, telles que la façon dont les roches, les ARN et les mouches mâles obtiennent une compensation de dosage.

Les implications de cette technique, l’étendue vers les thérapies des maladies non codantes liées à l’NA car elle permet de mieux comprendre comment les ARN non codants régulent les états de la chromatine et l’expression des gènes. Pour cette expérience d’isolement de la chromatine par purification de l’ARN ou chirp, 40 millions de cellules seront récoltées après centrifugation, décantation du PBS et élimination du liquide restant en aspirant soigneusement à un angle délogeant la pastille cellulaire en tapotant le fond du tube de faucon. Ajoutez du glutaraldéhyde à 1 % fraîchement préparé, en commençant par un petit volume et remettez en suspension la pastille cellulaire jusqu’à son volume complet, puis inversez pour mélanger la réticulation pendant 10 minutes à température ambiante sur un agitateur de bout en bout ou un rotateur, éteignez la réaction de réticulation avec un 10e volume de 1,25 molaire de glycine et laissez sur un agitateur à température ambiante pendant cinq minutes, Les cellules deviendront orange vif.

Ensuite, essorez à 2000 RCF pendant cinq minutes, décantez et aspirez le surnageant et lavez à nouveau la pastille avec 20 millilitres de spin PBS réfrigéré, aspirez le surnageant et remettez en suspension le palais réticulé lavé avec du PBS réfrigéré. Transférez chaque millilitre de cellules dans un tube einor et tournez à 2000 RCF pendant trois minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, utilisez une pointe de pipette pour prélever soigneusement autant de PBS que possible.

Flashez, congelez toutes les pastilles de cellules dans de l’azote liquide et stockez-les indéfiniment à moins 80 degrés Celsius. Pour préparer le lysat cellulaire pour le chirp, décongelez les pastilles de cellules réticulées congelées à température ambiante. Tapotez fort pour déloger et mélanger la pastille de cellule.

Faites tourner les pastilles et utilisez une pointe de pipette pointue de 10 microlitres pour éliminer tout PBS restant sur une balance électronique précise au milligramme près. Déchirez la masse d’un tube einor vide. Pesez chaque granule et notez son poids.

Ajoutez 10 x volume de tampon de lyse complété par un inhibiteur de protéase frais PMSF et super ace dans chaque tube et remettez la pastille en suspension. Le lysat cellulaire doit être consommé immédiatement après sa préparation. Ne transférez pas plus de 1,5 millilitre de lysat dans chaque tube de faucon de 15 millilitres et insérez les sondes de sonication en les vissant fermement.

Ensuite, placez les tubes dans une rupture biologique, soniquez à quatre degrés Celsius au réglage le plus élevé avec 30 secondes sur 45 secondes d’intervalles d’impulsion. Vérifiez le lysat toutes les 30 minutes. Continuez le sonicate jusqu’à ce que le lysat cellulaire ne soit plus trouble.

Cela peut prendre de 30 minutes à quatre heures selon le nombre de tubes, le volume de l’échantillon, la température du bain et la période de sonication. Lorsque le lysat devient clair, transférez cinq microlitres dans un tube einor frais. Ajoutez de l’ADN, de la protéase K, du tampon et du vortex de protéase K pour mélanger et tourner brièvement vers le bas, incuber brièvement pendant 45 minutes à 50 degrés Celsius après avoir extrait l’ADN avec un kit de purification PCR.

Vérifiez la taille de l’ADN sur un gel à 1 %. La majeure partie du frottis d’ADN doit être de 100 à 500 paires de bases, indiquant une centrifugeuse de sonication complète. Un millilitre aliquote d’échantillons soniqués à 16, 100 RCF pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, transfère le surnageant dans des tubes einor frais et congélation instantanée dans de l’azote liquide pour commencer la procédure de décongélation des tubes de chromatine à température ambiante pour un échantillon de chirp typique.

À l’aide d’un millilitre de lysat, prélever 10 microlitres pour l’entrée d’ARN et 10 microlitres pour l’entrée d’ADN et les placer dans des tubes einor. Garder sur la glace jusqu’à nouvel ordre. Utilisez le transfert d’un millilitre de chaque échantillon de chromatine dans un tube de faucon de 15 millilitres.

Ajoutez deux millilitres de tampon d’hybridation dans chaque tube. Ensuite, décongelez les sondes à température ambiante. Ces oligonucléotides biotinylés sont marqués en fonction de leur position le long de l’ARN et séparés en deux bassins.

Le pool pair contient toutes les sondes avec des numéros pairs. Et le pool impair contient des sondes avec des nombres impairs. Toutes les expériences sont réalisées à l’aide des deux bassins qui servent de contrôles internes l’un pour l’autre.

L’un des aspects les plus difficiles du véritable protocole est que toutes les étapes d’hybridation et de lavage doivent être effectuées à 37 degrés. Pour assurer une température expérimentale constante, effectuez toutes les étapes dans ou à proximité d’un four d’habitisation, ajoutez le volume approprié de sondes à des tubes spécifiques. Bien mélanger, incuber à 37 degrés pendant quatre heures en secouant 20 minutes avant la fin de l’hybridation.

Préparez les perles magnétiques C one. Utilisez 100 microlitres pour 100 pico-mole de sondes. Laver trois fois avec un tampon de lyse supplémentaire d’un millilitre à l’aide de l’aimant à deux bandes Dyna mag pour séparer les billes du tampon.

Après le lavage final, réhydratez les billes en suspension dans le volume d’origine du tampon de lyse et complétez avec du PMSF frais et un inhibiteur de protéase. Lorsque la réaction d’hybridation de quatre heures est terminée, ajoutez 100 microlitres de billes à chaque mélange de tubes. Bien incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes avec des billes de lavage secouantes avec un millilitre de tampon de lavage préchauffé à 37 degrés Celsius lors du premier lavage.

Utilisez une bande magnétique dyna mag 15 pour séparer les billes, décantez et remettez en suspension dans un tampon de lavage d’un millilitre, transférez-les dans un tube EOR de 1,5 millilitre. Incuber à 37 degrés Celsius en agitant pendant cinq minutes lors des lavages suivants, faites tourner chaque tube dans une mini-centrifugeuse et placez l’échantillon sur une bande magnétique dyna mag two pour un échantillon de décantation d’une minute. Essuyez toutes les gouttes avec une lingette Kim et remettez en suspension dans un millilitre.

Lavez le tampon, incubez à 37 degrés Celsius en secouant pendant cinq minutes. Répétez l’opération pour un total de cinq lavages lors du dernier lavage Resus. Suspendez bien les billes, retirez 100 microlitres et réservez pour l’isolement de l’ARN une réserve de 900 microlitres pour la fraction d’ADN.

Placez tous les tubes sur la bande magnétique dyna mag tube et retirez le tampon de lavage. Après un bref tournage, placez à nouveau le tube sur la bande magnétique à l’aide d’une pointe de pipette pointue de 10 microlitres. Retirez complètement le tampon de lavage restant de chaque tube.

Les fractions d’ARN et d’ADN sont ensuite isolées à partir des échantillons de chirp pour la quantification et le séquençage. Cette figure montre l’enrichissement de la télomérase, de l’ARN ou du Turk humain à partir de cellules HELOC sur GA dh. Un ARN cellulaire abondant qui sert de contrôle négatif.

La majorité de l’ARN turc présent dans la cellule, environ 88 %, a été abattu en effectuant des chirps, tandis que seulement 0,46 % de l’ARN GA DH a été récupéré, démontrant un facteur d’enrichissement d’environ 200 fois. Régions d’ADN censées se lier à la cible. Les ARN longs non codants sont généralement enrichis sur des régions négatives lorsqu’ils sont mesurés par QPCR.

Cette figure montre la validation QPCR de quatre sites liés à l’air chaud dans des fibroblastes primaires du prépuce humain déterminés par la réalisation de chirp SSE dans la même lignée cellulaire, tandis que les sites d’ADN Turk et GA DH servent de régions de contrôle négatives. Des ensembles de sondes pairs et impairs ont donné un enrichissement comparable des sites attendus liés à l’air chaud sur des régions négatives. Une caractéristique des vrais sites de liaison à l’ARN longs et non codants.

Une carte mondiale des longs sites de liaison à l’ARN non codant peut être obtenue par séquençage à haut débit de l’ADN enrichi en chirp, comme illustré par ces données de l’ARN long non enrobant Rocks two, qui est connu pour interagir avec le chromosome X d’une manière nécessaire à la compensation de dosage. Les échantillons pairs et impairs ont été séquencés séparément et leurs bruits uniques ont été éliminés pour produire une piste de signaux qui se chevauchent où chaque pic indique une forte vue de roches deux se liant lors de la tentative de cette procédure. Il est important d’exercer une technique libre d’ARN correcte Suite à cette procédure.

D’autres méthodes, telles que le transfert de protéines, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que les protéines qui interagissent avec l’ARNd non clinique d’intérêt après son développement. CHI a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie de l’ARN pour cartographier l’aact des ARN dans les cellules de culture et les tissus fixés.