Name: Isolement de la chromatine par purification dARN (CHIRP) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Découvrez la méthode ChIRP pour cartographier les sites de liaison des ARN longs non codants sur le génome avec une résolution quasi nucléotidique. Cette technique permet d'identifier les régions génomiques associées aux lncRNAs.

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Nous remercions T. Hung, MC. Tsai, O. Manor, E. Segal, M. Kuroda, T. Swigut, et I. Shestopalov pour les discussions. Soutenu par l&#39;Agence de la Science, la Technologie et de la recherche de Singapour (CC), NIH R01 et R01-CA118750-HG004361 (HYC), et le California Institute for Regenerative Medicine (HYC). HYC est un scientifique en début de carrière de l&#39;Institut médical Howard Hughes.

1. Conception de la sonde Conception d&#39;ADN anti-sens de carrelage sondes pour la récupération sélective de l&#39;ARN cible par Chirp. <ol><li> Sondes de conception oligo anti-sens en utilisant le concepteur de sonde en ligne à <a href="http://singlemoleculefish.com">singlemoleculefish.com</a> 18. </li><li> Utilisez ces paramètres: nombre de sondes = 1 / sonde de 100 pb de longueur ARN; 2) Cible GC% = 45; longueur Espacement 4) = 60-80; 3) Longueur = 20 oligonucléotides. Pause d&#39;ARN dans les segments s&#39;il est trop long pour le concepteur. Omettre régions de répétitions ou d&#39;homologie étendue. </li><li> Sondes d&#39;ADN de commande anti-sens avec BiotinTEG à 3-Premier fin. </li><li> Des sondes marqueurs en fonction de leurs positions le long de l&#39;ARN. Séparez-les en deux poules de sorte que le &quot;même&quot; pool contient toutes les sondes au nombre de 2, 4, 6, etc, et le «bizarre» pool contient des sondes au nombre de 1, 3, 5, etc Diluer pool de sondes à une concentration de 100 uM et conserver à -20 ° C. </li><li> Toutes les expériences doivent être effectuées à l&#39;aidedeux piscines, qui servent de contrôles internes pour l&#39;autre. Réel ARN-dépendante du signal serait présent à partir de deux piscines, tandis que la sonde spécifiques bruits serait propre à chaque piscine. Ceci s&#39;applique à la fois pour chirp-qPCR et CHIRP-seq. </li></ol> 2. Les cellules de récolte Recueillir les cellules qui seront utilisées pour l&#39;expérience gazouiller. <ol><li> Cultiver les cellules dans des plaques de culture de tissus ou des flacons à la confluence. Rincer avec un tampon phosphate salin (PBS) et une fois trypsiniser. Quench trypsine avec un volume&gt; 2x des médias, une pipette de haut en bas pour déloger les cellules et remettre en suspension seule cellule. Transférez tous les médias et les cellules remises en suspension dans 50 ml tubes Falcon. 20 millions de cellules sont généralement suffisante pour un échantillon gazouiller. </li><li> Spin cellules à 800RCF pendant 4 min. Aspirer les médias et remettre 40 millions de cellules dans 40 ml de PBS, de combiner les tubes si nécessaire. Spin cellules à 800RCF pendant 4 min. Décanter PBS, aspirer délicatement sur un angle du liquide restant. </li></ol&gt; 3. Croix-lier des cellules et collecte culot cellulaire Crosslink recueillies cellules avec du glutaraldéhyde à préserver l&#39;ARN-chromatine interactions et de préparer culot cellulaire. <ol><li> Effectuez toutes les étapes à température ambiante. </li><li> Préparer glutaraldéhyde à 1% à température ambiante PBS. Préparer 10 ml par 10 millions de cellules (0,4 ml de bouillon de glutaraldéhyde à 25% + 9,6 ml de PBS). Glutaraldéhyde doit être utilisée fraîche. </li><li> Appuyez sur fond de tubes Falcon pour déloger pellets. Resuspendre culot cellulaire dans du glutaraldéhyde à 1%, en commençant par un petit volume pour éviter morceaux, puis compléter à plein volume. Mélanger par inversion. Crosslink pendant 10 minutes à température ambiante sur un agitateur de bout en bout ou des rotateurs. </li><li> Arrêter la réaction de réticulation avec le volume de 1/10e de 1,25 M de glycine à la température ambiante pendant 5 min. </li><li> Centrifuger à 2000RCF pendant 5 min. Aspirer le surnageant et laver culot avec 20 ml refroidi PBS fois, tourne à 2000RCF pendant 5 min. </li><li> Aspirer et remettre en suspension le wcendré, réticulé culot avec 1 ml de PBS par réfrigéré 20 millions de cellules. Transférer chaque ml dans un tube Eppendorf et centrifuger à 2000RCF pendant 3 min à 4 ° C. Retirez autant que possible avec du PBS pointe de la pipette avec soin. </li><li> Flash geler les culots cellulaires dans l&#39;azote liquide et stocker à -80 ° C indéfiniment. </li></ol> 4. Lyse cellulaire Lyser les cellules réticulées à préparer un lysat cellulaire. <ol><li> Décongeler les culots de cellules congelés à température ambiante. Tapez difficile à déloger et mélanger le culot cellulaire. Isoler le culot à 2000RCF pendant 3 min à 4 ° C. Utilisez une forte pointe de la pipette 10 ul de supprimer tout reste PBS. </li><li> Sur une balance électronique (précision de 1 mg) la tare de la masse d&#39;un tube vide Eppendorf (nos tubes pèsent 1.060 grammes très régulièrement). Peser chaque pastille et enregistrer son poids. Un plat complet de 15 cm de cellules HeLa réticulés pèse généralement 100 mg. </li><li> Tampon de lyse Supplément (10X la masse de granulés de bois, par exemple 1 ml pour 100 mg) avec fresquesh Inhibiteur de la protéase, PMSF et Superase-in (voir la liste des tampons ci-jointe). Mélangez bien. </li><li> Ajouter 10X tampon de lyse du volume complété à chaque tube et remettre le culot. Pour de petites boulettes &lt;25 mg, remettre en suspension dans 250 ul de tampon de lyse complétée. La suspension doit être lisse. Si ce n&#39;est pas, il faut diviser la suspension en 500 aliquotes et utiliser un véhicule motorisé à granulés mélangeur pour briser les mottes. Procéder immédiatement à une sonication. </li></ol> 5. Sonication ADN cisaillement par sonication réticulés lysats cellulaires. <ol><li> Soniquer lysat cellulaire dans Bioruptor dans 15 ml tubes Falcon. Utilisation &lt;1,5 lysat ml dans chaque tube, et pour accélérer la sonication, sonication pas plus de deux tubes à la fois. </li><li> Soniquer dans un bain d&#39;eau à 4 ° C au réglage le plus élevé avec 30 secondes ON, 45 secondes OFF intervalles d&#39;impulsions. Vérifiez lysat toutes les 30 min. Continuer jusqu&#39;à ce que le traitement aux ultrasons lysat cellulaire est plus trouble. Cela peut prendre aussi peu que 30 minutes et jusqu&#39;à 4 heures. Le nombredes tubes, le volume d&#39;échantillon, la température du bain, et la période de temps de sonication se influer sur la durée du processus prend. Tubes sera probablement sonication à des taux différents, afin de les mettent en commun toutes les 30 min et de le redistribuer dans des tubes d&#39;origine pour assurer l&#39;homogénéité. Remarque: le glutaraldéhyde réticulé cellules prendre beaucoup plus de temps à sonication que leurs équivalents de formaldéhyde. </li><li> Lorsque lysat tourne clair, transférer 5 lysat ul dans un nouveau tube Eppendorf. Ajouter 90 uL d&#39;ADN protéase K (PK) de tampon (buffer voir la liste) et 5 PK ul. Vortex pour mélanger et centrifuger brièvement. Incuber pendant 45 min à 50 ° C. </li><li> Extraire l&#39;ADN avec le kit Qiagen PCR purification. ADN Eluer dans 30 uL tampon d&#39;élution Qiagen (EB) et vérifier la taille de l&#39;ADN sur gel d&#39;agarose 1%. Si en vrac du frottis d&#39;ADN est 100-500 pb, sonication est terminée. Si non, continuer à sonication. </li><li> Centrifuger les échantillons à soniqués 16100RCF pendant 10 min à 4 ° C. Combinez surnageants, aliquotes dans des échantillons de 1 mL et flash-gel dans nitroge liquiden. Conserver à -80 ° C. </li></ol> 6. CHIRP Hybrider des sondes d&#39;ADN à l&#39;ARN biotinylés et d&#39;isoler la chromatine liée. <ol><li> Décongeler complètement les tubes de la chromatine à la température ambiante. </li><li> Préparer un tampon d&#39;hybridation (voir la liste des tampons, de préparer 2 ml par ml de la chromatine). Vortex pour mélanger. </li><li> Pour un échantillon typique de CHIRP avec 1 ml de lysat, retirez 10 uL pour INPUT ARN et 10 uL d&#39;ADN pour INPUT et le lieu dans des tubes Eppendorf. Gardez sur la glace jusqu&#39;à ce une utilisation ultérieure. </li><li> Transférer 1 ml chromatine à 15 ml Falcon tube. Ajouter 2 ml de tampon d&#39;hybridation à chaque tube. Pour volume total &lt;1,5 ml, utiliser des tubes Eppendorf. </li><li> Décongeler sondes à température ambiante. Sondes Nanodrop pour vérifier le montant si vous ne l&#39;avez pas utilisé dans un temps long (100 uM sondes devraient spec ~ 500-600 ng / ul en utilisant unique paramètre brin d&#39;ADN). Ajouter le volume approprié de sondes dans des tubes spécifiques (100 pmol de sonde pour 1 ml de la chromatine, 1 ul de 100 pmol / ul sonde par 1 ml chromatine).Mélangez bien. Incuber à 37 ° C pendant 4 heures avec agitation. </li><li> Avec 20 min en restant pour l&#39;hybridation, préparer les perles C-1 magnétiques (conservé à 4 ° C). Utiliser 100 pi par 100 pmol de sondes. Laver avec 1 ml tampon de lyse sans complément trois fois, en utilisant la bande magnétique dynamag-2 à des billes distinctes de la mémoire tampon. </li><li> Remettre les billes en volume initial de tampon de lyse, supplément avec des produits frais PMSF, PI et Superase en. Après 4 h réaction d&#39;hybridation est terminée, ajouter 100 ul perles à chaque tube. Mélangez bien. Incuber à 37 ° C pendant 30 min avec agitation. </li><li> Préparer le tampon de lavage (5 ml par échantillon). Vortex pour mélanger. Préchauffer à 37 ° C. Ajouter PMSF avant utilisation. </li><li> Laver perles avec 1 ml de tampon de lavage cinq fois. Sur le premier lavage, utilisez dynamag-15 bande magnétique à des billes séparées, de décantation, et remettre en suspension dans 1 ml de tampon de lavage. Transfert de volume à 1,5 ml tube Eppendorf. Incuber à 37 ° C avec agitation pendant 5 min. </li><li> Sur les lavages suivants, tourner en bas de chaque tube sur un minicentrifuge, Mis en échantillon sur dynamag-2 bande magnétique pendant 1 min. Décanter l&#39;échantillon, essuyer les gouttes avec un Kimwipe, remettre en suspension dans une solution de lavage ml. Incuber à 37 ° C avec agitation pendant 5 min. Répétez l&#39;opération pour cinq lavages au total. </li><li> Au dernier lavage, remettre en suspension les perles bien. Prélever 100 ul et mis de côté pour l&#39;isolement d&#39;ARN. Réserve 900 pi de la fraction d&#39;ADN. Placer tous les tubes sur dynamag-2 bande magnétique et éliminer le tampon de lavage. Spin tous les tubes vers le bas brièvement; les placer sur bande magnétique. Retirez le dernier bit du tampon de lavage complètement avec une forte pointe de la pipette 10 ul. </li></ol> 7. RNA Extrait fraction d&#39;ARN à partir d&#39;échantillons CHIRP pour quantifier par qRT-PCR. <ol><li> Prenez 100 ul d&#39;échantillons de perles et un échantillon de 10 ul ENTREE ARN. Ajouter 85 ul d&#39;ARN PK tampon pH 7,0 à l&#39;ARN de départ. Remettre les billes dans 95 ul d&#39;ARN 7,0 PK pH tampon. Ajouter 5 K Proteinease ul et incuber à 50 ° C pendant 45 min avec de bout en bout en secouant. </li><li> En bref spin down tous les tubes etfaire bouillir les échantillons pendant 10 min sur le bloc de chaleur à 95 ° C. </li><li> Réfrigérer les échantillons sur la glace, ajouter 500 ul TRIzol, homogénéiser vigoureusement au vortex pendant 10 secondes. Incuber à température ambiante pendant 10 min. Conserver à -80 ° C ou passez à l&#39;étape 4. </li><li> Ajouter 100 ul de chloroforme à TRIzol échantillons traités. Vortex vigoureusement pendant 10 sec. Centrifuger à 16100RCF sur une centrifugeuse de paillasse pendant 15 min à 4 ° C. </li><li> Retirer ~ 400 pi de surnageant aqueux, organique et en évitant l&#39;interface. </li><li> Ajouter 600 ul (1,5 volume) d&#39;éthanol à 100% et bien mélanger. Spin échantillon à travers MIRNeasy colonnes mini. Laver 1x avec RTT (MIRNeasy mini kit), 2x avec RPE selon le protocole du fabricant. Éluer avec 30 uL sans nucléase H 2 O (NFH 2 O). </li><li> Traiter l&#39;éluat ARN avec l&#39;ADN-libre par le protocole du fabricant. Après la réaction est terminée, chauffer l&#39;échantillon pendant 15 minutes à 65 ° C pour inactiver complètement toute restante DNase. </li><li> Utilisez 1 ARN ul par puits pour isoler qRT-PCR pour confirmer lncRNAextraction. GAPDH est souvent utilisé comme contrôle négatif. </li></ol> 8. Isolement d&#39;ADN Extrait fraction d&#39;ADN à partir d&#39;échantillons CHIRP à identifier par séquençage ou quantifier par qPCR. <ol><li> Préparer un tampon d&#39;élution d&#39;ADN (voir la liste des tampons), 150 ul par échantillon, y compris l&#39;entrée d&#39;ADN. </li><li> Ajouter 1 0μL RNase A (10 mg / ml) et 10 ul RNase H (10 U / pl) par ml de tampon d&#39;élution d&#39;ADN, et le vortex pour mélanger. </li><li> Remettre en suspension chaque échantillon de billes dans 150 pi de tampon d&#39;élution d&#39;ADN avec RNases. (INPUT ADN Resuspendre dans 140 uL) Incuber à 37 ° C pendant 30 min avec agitation. </li><li> Perles séparées et le surnageant sur dynamag-2 bande magnétique. Éliminer le surnageant et ajouter à tubes étiquetés. </li><li> Préparer une seconde partie aliquote de tampon d&#39;élution d&#39;ADN avec 10 uL Une RNase (10 mg / ml) et RNaseH (10 U / uL) exactement comme fait à la section 8.2). Ajouter 150 ul de chaque échantillon (y compris l&#39;entrée d&#39;ADN), incuber, et retirer le surnageant. Collectionnez-les tous surnageant (should être ~ 300 pi). </li><li> Ajouter 15 uL PK à chaque échantillon. Incuber à 50 ° C pendant 45 min avec agitation. </li><li> Pré-spin down jaune tubes de gel à verrouillage de phase (5PRIME). Transfert des échantillons d&#39;ADN dans les tubes de gel à verrouillage de phase, et ajouter 300 ul PhOH: chloroforme: isoamyle par échantillon. Agiter vigoureusement pendant 10 min, et centrifuger dans une centrifugeuse de paillasse à 16100RCF pendant 5 min à 4 ° C. Prenez aqueuse à partir du haut (~ 300 pi). Ajouter 3 GlycoBlue ul, 30 ul de NaOAc, et 900 ul EtOH 100%. Mélangez bien et conserver à -20 ° C pendant la nuit. </li><li> Spin échantillons à 16100RCF pendant 30 min à 4 ° C. </li><li> Décanter le surnageant avec précaution. Ajouter 1 ml EtOH 70% et le vortex pour mélanger. Centrifuger à 16100RCF pendant 5 min. Enlever le surnageant à la pipette. Sécher à l&#39;air pendant 1min. Remettre en suspension dans 30 pl EB. </li><li> Des échantillons d&#39;ADN sont prêtes pour l&#39;analyse par qPCR ou de la préparation des bibliothèques de séquençage à haut débit par le protocole d&#39;Illumina. </li></ol> 10. Les résultats représentatifs Figure 1 </strong&gt; représente le flux de travail gazouiller. Une expérience réussie CHIRP enrichit généralement ARN cible de façon significative par rapport aux non-spécifiques des ARN. La figure 2 montre l&#39;enrichissement de la télomérase humaine ARN (TERC) à partir de cellules HeLa sur GAPDH, un ARN cellulaire abondant qui sert de contrôle négatif. La majorité des ARN TERC (~ 88%) présents dans la cellule ont été tiré vers le bas en effectuant CHIRP, alors que seulement 0,46% de la GAPDH ARN a été récupéré, ce qui démontre un facteur d&#39;enrichissement de ~ 200 fois. Sondes non spécifiques tels que des sondes ciblant l&#39;ARN LacZ, qui n&#39;est pas exprimé dans les cellules de mammifères (Figure 2), peut être utilisé comme d&#39;autres témoins négatifs. Des régions d&#39;ADN attendues pour lier le lncRNA cible sont généralement enrichies au cours régions négatifs lorsqu&#39;elle est mesurée par qPCR. La figure 3 montre la validation qPCR de quatre Hotair assortis sites dans des fibroblastes primaires de prépuce humain que nous avons déterminé en effectuant CHIRP-seq dans la même lignée cellulaire, tandis que TERC et GAPDH l&#39;ADN des sites soirve que les régions de contrôle négatif. Les deux «même» et «bizarre» la sonde fixe donné l&#39;enrichissement comparable attendus Hotair assortis sites sur les régions négatives, une caractéristique des véritables lncRNA sites de liaison. Séquençage à haut débit de l&#39;ADN enrichi CHIRP donne une carte mondiale des sites de liaison lncRNA. La drosophile lncRNA roX2 est connue pour interagir avec le chromosome X d&#39;une manière qui est nécessaire pour la compensation de dosage. La figure 4 montre le profil de liaison roX2 sur une section du chromosome X. Les deux &quot;même&quot; et &quot;impairs&quot; échantillons ont été séquencés et leurs bruits uniques ont été éliminés pour produire une piste de signaux qui se chevauchent. Chaque «pic» indique ici un site fort de roX2 contraignant. La piste complète et la liste des roX2 gènes cibles ont été décrits dans Chu et al. 2011 17. <img alt="Figure 1." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig1.jpg" /> Diagramme Figure 1. De la procédure CHIRPcédure. Chromatine est réticulée à lncRNA: adduits protéiques in vivo biotinylés sondes carrelage sont hybridées à cibler lncRNA et complexes chromatiniens sont purifiés en utilisant des billes de streptavidine magnétiques, suivie par des lavages strictes.. Nous éluer lncRNA ADN lié ou des protéines avec un cocktail de la RNase A et H. Une séquence lncRNA putatif de liaison est schématisée en orange. Précédemment publié dans Chu et al. 2011 17. <img alt="Figure 2." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig2.jpg" /> Figure 2. Enrichit CHIRP pour l&#39;homme TERC ARN. TERC-asDNA sondes de récupérer environ 88% de l&#39;ARN cellulaire TERC et indétectable GAPDH. LacZ-asDNA sondes sont utilisés comme témoins négatifs et de récupérer ni ARN. Moyenne + sd sont présentés. Précédemment publié dans Chu et al. 2011 17. <img alt="Figure 3." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig3.jpg" /> Figure 3. Hotair chirp-qPCR humaine primaire pourfibroblastes Eskin. NFKBIA, HOXD3-4, SERINC5 et ABCA2 sont les régions qui interagissent avec Hotair. TERC et GAPDH ont servi de témoins négatifs. Moyenne + sd sont présentés. Précédemment publié dans Chu et al. 2011 17. <img alt="Figure 4." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig4.jpg" /> Figure 4. CHIRP-seq de données de roX2 ARN dans les cellules de drosophile SL2. &quot;Même&quot; et &quot;bizarre&quot; ont été séquencés séparément; leurs données fusionnent pour ne tenir compte que des pics communs à la fois. La piste fusionnée est montré. Précédemment publié dans Chu et al. 2011 17.

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<li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).</li>
</ol>

C. Chu et HY Chang sont nommés comme inventeurs sur une demande de brevet sur la base de cette méthode.

Ici, nous avons décrit CHIRP-seq, une méthode de cartographie des sites de liaison in vivo lncRNA l&#39;échelle du génome. Les paramètres clés de la réussite sont les piscines fendues de carrelage sondes oligonucléotidiques et de réticulation au glutaraldéhyde. La conception de sondes affinité est simple compte tenu de la séquence d&#39;ARN et ne nécessite aucune connaissance préalable de la structure de l&#39;ARN ou des domaines fonctionnels. Notre succès avec roX2, TERC, et Hotair - trois ARN assez différentes dans les deux espèces - suggère que CHIRP-seq est probable généralisables à de nombreux lncRNAs. Comme avec toutes les expériences, les contrôles de soins et de bonne sont tenus d&#39;interpréter les résultats. LncRNA différents peuvent nécessiter des conditions de titrage, et les changements judicieux de conditions, telles que la sélection de sondes d&#39;affinité différentes ou des agents de réticulation, peut mettre en évidence différents aspects de l&#39;ARN-chromatine interactions. Comme ChIP-seq, tous les événements de liaison ne sont pas nécessairement fonctionnelle, et des études supplémentaires sont nécessaires pour déterminer les conséquences biologiques de l&#39;ARN occupancy sur la chromatine. Néanmoins, nous prévoyons de nombreuses applications intéressantes de cette technologie pour les chercheurs d&#39;autres chromatine associés lncRNAs, qui sont actuellement au nombre des milliers 8,9. Tout comme ChIP-seq a ouvert la porte à l&#39;échelle du génome des explorations de interactions ADN-protéines, chirp-études suivants de la &quot;interactome ARN&quot; peut révéler beaucoup de nouvelles avenues de la biologie.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Liste des tampons :</td></tr><tr><td colspan="4">Dissoudre un comprimé d'inhibiteur de protéase complet dans 1 ml d'eau pour obtenir une solution mère à 50x. Préparer du PMSF à 100 mM dans l'isopropanol (solution mère à 100x). Utiliser Superase-in à une dilution de 200x. Conserver le tout à -20 °C. &amp;deg;C.</td></tr><tr><td colspan="4">Tampon de lyse :</td></tr><tr><td colspan="4">50 mM Tris-Cl pH 7,0&lt;br/&gt;10 mM EDTA&lt;br/&gt;1 % SDS&lt;br/&gt;Ajouter toujours du PMSF, du P.I. et du Superase-in frais avant utilisation, sauf lors du lavage des billes</td></tr><tr><td colspan="4">Tampon protéinase K (pour ADN)</td></tr><tr><td colspan="4">100 mM NaCl&lt;br/&gt;10 mM TrisCl pH 8,0 (pour l'ARN, utiliser pH 7,0)&lt;br/&gt;1 mM EDTA&lt;br/&gt;0,5 % de SDS&lt;br/&gt;Ajouter 5 % en volume de protéinase K (Ambion AM2546, 20 mg/ml), fraîchement préparée avant utilisation</td></tr><tr><td colspan="4">Tampon d'hybridation</td></tr><tr><td colspan="4">750 mM NaCl&lt;br/&gt;1 % SDS&lt;br/&gt;50 mM Tris-Cl pH 7,0&lt;br/&gt;1 mM EDTA&lt;br/&gt;15 % de formamide (conserver à l'abri de la lumière à 4 &amp;deg;C)&lt;br/&gt;Ajouter toujours du PMSF, du P.I. et du Superase-in frais avant utilisation</td></tr><tr><td colspan="4">Tampon de lavage</td></tr><tr><td colspan="4">2x chlorure de sodium et citrate de sodium (SSC) (dilué à partir du stock 20x SSC d'Invitrogen)&lt;br/&gt;0,5 % SDS&lt;br/&gt;Ajouter toujours du PMSF frais avant utilisation</td></tr><tr><td colspan="4">Tampon d'élution de l'ADN</td></tr><tr><td colspan="4">50 mM NaHCO₃&lt;br/&gt;1 % SDS</td></tr><tr><td colspan="4">Tableau des réactifs et équipements spécifiques :</td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde (qualité EM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882-10x10 ml</td><td></td></tr><tr><td>Mixeur de culots motorisé</td><td>VWR international</td><td>V8185-904</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de protéase</td><td>Roche Group</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>Superase-in</td><td>Ambion</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ambion.com/catalog/CatNum.php?AM2696&quot;&gt;AM2696&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200</td><td></td></tr><tr><td>Tubes Falcon (pour la sonication)</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>kit de purification de PCR</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Billes magnétiques C-1</td><td>Invitrogen</td><td>65002</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-25G</td><td></td></tr><tr><td>aimant DynaMag-15</td><td>Invitrogen</td><td>123-01D</td><td></td></tr><tr><td>aimant DynaMag-2</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr><tr><td>MIRNeasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Rnase H</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>R0601K</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4875-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Gel de blocage de phase lourd</td><td>5 PRIME</td><td>2302810</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Phénol : chloroforme : isoamyle</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Ricca</td><td>RSOC0020-1C</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>JT Baker</td><td>4057-06</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Invitrogen</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Tampon d'élution (EB)</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Invitrogen</td><td>15557-036</td><td></td></tr><tr><td>10 % SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15553-027</td><td></td></tr><tr><td>ADN-&lt;em&gt;gratuit&lt;/em&gt;</td><td>Ambion</td><td>AM1906</td><td></td></tr><tr><td>Kit de tampon</td><td>Ambion</td><td>AM9010</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Invitrogen</td><td>15515-026</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement de la chromatine par purification d&#39;arn (chirp)

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

ARN non codant longues sont des régulateurs clés de états de la chromatine pour des processus biologiques importants tels que la compensation de dosage, d&#39;impression, et l&#39;expression des gènes de développement 1,2,3,4,5,6,7. La découverte récente de milliers de lncRNAs en association avec des complexes spécifiques modification de la chromatine, comme complexe Polycomb répressive 2 (PRC2) qui assure la médiation histone H3 lysine 27 triméthylation (H3K27me3), suggère grands rôles pour de nombreuses lncRNAs dans la gestion des états de chromatine dans un gène spécifique la mode 8,9. Alors que certains sont lncRNAs pensé à travailler en cis sur les gènes voisins, d&#39;autres travaillent dans lncRNAs trans pour réguler les gènes situés loin. Par exemple, chez la drosophile lncRNAs roX1 et roX2 régions lient de nombreux sur le chromosome X des cellules mâles, et sont essentiels pour 10,11 compensation de dosage. Toutefois, les emplacements exacts de leurs sites de liaison ne sont pas connus à haute résolution. De même, l&#39;homme lncRNA Hotair peut affecter PRC2 d&#39;occupation sur les hes centaines de gènes du génome entier 3,12,13, mais comment la spécificité est atteint n&#39;est pas claire. LncRNAs peut également servir comme des échafaudages modulaires pour recruter l&#39;assemblage des complexes protéiques multiples. Le classique agissant en trans ARN échafaud est le TERC ARN qui sert de modèle et d&#39;échafaudage pour la télomérase complexe 14; Hotair peut aussi servir comme un échafaudage pour PRC2 et une déméthylase H3K4 complexe 13. Des études antérieures de cartographie d&#39;occupation ARN à la chromatine ont permis de mieux comprendre substantielles 15,16, mais seulement à un seul locus à la fois. Les sites d&#39;occupation de la plupart des lncRNAs ne sont pas connus, et les rôles de lncRNAs en matière de réglementation chromatine ont été la plupart du temps induite par les effets indirects de la perturbation lncRNA. Tout comme immunoprécipitation de la chromatine suivie par microarray ou séquençage en profondeur (ChIP-chip ou ChIP-seq, respectivement) a grandement amélioré notre compréhension des interactions protéine-ADN sur une échelle génomique, ici, nous illustrer un recenTLY publié stratégie pour cartographier l&#39;occupation à long génome à ARN à l&#39;échelle à haute résolution 17. Cette méthode, d&#39;isolement de la chromatine par purification d&#39;ARN (CHIRP) (Figure 1), est basée sur la capture d&#39;affinité de la cible lncRNA: complexe de la chromatine par carrelage antisens-oligos, qui génère alors une carte de la génomique des sites de liaison à une résolution de plusieurs centaines de bases avec de sensibilité et d&#39;arrière-plan faible. CHIRP est applicable à de nombreux lncRNAs parce que la conception de sondes affinité est simple compte tenu de la séquence d&#39;ARN et ne nécessite aucune connaissance de la structure de l&#39;ARN ou des domaines fonctionnels.

CHIRP est une nouvelle technique et rapide à la carte génomique des sites de liaison de l&#39;ARN non codantes de longues (lncRNAs). La méthode tire parti de la spécificité des oligonucléotides carrelage anti-sens pour permettre le dénombrement des sites génomiques lncRNA assortis.

Isolement de la chromatine par purification d&#39;ARN (CHIRP)

Les ARN non codants longs sont des régulateurs clés des états de la chromatine pour des processus biologiques importants tels que la compensation de dose, l'empreinte génomique et le développement...

L'objectif général de l'expérience suivante est de déterminer les régions d'ADN associées à un ARN non codant spécifique à l'aide de QPCR ou de séquençage à haut débit. Cela est réalisé en réticulant les cellules afin de piéger les interactions ADN-ARN natives in vivo. Dans une deuxième étape, les cellules sont lysées puis soumises à de la sonication pour solubiliser le lysat cellulaire et fragmenter la chromatine en petits morceaux.Ensuite, des oligonucléotides antisens biotinylés sont ajoutés au lysat cellulaire afin d'enrichir spécifiquement les complexes R-N-A-D-N-A d'intérêt, permettant d'obtenir des résultats qui précisent l'identité des sites génomiques liés aux ARN non codants, selon des analyses par QPCR ou par séquençage à haut débit. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l'hybridation in situ R-N-A-D-N-A (R-N-A-D-N-A FISH) est que chirp permet d'obtenir des cartes génomiques complètes des sites de fixation des ARN non codants avec une résolution proche du niveau de la paire de bases. Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine des ARN non codants, telles que la manière dont les roX, ARN et les mouches mâles assurent la compensation de dose.Les implications de cette technique vont jusqu'aux thérapies des maladies liées aux ARN non codants, car elle permet de mieux comprendre comment les ARN non codants régulent les états de la chromatine et l'expression des gènes. Pour cette expérience d'isolement de chromatine par purification d'ARN, ou ChIRP, 40 millions de cellules seront récoltées après centrifugation, le PBS sera décanté et le liquide résiduel sera éliminé en aspirant soigneusement selon un angle, puis le culot cellulaire sera décollé en tapotant le fond du tube Falcon. Ajouter du glutaraldéhyde 1 % fraîchement préparé, en commençant par un petit volume, resuspendre le culot cellulaire, compléter jusqu'au volume final, puis retourner le tube pour mélanger et laisser réticuler pendant 10 minutes à température ambiante sur un agitateur horizontal ou rotatif. Arrêter la réaction de réticulation en ajoutant un dixième du volume de glycine 1,25 M, puis laisser sur l'agitateur à température ambiante pendant cinq minutes ; les cellules prendront alors une couleur orange vif.Ensuite, centrifuger à 2000 RCF pendant cinq minutes, décantez et aspirez le surnageant, puis lavez le culot avec 20 millilitres de PBS glacé, centrifugez à nouveau, aspirez le surnageant et remettez en suspension le culot réticulé dans du PBS glacé. Transférez chaque millilitre de cellules dans un tube Eppendorf et centrifugez à 2000 RCF pendant trois minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, utilisez une pipette pour retirer soigneusement autant de PBS que possible.Flash, congeler rapidement toutes les pastilles cellulaires dans de l'azote liquide et conserver indéfiniment à moins 80 degrés Celsius. Pour préparer le lysat cellulaire destiné à la technique chirp, décongeler les pastilles cellulaires congelées réticulées à température ambiante. Secouer énergiquement pour détacher et mélanger la pastille cellulaire.Faire centrifuger les culots et utiliser une pointe de pipette de 10 microlitres pointue pour éliminer tout reste de PBS sur une balance électronique précise au milligramme près. Peser la masse d'un tube Eppendorf vide. Peser chaque culot et noter son poids.Ajouter un volume égal à 10 fois celui du tampon de lyse, supplémenté avec l'inhibiteur de protéase fraîchement ajouté PMSF et du super ace, dans chaque tube et resuspendre le culot. Le lysat cellulaire doit être agité immédiatement après sa préparation. Transférer au maximum 1,5 millilitre de lysat dans chaque tube conique de 15 millilitres et insérer les sondes de sonication en les vissant fermement.Placez ensuite les tubes dans un bio-rupteur et soniquez à quatre degrés Celsius au réglage maximal avec des impulsions de 30 secondes allumées et 45 secondes éteintes. Vérifiez le lysat toutes les 30 minutes. Poursuivez la sonication jusqu'à ce que le lysat cellulaire ne soit plus trouble.Cela peut prendre de 30 minutes à quatre heures selon le nombre de tubes, le volume d'échantillon, la température du bain et la durée de la sonication. Lorsque le lysat devient limpide, transférez cinq microlitres dans un nouveau tube einor. Ajoutez le tampon DNA protéase K et la protéase K, vortexez pour homogénéiser, puis centrifugez brièvement. Incubez pendant 45 minutes à 50 degrés Celsius après avoir extrait l'ADN à l'aide d'un kit de purification PCR.Vérifiez la taille de l'ADN sur un gel d'agarose à 1 %. La majorité du smearing d'ADN doit se situer entre 100 et 500 paires de bases, ce qui indique une sonication complète. Centrifugez des aliquots d'un millilitre des échantillons soniqués à 16 100 RCF pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, transférez le surnageant dans de nouveaux tubes Eppendorf et congélez rapidement à l'azote liquide pour commencer la procédure de décongélation CHIRP. Faites décongeler les tubes de chromatine à température ambiante pour un échantillon CHIRP typique.À l'aide d'un millilitre de lyzat, prélevez 10 microlitres pour l'entrée en ARN et 10 microlitres pour l'entrée en ADN, puis placez-les dans des tubes einor. Conservez-les sur glace jusqu'à nouvel ordre. Transférez un millilitre de chaque échantillon de chromatine dans un tube falcon de 15 millilitres.Ajoutez deux millilitres de tampon d'hybridation dans chaque tube. Ensuite, décongelez les sondes à température ambiante. Ces oligonucléotides biotinylés en mosaïque sont étiquetés selon leur position le long de l'ARN et répartis en deux pools.Le pool pair contient toutes les sondes portant un numéro pair. Et le pool impair contient les sondes portant un numéro impair. Toutes les expériences sont réalisées en utilisant les deux pools, qui servent de contrôles internes l'un par rapport à l'autre.L'un des aspects les plus difficiles du protocole véritable est que toutes les étapes d'hybridation et de lavage doivent être effectuées à 37 degrés. Pour garantir une température expérimentale constante, réalisez toutes les étapes dans ou près d'un four d'hybridation. Ajoutez le volume approprié de sondes à des tubes spécifiques. Mélangez soigneusement et incubez à 37 degrés pendant quatre heures avec agitation ; commencez l'agitation 20 minutes avant la fin de l'hybridation.Préparez les billes magnétiques C une. Utilisez 100 microlitres par 100 pico-moles de sondes. Lavez avec un millilitre de tampon de lyse non supplémenté trois fois en utilisant l'aimant Dyna mag deux bandes pour séparer les billes du tampon.Après le dernier lavage, resuspendre les billes dans le volume initial de tampon de lyse et compléter avec du PMSF frais et un inhibiteur de protéase. Une fois la réaction d'hybridation de quatre heures terminée, ajouter 100 microlitres de billes à chaque tube et mélanger. Incuber correctement à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes avec agitation, puis laver les billes avec un millilitre de tampon de lavage préchauffé à 37 degrés Celsius lors du premier lavage.Utilisez une bande magnétique Dyna Mag 15 pour séparer les billes, décantez et resuspendez dans un millilitre de tampon de lavage, puis transférez dans un tube EOR de 1,5 millilitre. Incubez à 37 degrés Celsius sous agitation pendant cinq minutes lors des lavages suivants, centrifugez chaque tube dans une mini-centrifugeuse et placez l'échantillon sur une bande magnétique Dyna Mag 2 pendant une minute avant de décantez l'échantillon. Essuyez toute goutte avec un essuie-tout Kim et resuspendez dans un millilitre.Laver avec le tampon, incuber à 37 degrés Celsius sous agitation pendant cinq minutes. Répéter jusqu'à un total de cinq lavages ; au dernier lavage, resuspendre. Bien resuspendre les billes, prélever 100 microlitres et les mettre de côté pour l'isolement de l'ARN, puis réserver 900 microlitres pour la fraction d'ADN.Placer tous les tubes sur la bande magnétique pour tubes Dyna Mag et éliminer le tampon de lavage. Après une brève centrifugation, replacer le tube sur la bande magnétique à l’aide d’une micropipette de 10 microlitres à embout fin. Éliminer complètement le tampon de lavage résiduel de chaque tube.Les fractions d'ARN et d'ADN sont ensuite isolées à partir des échantillons ChIRP pour la quantification et le séquençage. Cette figure montre l'enrichissement de la télomérase humaine, de l'ARN ou de Turk provenant de cellules HELOC par rapport à GA dh. Un ARN cellulaire abondant servant de contrôle négatif.La majorité de l'ARN Turk présent dans la cellule, environ 88 %, a été récupérée par une technique de chirp, tandis que seulement 0,46 % de l'ARN GA DH a été obtenu, démontrant un facteur d'enrichissement d'environ 200 fois. Des sondes non spécifiques, telles que des sondes ciblant l'ARN LAC Z, qui n'est généralement pas exprimé dans les cellules de mammifères, peuvent être utilisées comme contrôles négatifs supplémentaires. Régions d'ADN censées se lier à l'objectif. Les ARN longs non codants sont généralement enrichis par rapport aux régions négatives lorsqu'ils sont mesurés par QPCR.Cette figure montre la validation par PCR quantitative de quatre sites liés à Hotair dans des fibroblastes primaires de prépuce humain, déterminée par l'exécution de la chirp SSE dans la même lignée cellulaire, tandis que les sites d'ADN Turk et GA DH servent de régions de contrôle négatif. Les deux jeux de sondes, pairs et impairs, ont produit un enrichissement comparable des sites liés à Hotair attendus par rapport aux régions négatives. Un critère caractéristique des véritables sites de fixation d'ARN non codants longs.Une carte globale des sites de fixation des ARN non codants longs peut être obtenue par séquençage à haut débit de l'ADN enrichi par CHIRP, comme illustré par ces données provenant de l'ARN non codant long *trla* Rocks two, qui est connu pour interagir avec le chromosome X d'une manière nécessaire à la compensation de dose. Les échantillons pairs et impairs ont été séquencés séparément, et leurs bruits uniques ont été éliminés afin de produire une piste de signaux superposés, chaque pic indiquant un site fort de fixation de Rocks two. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important d'appliquer scrupuleusement une technique exempte d'ARNases.D'autres méthodes, comme le transfert de protéines, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que quelles protéines interagissent avec l'ARN non codant d'intérêt après son développement. CHI a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie de l'ARN pour cartographier l'activité de l'ARN dans des cellules en culture et dans des tissus fixés.

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Analyse de l&#39;interaction avec la chromatine Tag appariés Fin de séquençage (Chia-PET) pour la cartographie des interactions Chromatine et transcription Comprendre le règlement

Nous décrivons une méthode robuste pour immunoprécipitation de la chromatine en utilisant des cellules T primaires. La méthode est fondée sur des approches standard, mais utilise un ensemble spécifique de conditions et de réactifs qui améliorent l'efficacité pour une quantité limitée de cellules. Surtout, une description détaillée de la phase d'analyse des données est présentée.

Immunoprécipitation de la chromatine efficace en utilisant des quantités limitées de biomasse

La combinaison de l'immunoprécipitation de la chromatine et le séquençage ultra-haut débit (chip-seq) permet d'identifier et de cartographier les interactions protéine-ADN dans une lignée de tissu ou de cellule donné. Décrit est de savoir comment générer un modèle de puce de haute qualité pour le séquençage ultérieur, en utilisant l'expérience avec le facteur de transcription TCF7L2 comme un exemple.

Génération de haute qualité Immunoprécipitation de la chromatine Patron de l&#39;ADN pour le séquençage à haut débit (ChIP-seq)

En combinant natif et réticulation immunoprécipitation de la chromatine à haute résolution de spectrométrie de masse, l'approche ChroP permet de disséquer l'architecture protéomique composite de modifications des histones, des variantes et des protéines non-histoniques synergie au domaines de la chromatine fonctionnellement distinctes.

L&#39;approche ChroP Combine puce et la spectrométrie de masse à Disséquer protéomiques paysages Locus spécifiques de la chromatine

L’identification de molécules associées à des régions génomiques spécifiques d’intérêt est nécessaire pour comprendre les mécanismes de régulation des fonctions de ces régions. Ce protocole décrit les procédures d’imunopréciprécipitation de la chromatine médiée par des molécules de liaison à l’ADN (enChIP) pour l’identification de protéines et d’ARN associés à une région génomique spécifique.

Isolement des régions génomiques spécifiques et l&#39;identification des molécules associées par enChIP

Nous décrivons ici une immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) et le protocole de préparation de bibliothèque de ChIP-seq pour générer des profils épigénomique global d’échantillons embryonnaires de poulet de faible abondance.

Chromatine protocole d’immunoprécipitation (puce) pour les échantillons embryonnaires de faible abondance

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Les auteurs décrivent un protocole étape par étape pour la chromatine tandem immunoprécipitation séquençage (tChIP-Seq) qui permet l’analyse de la modification d’histone génome cellule-spécifiques au type.

TChIP-Seq : Type-spécifiques des cellules épigénome profilage

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Extraction de chromatine à partir de tissu hépatique chimérique congelé pour l’analyse de l’immunoprécipitation de la chromatine

Découvrez la méthode ChIRP pour cartographier les sites de liaison des ARN longs non codants sur le génome avec une résolution quasi nucléotidique. Cette technique permet d'identifier les régions génomiques associées aux lncRNAs.

Isolement de la chromatine par purification d'ARN (CHIRP)

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