Выделение и первичной культуре клеток крысы Печеночная

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Первичные гепатоциты стать ценным инструментом для оценки биохимических, молекулярных и метаболических функций в физиологически соответствующие экспериментальные системы. Мы описываем надежный протокол для крыс на месте перфузии печени, которая постоянно создает жизнеспособную гепатоцитов до to1.0 × 10

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. H., Liu, M. Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells. J. Vis. Exp. (64), e3917, doi:10.3791/3917 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Первичная культура гепатоцитов является ценным инструментом, который широко используется в области фундаментальных исследований функции печени, болезни, патофизиологии, фармакологии и других смежных областях. Метод, основанный на двухступенчатую коллагеназы перфузии выделения интактных гепатоцитов был впервые введен Берри и другу в 1969 году 1, и с тех пор претерпел множество изменений. Наиболее часто используемый метод был описан Seglenin 1976 2. По существу, являются гепатоциты отделена от наркоза крысы взрослого без рециркуляции коллагеназы перфузии через систему воротной вены. Изолированных клеток, затем фильтруют через поры 100 мкм сетчатый фильтр нейлон размер, и культивировали на пластинах. После 4-часовой культуры, среда заменена сыворотки, содержащие или бессывороточной среде, например, HepatoZYME-SFM, дополнительное время для культуры. Эти процедуры требуют хирургического и стерильной культуры шагов, которые могут быть лучше продемонстрировали видео, чем текст. Hпрежде чем мы документально подробные инструкции для этих процедур, как видео, так и письменных протоколов, которые позволяют последовательно в поколение жизнеспособных гепатоцитов в больших количествах.

Protocol

1. Подготовка

Все буферы свежеприготовленный с использованием стерильной техники и фильтр стерилизовать помощью Corning 0,22 мкм фильтр.

  1. Подготовить перфузии буфер я, добавив следующие строки в сбалансированном солевом растворе Хенкса (HBSS без Са 2 + и Mg 2 +, см. таблицу 1): Mg 2 + (MgCl 2) до 0,9 мм, ЭДТА до 0,5 мм, а HEPES до 25 мМ.
  2. Подготовить перфузии буфер II, добавив следующее HBSS (с Са 2 + и Mg 2 +, см. таблицу 1): HEPES до 25 мм.
  3. Подготовить перфузии буфер II плюс collagenaseII: Растворите коллагеназы II (1000 ЕД) с 300 мл перфузии буфер II и поддерживать решение теплой водяной бане до перфузии. Этот раствор следует использовать в течение 30 минут, потому что активность коллагеназы II уменьшилось со временем.
  4. Подготовка полного среднего Уильяма: Добавьте следующиек средней E Уильямс: L-глютамин до 2 мм, эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) до 5%, инсулин до 100 нм, дексаметазон до 100 нм, пенициллин по 100 МЕ / мл стрептомицина и до 100 мг / мл.
  5. Эти буферы должны быть прогреты в течение 30 минут на водяной бане при 42 ° C, оптимальная температура, соответствующая температура на выходе канюля 37 ° C.

2. Крысы перфузии печени изоляции

  1. Перфузии Система состоит из насоса, автоклавируемый силиконовые трубки и на водяной бане (см. Рисунок 1). Предварительно установите расход перистальтического насоса перфузии до 10 мл / мин.
  2. Обезболить взрослой крысы (300 г массы тела) с внутрибрюшинно (IP), кетамин (87 мг / кг массы тела), а также ксилазина (13 мг / кг). Глубина анестезии должны быть проверены на ноги шнура. Когда крыса больше не реагирует на болевые раздражители, бритье волос и брюшной подготовительные живот бетадин и этанола. Введите через срединный разрез.
  3. Подвергатьпеченочной воротной вены тщательно перемещение внутренних органов вправо за пределы брюшной полости, и вставить 18 калибра angiocath в печеночной воротной вены (см. Рисунок 1).
  4. Подключите перфузат трубки с иглой и начать вливания в местах с низкой скоростью потока (10 мл / мин) с предварительно нагретым (37 ° C) перфузии буфера я.
  5. Если выполняется должным образом, печень должна немедленно начинают выгораживать. После успешной катетеризации подтвердится, сделать разрез в нижней полой вены (НПВ), чтобы отток (рис. 1). Еще один тест для успешной катетеризации может осуществляться путем применения давления света стерильным тампоном на IVC, все доли печени следует быстро начинают набухать.
  6. Увеличение скорости потока 25 мл / мин. Печень должна стать бледным цветом.
  7. Включите перфузии решение перфузии буфер II плюс коллагеназы II без прерывания потока на 6 дополнительных минут.
  8. <LI> Периодически (5-10 раз в процессе пищеварения) давление с тампоном IVC для 5-секундным интервалом. Печень увеличится, что приведет к повышению печеночных клеток диссоциации, в свою очередь, уменьшает общее время пищеварения, а также увеличение конечного выхода.
  9. После того, как коллагеназа перфузии печени следует начинать искать мягкий. Проанализируйте печени бесплатно, место в предварительно охлажденный стерильный стакан с 20 мл полной среды Уильям, а затем принять его на ткань капот культуре клеток.

3. Гепатоцитов изоляторе

  1. В капоте культуре клеток, с помощью мобильного скребок, чтобы мягко рассеивают клеток в полной средней Уильяма в стерильные чашки Петри.
  2. Фильтр клетки дисперсии через поры 100 мкм сито размером ячейки в 50 мл коническую трубку для удаления соединительных тканей и непереваренных фрагментов ткани.
  3. Приостановить клеток в 40 мл полной среды Уильям и центрифуги в 50 мкг в течение 3 мин при 4 ° C.
  4. Аспирируйте супернатант, имягко повторно приостанавливать клетки в полной среде 40 мл холодной Уильяма мыть клетки. Повторите центрифугирования.
  5. Аспирируйте супернатант и осторожно повторно приостанавливать клеток с 25 полных средних мл Уильяма. Добавить 25 мл 90% раствора в Перколла PBS в трубу и аккуратно перемешать.
  6. Центрифуга 200 мкг в течение 10 мин при 4 ° C. Аспирируйте мертвые клетки сверху градиент, так как жизнеспособные клетки остаются в нижней части градиента Перколла.
  7. Приостановить осадок клеток в 30 мл теплой полной средней Уильяма, а затем повторите центрифугирование и повторно приостанавливать осадок клеток в 20 мл теплой полной средней Уильяма.
  8. Подсчитайте клеток в суспензии клеток помощью гемоцитометра и определения жизнеспособности клеток окрашиванием трипанового синего.

4. Гепатоцитов культуры

  1. Развести клетки с полной средней теплый Уильяма предпочтительные концентрации, например, 2,5 х 10 5 клеток / мл. Пластина клеток в нужном объеме на пластинах культуре клеток, например,. 5 х 10 5 клеток / 2 мл / а, 6 скважин / плита, или 2,5 х 10 5 клеток / 1,5 мл / и 12 скважин / пластины. Un покрытие пластин подходит для культур печеночных клеток.
  2. В типичной подготовительные с> 85% жизнеспособных клеток, плотность клеток должна составить около 60-70% слияния, что позволяет межклеточных контактов, сохраняя при этом достаточно места для гепатоцитов вырастет до их полного размера ячейки и дают окончательное слияние 90-95%.
  3. В целях формирования монослоя даже гепатоцитов, другими словами, чтобы свести к минимуму тенденцию клетки собираться в центральной части и (скорее всего, за счет потока воздуха внутри клетки инкубатор), позволяют пластины остаются внутри капот культуре клеток в течение 30 минут прежде, чем поместить их в инкубатор.
  4. Культура клеток при 37 ° C во влажной атмосфере 95% воздуха и 5% CO 2. После 4-х культуры, клетки могут либо оставаться в той же сыворотки среде, содержащей или заменить среде с сывороткой-еРЗЭ среды, например HepatoZYME-SFM (см. Таблицу 1). Бессывороточной среде способствует поддержанию морфологии клеток, без побочных эффектов от гормонов, когда бессывороточной среде используется.
  5. Позвольте клеток для восстановления и роста по крайней мере, ночью до экспериментов. Мы рекомендуем использовать клетки для тестирования в течение 24 часов, потому что это может помочь сохранить функцию критической ферментов (например, Р450).
  6. Замените рост средней на 2-дневными интервалами, если это необходимо.

5. Представитель Результаты

Условиях, описанных регулярно генерировать клетки урожаи 1,0 х 10 8 клеток на подготовку одного печени крыс. Жизнеспособность гепатоцитов измеряется путем исключения трипановым синим был постоянно в пределах 88 ~ 96%.

Как показано на рисунке 2, гепатоциты совокупности и образуют кластер, после 4 часов посева. Большинство изолированных клеток выравнивать и распространять в типичных рост монослоя. К 24 ч, по краям клетки определяется, поверхности клеток довольно гладко, и липидные капли видны. В камерах 2:59 ядрышки, которые имеют круглую форму, расположен в центре клетки и ядра дисплея соответствует размеру среди клеток (рис. 2).

Рисунок 1
Рисунок 1. Схема печени перфузии. 18 калибра angiocath вставляется в портальную вену печени, то перфузат трубка подключена к игле. После успешной катетеризации подтвердится, сделать разрез в нижней полой вены (НПВ), чтобы истечение.

Рисунок 2
Рисунок 2. Морфология культуре гепатоцитов с течением времени (4 ч до 24 ч), увеличение х 200. После культивировали в течение 24 часов, клетки распространяются в типичных рост монослоя, а переходы между клетками являются линейными.

Название реагента Компания Номер в каталоге
HBSS (без Са 2 + и Mg 2 +) Invitrogen 14174
HBSS (с Са 2 + и Mg 2 +) Invitrogen 14025
Средний Уильямс E Invitrogen 12551-032
Collegenase II Уортингтон LS004176
Сотовые фильтр (100 мкм) BD 352360
HepatoZYME-SFM Invitrogen 17705
Перколла Сигма P4937
Angiocath (18 калибра) BD 381705

Таблица 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Первичная культура гепатоцитов в пробирке модель широко используется для изучения различных аспектов печени физиологии и патологии. Например, основной культуры используется для оценки выражения и функции наркотиков метаболизм ферментов, в том числе цитохрома Р450, метаболизм лекарственных препаратов, лекарственных взаимодействий и механизмов цитотоксичности и генотоксичности 3-7. Протокол описания изоляции и культуре клеток крыс печеночный заимствован из предыдущих докладов Aiken соавт. 8, и другие 2,9,10 с изменениями. Условиях, описанных постоянно генерировать жизнеспособные гепатоциты до 1,0 х 10 8 клеток на препарат с жизнеспособность клеток от 88 ~ 96%. Ниже приводятся другие важные шаги:

  1. Как и любой протокол описания клеточной культуры, наиболее важным аспектом является то, чтобы избежать загрязнения от бактериальных и грибковых патогенов с помощью строгой асептики 11.
  2. Десмосом, также известный как пятно adherens, является клеточная структура специализируется на клетки к клеточной адгезии. Целостность десмосом требуется кальций, и в разбивке по ЭДТА и кальция свободных средств массовой информации. Ферменты коллагеназы могут диссоциировать десмосом, что привело к изоляции клеток печени. Таким образом, перфузии используется Ca 2 + свободная среда, а затем Са 2 + богатой средой, содержащей Са 2 + зависимый коллагеназа, для пищеварения.
  3. Соответствующее обращение коллагеназы имеет решающее значение для подготовки гепатоцитов. Расход Perfussion буфер II плюс collegenase II следует хранить при 25 мл / мин. Общие причины неудачного культуре гепатоцитов относятся: 1) плохой клеточная диссоциация, которая может быть связано с недостаточной перфузии буферов нагревают до 37 ° C и / или медленной скорости перфузии и 2) гибель клеток, которые Коулаг быть связано с чрезмерной пищеварения коллагеназы.
  4. Будьте осторожны при изменении СМИ после первых 4-х культуры, как гепатоциты все еще относительно хрупкие и могут быть легко повреждены или разрушены в результате прямого контакта, пипетки только вниз сторона так и не непосредственно на клетки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить г-на Джоша Basford и доктора Сяо-Мин Ли технической помощи. Эта работа была частично поддержана грантами NIH (DK70992 и DK92779 ОД).

References

  1. Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. J. Cell Biol. 43, 506-520 (1969).
  2. Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
  3. Saito, K., Kobayashi, K., Mizuno, Y., Fukuchi, Y., Furihata, T., Chiba, K., Schmidt, M., Schmitz, H. J., Baumgart, A., Guedon, D. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) agonists induce constitutive androstane receptor (CAR) and cytochrome P450 2B in rat primary hepatocytes. Drug Metab. Pharmacokinet. 25, 108-111 (2010).
  4. Gomez-Lechon, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. Human hepatocytes in primary culture: the choice to investigate drug metabolism in man. Curr. Drug Metab. 5, 443-462 (2004).
  5. Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar. J. 6, 169 (2007).
  6. Bu, S. Y., Mashek, D. G. Hepatic long-chain acyl-CoA synthetase 5 mediates fatty acid channeling between anabolic and catabolic pathways. J. Lipid Res. 51, 3270-3280 (2010).
  7. Aiken, J., Cima, L., Schloo, B., Mooney, D., Johnson, L., Langer, R., Vacanti, J. P. Studies in rat liver perfusion for optimal harvest of hepatocytes. J. Pediatr. Surg. 25, 140-144 (1990).
  8. Jauregui, H. O., McMillan, P. N., Hevey, K., Naik, S. A quantitative analysis of lectin binding to adult rat hepatocyte cell surfaces. In Vitro Cell. 24, 401-412 (1988).
  9. Klaunig, J. E., Goldblatt, P. J., Hinton, D. E., Lipsky, M. M., Trump, B. F. Mouse liver cell culture. II. Primary culture. In Vitro. 17, 926-934 (1981).
  10. Hay, R. J. Operator-induced contamination in cell culture systems. Dev. Biol. Stand. 75, 193-204 (1991).

Comments

23 Comments

  1. Dear Dr.L. Shen,
    I have watched your viedo about " Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells"which was perfectly made. I and our young collegues in the department would like to have full protocol of this work. Is it possible to send it by email. ?
    Thank you for your kind collaboration.
    Regards
    Prof.Dr.Cengiz Baycu
    Head of dept. of Histology&Embryology
    University of Osmangazi Medical Faculty

    Reply
    Posted by: Cengiz B.
    September 13, 2012 - 3:25 AM
  2. Yes, please let me know your e-mail address and then I will send you the protocol. Thanks for your interest.

    Min

    lium@uc.edu

    Reply
    Posted by: Min L.
    November 8, 2012 - 10:44 AM
  3. my email:sxm1987²010@163.com,thank you very much

    Reply
    Posted by: shi x.
    November 9, 2012 - 2:53 AM
  4. Dear Dr.L. Shen,
    I have watched your viedo about " Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells"which was perfectly made. I and our young collegues in the department would like to have full protocol of this work. Is it possible to send it by email. ?
    Thank you for your kind collaboration.
    Regards
    Kita
    Department of ZheJiang University

    Reply
    Posted by: li y.
    November 7, 2012 - 11:18 PM
  5. Yes, please let me know your e-mail address and then I will send you the protocol. Thanks for your interest.

    Min Liu, Ph.D.
    lium@uc.edu

    Reply
    Posted by: Min L.
    November 8, 2012 - 10:45 AM
  6. I am Urmil Dhru from University of Maryland Baltimore requesting you to send the detail and complete protocol on my yahoo account Urmil_Dhru@yahoo.com or my umaryland account udhru@smail.uamryland.com

    Reply
    Posted by: Urmil D.
    June 27, 2014 - 12:24 PM
  7. Dear Dr.L. Shen,
    I have watched your viedo about " Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells"which was perfectly made. I and our young collegues in the department would like to have full protocol of this work. Is it possible to send it by email. ? My email: zhuhaossmu@hotmail.com.
    Thank you for your kind collaboration.
    Regards

    Hao Zhu
    Department of Anatomy
    Shanghai Jiao Tong University

    Reply
    Posted by: Hao Z.
    December 19, 2012 - 8:30 PM
  8. Dear Dr.L.Shen,
    I am very intereted in the video and protocol of "Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells" . Would you please send a full copy of video and protocol to me? My email: ldc1983king@yahoo.com.cn
    Thank you very much.
    Best wishes!

    Li Daochuan
    Department of Public health
    Sun yat-sen University

    Reply
    Posted by: li d.
    December 20, 2012 - 8:56 PM
  9. Dear Dr.L.Shen,
    I am very intereted in the video and protocol of "Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells" . Would you please send a full copy of video and protocol to me? My email: yipeng511@163.com
    Thank you very much.
    Best wishes!

    Yi Peng
    Department of Life Science and Technology
    China Pharmaceutical University

    Reply
    Posted by: Yi P.
    April 7, 2013 - 1:34 AM
  10. Dear Dr.L.Shen,
    I am very intereted in the video and protocol of "Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells" . Would you please send a full copy of video and protocol to me? My email: nagh0²14@naver.com
    Thank you very much.
    Best wishes!

    Gun Hyung Na
    Department of Surgery
    Catholic University of Korea

    Reply
    Posted by: Gun Hyung N.
    April 10, 2013 - 9:41 AM
  11. Dear Dr.L. Shen,
    I have watched your viedo about " Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells"which was perfec.
    I need a copy of it if it is possible please for my student learning about the liver perfusion.
    Dr Hamed zeinvand
    department of toxicology
    tehran university of medical science
    Iran

    Reply
    Posted by: hamed z.
    May 4, 2013 - 3:05 AM
  12. Dear Dr.L.Shen,
    I am very instereted in the video and protocol of "Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells" . Would you please send a full copy of video and protocol to me? My email: dickg@126.com
    Thank you very much.
    Best wishes!

    Reply
    Posted by: yufan g.
    July 2, 2013 - 4:41 PM
  13. Reply
    Posted by: su x.
    August 2, 2013 - 10:51 PM
  14. Dear Dr.L. Shen,
    I have watched your viedo about " Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells"which was perfect.
    Would you please send a full copy of protocol to my email (raghava@suven.com).

    Mr Raghava Choudary Palacharla,
    Drug Metabolism and pharmacokinetics.
    Hyderabad, INDIA - 500055

    Reply
    Posted by: Raghava Choudary P.
    August 5, 2013 - 7:25 AM
  15. Hello Dr L Shen,

    Thank you for your work in producing this protocol. I would very much like to have a full copy of this protocol. Best wishes. sylvie.coulibaly@wmich.edu.

    Reply
    Posted by: Sylvie C.
    August 27, 2013 - 6:30 PM
  16. Dear Hello Dr L Shen,

    I would be glad and appreciate if you kindly email me this protocol video and pdf.

    Best Wishes
    Waqar Saeed

    Waqar.saeed33@gmail.com

    Reply
    Posted by: blue v.
    September 3, 2013 - 10:59 PM
  17. Dear Dr.L.Shen,
    I am very intereted in the video and protocol of "Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells" . Would you please send a full copy of video and protocol to me? My email: atulwavhal@gmail.com
    Thank you very much.
    Best wishes!

    Reply
    Posted by: Atul W.
    November 21, 2013 - 10:56 PM
  18. Dear Dr.L. Shen,
    I have watched your viedo about " Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells"which was perfectly made. I and our young collegues in the department would like to have full protocol of this work. Is it possible to send it by email. ? My email: mbenyamina.2001@yahoo.fr
    Thank you for your kind collaboration.
    Regards.
    Departement of Biotechnology
    University of Oran. Algeria

    Reply
    Posted by: benyamina m.
    March 3, 2014 - 3:22 PM
  19. Dear Dr.L. Shen,
    I have watched your viedo about " Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells"which was perfectly made. I and our young collegues in the department would like to have full protocol of this work. Is it possible to send it by email. ? My email: mbenyamina.2001@yahoo.fr
    Thank you for your kind collaboration.
    Regards.
    Departement of Biotechnology
    University of Oran. Algeria

    Reply
    Posted by: benyamina m.
    March 3, 2014 - 5:29 PM
  20. Dear Dr. Shen,
    Very useful protocol for me, since Im trying to isolate hepatocytes from sheep liver. I have been facing problem since cells are not attaching to collagen coated plates. Kindly guide me on these aspects and also send the complete protocol (both text and video) to my e mail ID: bdpunith@gmail.com.

    Thanks and Regards,
    Punith B D
    NIANP
    Bangalore, India

    Reply
    Posted by: Punith B.
    July 21, 2014 - 8:38 AM
  21. Dear Dr.L.Shen,
    I am very intereted in the video and protocol of "Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells" . Would you please send a full copy of video and protocol to me? My email: delongn@mcmaster.ca
    Thank you for sharing!
    Best wishes!

    McMaster University
    Canada

    Reply
    Posted by: Nicole D.
    September 4, 2014 - 2:19 PM
  22. Dear Dr.L.Shen,
    I am very interested in your video and I want to prepare hepatocyte cells accordingly. I want to ask which brand/catalog of insulin do you use for preparing the medium?

    Reply
    Posted by: Wenjie W.
    October 10, 2014 - 2:15 AM
  23. why the steps showed in the video is different from what written in the protocol? in the video no Percoll used, but in protocol you used Percoll

    Reply
    Posted by: Xia D.
    May 22, 2018 - 6:58 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics