Ihåliga mikronål-baserad sensor för Multiplexade Transdermal Elektrokemisk Sensing

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denna artikel detaljer konstruktionen av en multiplexerad mikronål-baserad sensor. Anordningen håller på att utvecklas för in situ provtagning och elektrokemisk analys av flera analyter i en snabb och selektiv sätt. Vi ser framför oss klinisk medicin och biomedicinsk forskning använder för dessa mikronål-baserade sensorer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Miller, P. R., Skoog, S. A., Edwards, T. L., Wheeler, D. R., Xiao, X., Brozik, S. M., Polsky, R., Narayan, R. J. Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing. J. Vis. Exp. (64), e4067, doi:10.3791/4067 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Utvecklingen av en multiplex minimalinvasiv övervakningssystem för snabb analys av biologiskt relevanta molekyler skulle kunna erbjuda individer som lider av kroniska sjukdomar enkel bedömning av deras omedelbara fysiologiska tillstånd. Dessutom kan det tjäna som ett forskningsverktyg för analys av komplexa, multifaktoriella sjukdomar. För en sådan multianalyte sensor skall kunna förverkligas, måste det vara minimalt invasiva, provtagning av interstitiell vätska ska ske utan smärta eller skada för användaren, och analysen ska vara snabb och selektiv.

Ursprungligen utvecklades för smärtfri drug delivery, har mikronålar använts för att ge vacciner och farmakologiska medel (t.ex. insulin) genom huden. 1-2 Eftersom dessa enheter tillgång till mellanrummet kan mikronålar som är integrerade med mikroelektroder användas som transdermal elektrokemiska sensorer. Selektiv detektering av glukos, glutamat-, laktat-, hydrogen peroxid, och askorbinsyra har demonstrerats med användning integrerade mikronål-elektrodanordningarna med kolfibrer, modifierade pastor kol och platina-belagda mikronålar polymer som fungerar som transducerande element. 3-7,8

Denna mikronål sensorteknik har möjliggjort en ny och sofistikerad analytiskt förhållningssätt för in situ och samtidig detektering av flera analyter. Multiplexing ger möjlighet att övervaka komplexa mikromiljöer, som annars är svåra att karakterisera på ett snabbt och minimalt invasiva sätt. Exempelvis skulle denna teknik kunna användas för samtidig övervakning av extracellulära nivåer av glukos, laktat och pH, 9 vilka är viktiga metaboliska indikatorer på sjukdomstillstånd 7,10-14 (t.ex. cancer proliferation) och ansträngningsutlöst acidos. 15

Protocol

1. Mikronål Fabrication

  1. Med tre-dimensionell Solidworks modellering programvara (Dassault Systemes SA, Velizy, Frankrike), designa en pyramidformad ihåligt mikronål array (figur 1). 3-5
  2. Designa en stödstruktur för mikronålen array med Magics RP 13 mjukvara (Materialise NV, Leuven, Belgien). Stödkonstruktionen tillåter hartset att dränera från anordningen under tillverkning och ger en bas på vilken de mikronålar byggs. Ett exempel stödstruktur visas i figur 1.
  3. Den länkade stöd och mikronål filer array laddas upp till Perfactory RP mjukvara (EnvisionTEC GmbH, Gladbeck, Tyskland), vilken styr tillverkningsprocessen. Inom denna mjukvara, välja antal mikronålen matriser som skall tillverkas och bestämma placeringen av enheter på tillverkning plattan.
  4. Kör kalibrering i ultraviolett läget vid 180 mW för Perfactory snabba prototyping tillverkningssystem och kontrollera avvikelsen i energi ligger inom ± 2 mW.
  5. När tillverkning är klar, ta bort mikronål matriser från bottenplattan och utvecklas i isopropanol i 15 minuter. Torka de celler med komprimerad luft och härda mikronålar vid rumstemperatur under 50 sekunder i Otoflash efterhärdning System (EnvisionTEC GmbH, Gladbeck, Tyskland) för att säkerställa fullständig polymerisation.
  6. Validera mikronål tillverkning via mikroskopi och kontrollera att alla mikronål hål är ihålig och obehindrat. Fullt fabricerade mikronålar visas i figur 2.

2. Tillverkning av Elektrodstrukturer kolpasta Arrays

  1. Använd en 60 W Modell 6,75 CO 2 raster / vektor lasersystem (Universal Laser Systems, Inc., Scottsdale, AZ) att skära hål och exponera de underliggande individuellt adresserbara anslutande koppartrådar i en lägenhet flexibel kabel (21.039-0249), vilket var erhållen från en kommersiell källa (Molex Kontaktdon Corp, Lisle, IL) (Figur 3 (A och B)). Placera de platta flexibla kablar i en jigg för att korrekt anpassa dem på laserablation plattan. Använda en rastrering tillvägagångssätt för att skapa 500 pm diameter kaviteter i den isolerande delen av den flexibla kabeln. Mönster för ablation skapas i CorelDraw (Corel, Ottawa, Ontario) och skickas till lasersystem.
  2. Rengör modifierade platta flexibla kablar med en airbrush som sprutar aceton vid 40 psi. Avsluta rengöra dem genom sköljning med isopropanol och avjoniserat vatten. Kontrollera under ett mikroskop som ingen isolerande filmen är över utsatta kopparremsorna.
  3. Nästa steg är att skapa en hålihålighet för förpackning av kol pastor. Melinex tejp (0,002 "tjocklek belagd på en enda sida med tryckkänsligt akryllim) är ablationsbehandlas med samma mönster som elektrodremsorna och orienterade under den ablationsbehandlade elektrodremsorna och komprimerade på 3000 psi i 2 minuter för att säkerställa en korrekt anslutning. I Detta casig, är kaviteten diametern 750 | im.
  4. Ett ytterligare lager av Melinex tejp (0,004 "tjocklek belagd på två sidor med tryckkänsligt akryllim) därefter ablationsbehandlas i samma mönster som den enda tejp och används efter anpassning för att binda mikronål matriser till elektroden kolpasta matriser .

3. Syntes av funktionella kol Pastor och förpackar Electrode Karies

  1. Glukosen känslig kolpasta baseras off av en tidigare recept och erhålls genom att blanda 10 mg glukosoxidas och 2,2 mg poly (etylenimin) tills en homogen blandning erhålles. Till denna blandning sattes 60 mg rodium på kol pulver 16 ( 5% laddning) tillsätts. 40 mg mineralolja tillsättes och blandas därefter. Pastorna lagras vid 4 ° C fram till användning; är pastorna användas upp till en vecka efter framställningen.
  2. Den pH-känsliga kol pasta framställs genom att blanda 30% (vikt / vikt) mineralolja och 70% (vikt / vikt) grafit powder. Packa klistra in elektroden hålighet som beskrivs i avsnitt 3,4. Göra lösning av 10 mM Fast Blue RR diazoniumsalt (4-bensoylamino-2 ,5-dimethoxybenzenediazonium klorid hemi (zinkklorid) salt) i 0,5 M fosforsyra. 17, Placera en 20 pl droppe av denna lösning över den packade pasta elektrod för 30 minuter spontant kemisorbera Fast Blå PR diazoniumsalt. Skölj med avjoniserat vatten och förvara i buffert eller avjoniserat vatten när den inte används.
  3. Den laktat känsliga kolpasta bygger bort av en tidigare recept och erhålls genom att blanda 2,5 mg rodium på kol pulver och 2,5 mg laktatoxidas, växlar mellan 5 minuter ultraljudsbehandling och 5 minuter med vortex i fem varv 18.
  4. Packning av de modifierade pastor i den förberedda platta flexibla kabeln åstadkoms genom att applicera de respektive pastor över elektrodstrukturerna hålrum. Användning av en tunn bit plast (t.ex. en kant av en plast vågskålen) som en murslev och förpackning than klistra tills en slät yta erhålles. Upprepa med en andra rena väger båten tills överskottet pasta tas bort. Tvätta med avjoniserat vatten. En schematisk visar laser ablation för att skapa hålrum, packning av kol pastor och mikronål integration (beskrivs i avsnitt 2 och 3) presenteras i figur 3.

4. Upptäckt och sensorkalibrering

  1. Laktat detektering åstadkommes genom att mäta chronoamperometric respons hos sensorn vid -0,15 V och registrera den aktuella efter 15 sekunder i 0,1 M fosfatbuffert (pH = 7,5). Fig. 4 (a) innehåller en schematisk vy av den elektrokatalytiska reaktion för detektering av laktat .
  2. Glukos detektering utförs på ett liknande sätt genom att mäta chronoamperometric respons hos sensorn vid -0,05 V och registrera den aktuella efter 15 sekunder i 0,1 M fosfatbuffert (pH 7,0). Innehåller en schematisk vy av den elektrokatalytiska reaktionen för fig. 4 (b) detection av glukos.
  3. pH-värdet övervakas genom att köra cykliska voltametriska avsökningar från -0,7 V till 0,8 V vid 100 mV / s och registrera läget för den oxidativa toppspänning. En schematisk bild av de redoxreaktioner för pH detektering, visas i figur 5.
  4. Kalibreringskurvor för glukos och laktat sensorer kan skapas genom successiva tillsatser av respektive analyt, chronoamperometric mätningar presterar efter varje analyt dessutom som beskrivs i avsnitt 5.1 och 5.2. Alternativt kan fasta potentiella chronoamperometric mätningar göras under omrörning samtidigt som tillräckligt med tid (ca 10-100 sekunder) mellan varje analyt tillägg för aktuell stabilisering.
  5. pH-kalibreringskurvor kan skapas genom att mäta positionen av den oxidativa toppspänning över en serie av kända pH-värden från 5 till 8 i 1.0 steg pH-enheter och spela cykliska voltammogram som beskrivs i avsnitt 5,3.

5. Representant Resultaten

När erhålla chronoamperometric kurvor (t.ex. för glukos detektering eller laktat upptäckt) i vilande lösningar med modifierat kol klistra-fyllda mikronålar, kommer den nuvarande att minska omedelbart efter applicering av respektive upptäckt potentialen. Så småningom avklinga till ett stationärt värde. Ett representativt resultat visas i figur 6; detta resultat erhölls från 2 mM tillsatser av laktat och inspelning vid laktat mikronål. Lösningen måste kort rörs efter varje laktat tillsats. Strömmen efter 15 sekunder stiger vid ökning av koncentrationen av laktat; strömsvaret kan sedan användas för att bestämma koncentrationen av laktat i ett okänt lösning. Alternativt kan kontinuerlig övervakning användas i en omrörd lösning (eller i en flytande lösning), såsom visas för en lösning med en ökande glukoskoncentration (figur 5). Återigen, ökningen i nuvarande vid att öka than koncentration av glukos kan användas för att standardisera glukos svar på en okänd lösning. Tillräcklig tid måste tillåtas efter varje spik så att lösningen att stabiliseras. Cykliska voltammogram vid det pH-känsliga mikronål i 0,1 M fosfatbuffert visas på fyra olika pH-lösningar från 5 till 8 i en pH stegs i figur 6. De oxidativa toppspänning skift med ökande pH, vilket fenomen används som en indikator av pH-värdet.

Figur 1
Figur 1. Bilder på STL-fil av mikronålen arrayen skapas i SolidWorks (A) och Print Screen, som visar stödstrukturen (B).

Figur 2
Figur 2. Svepelektronmikrofotografier av mikronålen matrisen (A) och en enda mikronål inom denna grupp (B).


Figur 3. Schematisk av platt flexibel kabel montering. De berörda stegen ingår att modifiera den platta flexibla kabeln (A), avlägsna den mönstrade cirklarna (B), lägga till en början ablation Melinex skikt, som är fylld med kol pasta (C), samt att lägga det andra ablationsbehandlade Melinex lagret och passa ihop mikronål array (D). Klicka här för att visa en större bild .

Figur 4
Figur 4. Kalibrering av laktat-känslig pasta med 15 sekunders chronoamperometric skanningar -0,15 V i 0,1 M fosfatbuffert (pH = 7,5). Varje ökning i löpande motsvarar en 2 mM tillsats av laktat.

Figur 5
Figur 5.

Figur 6
Figur 6. Cykliskt voltammogram (CV) med pH känsliga kol klistra in i 0,1 M fosfatbuffert över pH 5-8 i 1 pH stegs (teal = pH 8,0, grön = pH 7,0, lila = pH 6,0, röd = pH 5,0). En femte CV användes för analys mot Ag / AgCl-referens-och Pt trådelektroder räknaren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flera aspekter av utformningen av denna mikronålen-sensor ansågs före Komponentframställning. För att kunna använda denna sensor i realtid upptäckt, måste svarstiden för sensorn vara låg, i detta protokoll uppvisade varje testad sensor en svarstid under femton sekunder. Pastor i detta protokoll har också valt för sin selektivitet inom in vivo miljöer som innehåller elektroaktiva biomolekyler som kan störa elektrod svar. Förutom att klistra komposition, de verksamma potentialer valda för att minimera påverkan av interfererande elektroaktiva species. Framgångsrik tillverkning av mikronålen matrisen innefattar selektion av en lämplig mikronål konstruktion och mikronål materialet. Dessa två aspekter kommer att bestämma om mikronålen kan punktera huden, skydda elektroderna mot fysisk skada, och utesluter elektrod och vävnad kontakt. Det bör noteras att en extern Ag / AgCl-och Pt hänvisaratörer och motverka elektroder användes under mätningarna, in vivo användning av denna enhet med human skulle kräva att dessa elektroder införlivas i anordningen.

Varje komponent av mikronålen-baserad sensor har funktioner som skall valideras för att säkerställa korrekt funktion. Kvalitetskontroll under modifieringen av den platta flexibla kabeln (fig. 3 B) innefattar att säkerställa att det isolerande skiktet är helt borttagen från ytan av de tennpläterade koppartrådar efter laserablation (figur 3). Misslyckande med att avlägsna det isolerande skiktet från ytan av koppartråden efter laserablation kan orsaka oregelbunden responser på grund av ofullständig elektrisk kontakt. Lasern-ablationsbehandlade Melinex tejp måste undersökas med ett mikroskop för att se till att diametern på varje öppning är konsekvent när den definierar arbetsområdet av elektroden. Vid tillämpning kol pasta på laser-borttagen Melinex tejp håligheter,pastan måste överensstämma med den exakta håldiametern utan överskott, för att undvika signalvariationer grund av skillnader i ytarea. Under chronoamperometric mätningar med modifierade kolprodukter pastor, måste signalen stabilisera till ett gränsvärde innan strömmen registreras. Dessa resultat kan variera något på grund av blandningseffekter. Mekanisk provning av mikronålen matriser utfördes före sensor införlivas, i en tidigare studie visade vår grupp dessa matriser kunde punktera svin huden, som användes som en analog för human hud 3 mikronål matriser bör inte genomgå deformation eller fraktur under. Hudpenetreringsdata eftersom dessa processer skulle kunna leda till elektroden skadas.

Detta protokoll har detaljerat konstruktionen av en ny transdermal anordning för elektrokemisk övervakning. Vi ser framför oss framtida insatser som rör mikronål sensorer med en ännu större antal individuellt adresserbara mikronålar och en större variation av transducers. Denna enhet har utformats för analys av interstitiell vätska i människor, användning med djur är också möjligt med lämpliga artspecifika ändringar mikronål design. Framtida riktningar med denna teknik innefattar men är inte begränsade till fjärr patientövervakning samt koppling med en läkemedelstillförselanordning för automatiserad avläsning-läkemedelstillförsel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Sandia är multiprogram laboratorium som drivs av Sandia Corporation, en Lockheed Martin Company, för Förenta Anges Department of Energy National Nuclear Security Administration i kontraktet DE-AC04-94AL85000. Författarna erkänner finansiering från Sandia National Laboratories "Laboratory Regi Research & Development (LDRD) program.

References

  1. Henry, S., McAllister, D. V., Allen, M. G., Prausnitz, M. R. Microfabricated microneedles: a novel approach to transdermal drug delivery. J. Pharm. Sci. 87, 922-925 (1998).
  2. Prausnitz, M. R. Microneedles for transdermal drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 56, 581-587 (2004).
  3. Miller, P. R., Gittard, S. D., Edwards, T. L., Lopez, D. M., Xiao, X., Wheeler, D. R., Monteiro-Riviere, N. A., Brozik, S. M., Polsky, R., Narayan, R. J. Integrated carbon fiber electrodes within hollow polymer microneedles for transdermal electrochemical sensing. Biomicrofluidics. 5, 013415-013415 (2011).
  4. Windmiller, J. R., Zhou, N., Chuang, M. C., Valdés-Ramírez, G., Santhosh, P., Miller, P. R., Narayan, R., Wang, J. Microneedle array-based carbon paste amperometric sensors and biosensors. Analyst. 136, 1846-1851 (2011).
  5. Windmiller, J. R., Valdés-Ramírez, G., Zhou, N., Zhou, M., Miller, P. R., Jin, C., Brozik, S. M., Polsky, R., Katz, E., Narayan, R., Wang, J. Bicomponent microneedle array biosensor for minimally-invasive glutamate monitoring. Electroanal. 23, 2302-2309 (2011).
  6. Ricci, F., Moscone, D., Palleschi, G. Ex vivo continuous glucose monitoringwith microdalysis technique: The example of GlucoDay. IEEE Sensors J. 8, 63-70 (2008).
  7. Zimmermann, S., Fienbork, D., Flounders, A. W., Liepmann, D. In-device enzyme immobilization: Wafer-level fabrication of an integrated glucose. Sens. Actuat. B. 99, 163-173 (2004).
  8. Miller, P. R., Skoog, S. A., Edwards, T. L., Lopez, D. M., Wheeler, D. R., Arango, D. C., Xiao, X., Brozik, S. M., Wang, J., Polsky, R., Narayan, R. J. Multiplexed microneedle-based biosensor array for characterization of metabolic acidosis. Biomicrofluidics. 88, 739-742 (2012).
  9. Miller, P. R., Skoog, S. A., Edwards, T. L., Lopez, D. M., Wheeler, D. R., Arango, D. C., Xiao, X., Brozik, S. M., Wang, J., Polsky, R., Narayan, R. J. Multiplexed microneedle-based biosensor array for characterization of metabolic acidosis. Talanta. 88, 739-742 (2012).
  10. Rofstad, E. K. Microenvironment-induced cancer metastasis. Int. J. Radiat. Biol. 76, 589-605 (2000).
  11. Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324, 1029-1033 (2009).
  12. Warburg, O., Wind, F., Negelein, E. The metabolism of tumors in the body. J. Gen. Physiol. 8, 519-530 (1927).
  13. The Tumour Microenvironment: Causes and Consequences of Hypoxia and Acidity. Novartis Foundation Symposium 240. Goode, J. A., Chadwick, D. J. John Wiley & Sons, Ltd. (2008).
  14. Cardone, R. A., Casavola, V., Reshkin, S. J. The role of disturbed pH dynamics and the Na+/H+ exchanger in metastasis. Nature Rev. Cancer. 5, 786-795 (2005).
  15. Robergs, R. A., Ghiasvand, F., Parker, D. Biochemistry of exercise-induced metabolic acidosis. Am. J. Phys. 287, R502-R516 (2004).
  16. Wang, J., Liu, J., Chen, L., Lu, F. Highly selective membrane-free, mediator-free glucose biosensor. Anal. Chem. 66, 3600-3603 (1994).
  17. Makos, M. A., Omiatek, D. M., Ewing, A. G., Heien, M. L. Development and characterization of a voltammetric carbon-fiber microelectrode pH sensor. Langmuir. 26, 10386-10391 (2010).
  18. Wang, J., Chen, Q., Pedrero, M. Highly selective biosensing of lactate at lactate oxidase containing rhodium-dispersed carbon paste electrodes. Anal. Chem. Acta. 304, 41-46 (1995).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics