आंतों में गड़बड़ी की एक मानकीकृत मॉडल में विश्लेषण: आंतों गतिशीलता और कृन्तकों आंत की दीवार में सूजन के कार्यात्मक मूल्यांकन

Medicine

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Summary

पश्चात आन्त्रावरोध (POI) पेट बढ़ रुग्णता और एक लंबे समय तक अस्पताल में रहने के लिए प्रमुख सर्जरी के एक उलझन है. क्योंकि रोगनिरोधी या चिकित्सीय रणनीतियों अनुसंधान तेज कमी कर रहे हैं के लिए आवश्यक है. इसलिए हम एक मानकीकृत और व्यवहार्य माउस मॉडल स्थापित POI के pathophysiology की जांच करने के लिए और संभावित चिकित्सीय विकल्पों का अध्ययन.

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Vilz, T. O., Overhaus, M., Stoffels, B., Websky, M. v., Kalff, J. C., Wehner, S. Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation. J. Vis. Exp. (67), e4086, doi:10.3791/4086 (2012).

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Abstract

जठरांत्र संबंधी मार्ग की सूजन मानव रोगों की एक किस्म के लिए एक आम कारण है. पशु अनुसंधान मॉडल सेलुलर जटिल और आंतों विकृति के आणविक जांच में महत्वपूर्ण हैं. हालांकि ट्युनिका mucosa अक्सर कई भड़काऊ रोगों, हाल ही का प्रदर्शन काम करता है में रुचि का अंग है कि बाह्य पेशीकला (इ) भी एक बेहद असुरक्षित अंग के कि निवासी immunocytes के एक घने नेटवर्क बंदरगाहों है 1,2 इन कार्यों मानकीकृत भीतर प्रदर्शन किया गया आंतों में गड़बड़ी की मॉडल (आईएम) है कि आंत की दीवार की सूजन की ओर जाता है, मुख्य रूप से ME तक ही सीमित है. चिकित्सकीय इस सूजन लंबे समय तक आंतों dysmotility, 3 पश्चात आन्त्रावरोध (POI) जो पेट की सर्जरी के बाद एक लगातार और अपरिहार्य जटिलता है के रूप में जाना जाता है. जाता सूजन 4 IL-6 या आईएल 1β या निरोधात्मक न्यूरोट्रांसमीटर के रूप में proinflammatory मध्यस्थों की मुक्ति के द्वारा होती है nitri तरहग ऑक्साइड (सं). 5 बाद में, immunocytes के भारी संख्या में इ बहना, polymorphonuclear (PMN) neutrophils और monocytes द्वारा प्रभुत्व और अंत में POI बनाए रखने के 2 दिनों के लिए स्थायी, यह आंतों पक्षाघात आकांक्षा का एक बढ़ा जोखिम, बैक्टीरियल स्थानान्तरण करने के लिए सुराग जटिलताओं और संक्रामक पूति और बहु अंग विफलता और एक उच्च आर्थिक बोझ का कारण बनता है 6.

इस पांडुलिपि में हम आईएम के और जठरांत्र (GIT) पारगमन और colonic पारगमन के vivo मूल्यांकन में मानकीकृत मॉडल को प्रदर्शित करता है. इसके अलावा हम मेरे ट्युनिका प्रतिरक्षाविज्ञानी विश्लेषण है, जो इन दोनों अत्यधिक immunoactive आंत्र दीवार डिब्बों में भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के बीच भेद करने के लिए महत्वपूर्ण है द्वारा पीछा mucosa से अलग होने के लिए एक विधि का प्रदर्शन. सभी विश्लेषण आसानी से कर रहे हैं किसी भी अन्य अनुसंधान मॉडल हस्तांतरणीय, गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल समारोह को प्रभावित.

Protocol

1. पशु

25 ग्राम का एक मतलब के वजन के साथ पुरुष C57BL6 जम्मू / चूहों Harlan Winkelmann (Borchen, जर्मनी) से प्राप्त किया गया. सभी प्रयोगों संघीय जानवरों के संरक्षण के संबंध में कानून के अनुसार में प्रदर्शन किया गया. प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल के सिद्धांतों का पालन किया गया. पशु एक प्रकाश 12 / घंटा अंधेरे चक्र पर बनाए रखा गया है और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कृंतक चाउ और नल पानी यथेच्छ के साथ प्रदान की जाती है. पशु अपने प्रयोगों से पहले पशु सुविधा में आने के बाद कम से कम 7 दिनों ध्यान दें कि सभी प्रयोगों को आसानी से चूहों या अन्य प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और बड़े पशु मॉडल में मामूली संशोधनों के साथ रखा जाना चाहिए.

2. ऑपरेटिव प्रक्रिया

  1. संज्ञाहरण प्रेरित है और ऑक्सीजन में isoflurane (Abbott, Wiesbaden, जर्मनी) के साथ बनाए रखा. लापरवाह स्थिति और चिपकने वाली टेप के साथ तय extremities (Leukosilk, Beiersdorf, हैम्बर्ग, जर्मनी) में संज्ञाहरण जगह जानवरों के शुरू होने के बाद. पेट की दीवार की हजामत बनाने का काम और शल्य चिकित्सा कीटाणुशोधन के बाद एक मंझला laparotomy 2 सेंटीमीटर की लंबाई पर किया जाता है. Linea अल्बा के साथ एक चीरा के माध्यम से उदर गुहा में प्रवेश करें. जगह दो बाँझ retractors पेट को खुला रखने के. ध्यान बाईं छोटी आंत eventerate और यह एक गीला कपास धुंध पर जगह.
  2. दो नम और बाँझ कपास applicators (अपंग, Neunkirchen, जर्मनी) के साथ एक साथ जठरनिर्गम से cecum करने applicator रोलिंग द्वारा पूरे छोटी आंत luminal सामग्री खाली. चेतावनी: छोटी आंत की दीवार या आंत वाहिकाओं के घावों के हेमोरेज से बचें. Peritoneal गुफा में ischemia या यांत्रिक बाधा को रोकने के लिए और पेट चीरा का उपयोग कर एक दो निरंतर परत 5/0 polyamid गैर absorbable sutures (Ethicon, Norderstedt, जर्मनी) बंद घुमा के बिना पेट वापस रखो.

3. पश्चात देखभाल

  1. प्रक्रिया के बाद एक हीटिंग दीपक, observi के तहत पशु जगहयह एनजी जब तक यह संज्ञाहरण से बरामद. माउस वापस अपने पिंजरे में डाल दिया है और पानी और भोजन के लिए उपयोग करने की अनुमति है. Peristalsis को प्रभावित करने के लिए नशीले पदार्थों की संपत्ति के कारण, हम पीने के पानी में NSAIDs (उदाहरण metamizol के लिए) के साथ perioperative analgesia प्रदर्शन करते हैं.

4. कार्यात्मक अध्ययन आईएम के बाद 24 घंटा

  1. गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रांजिट (GIT)
    1. ऑक्सीजन आईएम के बाद 22.5 घंटा isoflurane के साथ चूहों थोड़ा बेहोश करना. सावधानी से माउस के सिर hyperextend और कुंद संदंश के साथ जीभ खींच. के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज भरें कम से कम 100 μl fluorescein लेबल dextran (FITC dextran, 70,000 मेगावाट, सिग्मा Aldrich, Taufkirchen, जर्मनी), यह एक धमनी कैथेटर (Vygon, Ecouen, फ्रांस) से कनेक्ट करने और ध्यान से एक के रूप में कैथेटर पेट में गैस्ट्रिक ट्यूब.
    2. संक्षेप में 100 μl FITC dextran इंजेक्षन और कैथेटर बाहर खींच. जानवर जाग चलो और 90 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें. इस समय के दौरान चूहों को भोजन या पानी का उपयोग कर सकते है. </ Li>
    3. पन्द्रह 2 मिलीलीटर कताई ट्यूब तैयार है और उन्हें लगातार लेबल.
    4. चूहों नलिका - पोषण के बाद 90 मिनट euthanize और पूरे पेट से मलाशय जठरांत्र संबंधी मार्ग को हटा दें. आंत एक polystyrene पैड पर प्लेस और खींच से बचने. गुफा: यह पेट धीरे दूर करने के लिए पास के क्षेत्र में तरल FITC dextrane के स्थानांतरण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है. शुरुआत के लिए यह शुरुआत में और प्रत्येक खंड के अंत में क्लिप का उपयोग करने के लिए उपयोगी हो सकता है.
    5. छोटी आंत और बृहदान्त्र की पूरी लंबाई की पूरी लंबाई उपाय. 10 बराबर आकार के खंडों में यह लगाए cannulas साथ polystyrene पैड नीचे से छोटी आंत फूट डालो. 3 खंडों में बृहदान्त्र फूट डालो. आप 15 (# 1 पेट) क्षेत्रों, दस समान रूप से आकार छोटी आंत खंडों (2-11), cecum (# 12) और तीन 3 समान रूप से आकार colonic खंडों (13-15 #) तैयार किया है.
    6. चिह्नित पदों पर आंत आड़ा काट, यह एक संदंश के साथ हड़पने के लिए और उन्हें एक बार पहले से तैयार KHB containi में 1.0 मिलीलीटर KHB साथ फ्लशएनजी 2.0 मिलीलीटर ट्यूब और 20 सेकंड के लिए सख्ती भंवर. पेट और cecum सीधे रखा जाता है और तैयार की नलियों में कटौती. 1.0 मिलीलीटर KHB साथ इन ट्यूबों भरें, जिससे ट्यूबों में कैंची से काटना से luminal सामग्री के निशान rinsing.
    7. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एक तालिका के शीर्ष अपकेंद्रित्र में 12,000 आरसीएफ में जांच अपकेंद्रित्र. Centrifugation के दौरान एक और 15 लगातार गिने 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों तैयार करते हैं.
    8. नई 1.5 मिलीलीटर ट्यूब और 4 में अंधेरे में दुकान ° विश्लेषण जब तक सी (अगले कदम) में स्पष्ट supernatants स्थानांतरण. जांच FITC संकेत के महत्वपूर्ण हानि के बिना 4 पर कई दिनों डिग्री सेल्सियस के लिए भंडारित किया जा सकता है. के लिए लंबे समय तक भंडारण -18 <0.09% नाट्रियम azide या दुकान जोड़ने डिग्री सेल्सियस
    9. पिपेट एक काले रंग की थाली 96 में अच्छी तरह से (Greiner जैव एक, Frickenhausen, जर्मनी) पर supernatants की 100 μl duplets. पिपेट दो 100 रिक्त KHB की μl नमूने हैं.
    10. एक प्रतिदीप्ति पाठक (Safire, Tecan, Crailsheim, जर्मनी) में थाली पढ़ें और fluorescenc मात्रा ठहराना494 (अवशोषण) एनएम / 521 (उत्सर्जन) एनएम तरंगदैर्ध्य ई. नमूनों से रिक्त मान घटाएँ.
    11. की गणना निम्नलिखित सूत्र द्वारा FITC - dextran वितरण के ज्यामितीय केन्द्र (जीसी), जो वास्तव में मार्कर के वितरण के लिए गुरुत्वाकर्षण का केंद्र है: जीसी = Σ (खंड प्रति कुल फ्लोरोसेंट संकेत का% * खंड संख्या) / 100

    नोट: अपने क्षेत्र संख्या के साथ प्रत्येक खंड के प्रतिदीप्ति प्रतिशत गुणा करके आंत के भीतर मार्कर के वितरण की एक भारित मतलब मूल्यांकन किया है. इस बिंदु दोनों वितरण और मार्कर से कूच दूरी से प्रभावित है, लेकिन कोई विशिष्ट अंतर्निहित वितरण ग्रहण 7 की गणना जीसी मूल्य अक्सर एक जठरांत्र संबंधी मार्ग (चित्रा 1 ए) पर FITC dextran के वितरण का प्रदर्शन ग्राफ के साथ संयोजन में प्रस्तुत है.

  2. Colonic ट्रांजिट
    1. चूहे कमजोर isoflur साथ anaesthetized होना चाहिएane ऑक्सीजन में 2%. सावधानी: यह सुनिश्चित करें कि 40 सेकंड के भीतर पशु जाग जाएगा.
    2. ध्यान बृहदान्त्र में गुदा के माध्यम से एक नालव्रण जांच (धातु की छड़, 2 मिमी व्यास) डालने से colonic प्रत्यक्षता की जांच.
    3. नालव्रण जांच आगे बृहदान्त्र में एक 2 मिमी कांच गेंद 3 सेमी धक्का और बाहर जांच तुरंत खींच. एक पारदर्शी पिंजरे में माउस प्लेस और मापने शुरू समय नालव्रण जांच के बाद बृहदान्त्र के बाहर खींच लिया था. माउस को नजर रखें और समय सीधे रोक के बाद गिलास गेंद excreted हो गया.

5. पृथक ME के ​​नमूनों का विश्लेषण Histochemical

  1. Midjejunal खंडों आंत्र से काट रहे हैं और एक पकवान Sylgard भर में ठंड KHB में डूबे.
  2. अन्त्रपेशी 0.2 मिमी कीट सुइयों (ललित विज्ञान उपकरण, हीडलबर्ग, जर्मनी) के साथ पकवान पर टिकी है.
  3. खंड अपने मेसेंतेरिक सीमा के साथ खुला और ~ इसकी लंबाई और चौड़ाई के 120% खिंचाव कट. कीट के साथ निर्धारण को अंतिम रूप देने केअन्त्रपेशी के विपरीत साइट पर पिन. Sylgard पकवान ध्यान से ताजा बर्फ ठंड KHB साथ, कुल्ला जिससे सभी luminal सामग्री निस्तब्धता.
    मुझे अब यंत्रवत् ट्युनिका अन्त्रपेशी से शुरू mucosa से अलग कर सकते हैं. तैयारी के दौरान ताजा ठंडा KHB कई बार की जगह.
  4. सदमे से अलग ट्युनिका mucosa आगे के विश्लेषण के लिए किया जा सकता है तरल नाइट्रोजन में जमे हुए या त्याग.
  5. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 100% इथेनॉल के साथ अलग मुझे पूरी माउंट फिक्स.
    पूरे माउंट तीन ठंडा KHB का उपयोग बार धो लें. नोट: अन्य fixatives (यानी 4% formaldehyde, एसिटिक एसिड, aceton) भी बाद के विश्लेषण के साथ अपनी संगतता परीक्षण के बाद इस्तेमाल किया जा सकता है.
  6. मुझे पूरी mounts आगे Histochemical या immunhistochemical धुंधला के लिए तैयार कर रहे हैं:
  1. ऊतकरसायनविज्ञान: myeloperoxidase धुंधला हो जाना (MPO)
    घुसपैठ की PMNs निम्नलिखित MPO धुंधला हो जाना प्रोटोकॉल द्वारा जांच की जा सकती है.
    1. 10 मिलीग्राम H का समाधानAnker 10 मिलीलीटर KHB में Yates (Polyscience यूरोप, Eppelheim, जर्मनी) अभिकर्मक और 3% एच 2 2 हे के 100 μl जोड़ें. समाधान हौसले से तुरंत पहले का उपयोग करें और पुनः प्रयोग नहीं है तैयार.
    2. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए पूरी mounts सेते हैं.
    3. नमूनों को बड़े पैमाने पर कुल्ला ठंड और 10 मिनट के लिए KHB सेते साथ.
    4. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत 2 घंटे का विश्लेषण स्लाइड्स के लिए सुखाने के बाद जलीय बढ़ते मध्यम में नमूनों (Aquatek, मर्क, Darmstadt, जर्मनी) माउंट.
    5. 5 बेतरतीब ढंग से चुने हुए क्षेत्रों में कोशिकाओं की संख्या की गणना और MPO पॉजिटिव कोशिकाओं / 2 मिमी के रूप में गणना.
  2. Immunohistochemical धुंधला:
    तदनुसार Histochemical MPO धुंधला हो जाना, पूरे mounts के immunohistochemical stainings किया जा सकता है. मुख्यतः, अपने स्थापित सेल संस्कृतियों या ऊतक स्लाइस के immunohistochemical धुंधला हो प्रोटोकॉल को आसानी से एक पूरी माउंट धुंधला अनुकूलित किया जा सकता है. हालांकि, विशिष्ट विरोधी के लिए प्रक्रिया का अनुकूलनशरीर को दृढ़ता से अनुशंसा है.
    1. 5 एक्स 5 मिमी टुकड़ों में नमूनों कट और ~ 150 μl में 2.0 मिलीलीटर दौर नीचे अपकेंद्रित्र ट्यूबों में धुंधला प्रदर्शन 200 μl एंटीबॉडी समाधान.
    2. फिक्सेशन और प्रक्रिया अवरुद्ध (यानी कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पीबीएस में 3% BSA) "sylgard पकवान" में किया जा सकता है.
    3. PBS या अन्य buffers में वॉशिंग चरणों 12 अच्छी तरह प्लेटें में किया जा सकता है.
    4. नमूनों ध्यान स्थानांतरण, धुंधला के ट्यूब और प्लेटें धोने के बीच एक तेज संदंश के साथ.
    5. अंतिम कवर फिसल जाता है के साथ कपड़े धोने की प्रक्रिया विरोधी लुप्त होती बढ़ते मध्यम में माउंट नमूनों के बाद और एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के साथ विश्लेषण.

6. मेरे अंग संस्कृति

  1. पूरे छोटी आंत आईएम के 24 घंटे के बाद resected है और ठंड KHB युक्त 200 यू / एमएल पेनिसिलिन जी और 100 स्ट्रेप्टोमाइसिन छ / मिलीलीटर (KHB + पी / एस) में रखा गया है.
  2. 3 सेमी लंबाई में आंत कट और प्रत्येक खंड के लिए नीचे पिन एक gla युक्त Sylgardएस एस पकवान.
  3. ठीक कैंची साथ अन्त्रपेशी निकालें और एक बुनाई सुई पर आंत पर्ची.
  4. धीरे एक तेज संदंश के साथ ME काटकर अलग कर देना और यह एक नम कपास applicator का उपयोग submucosa से पट्टी. ट्युनिका mucosa बुनाई सुई पर बनी हुई है और आगे की जांच पड़ताल के लिए जमे हुए तस्वीर हो सकता है. इ ठंडा KHB में एकत्र किया जाता है + पी / एस
  5. ME 2 के छोटे टुकड़ों में अलग स्ट्रिप्स कट - 4 मिमी की लंबाई और यह बर्फ के ठंडे KHB में आधे घंटे के लिए पी / एस नमूना सेते हैं और कई बार कुल्ला.
  6. मुझे 50-60 लगभग एक बाँझ 24-अच्छी तरह से थाली में 500 μl Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) युक्त मिलीग्राम (कम से कम से कम आधे से एक छोटी आंत का इ) स्थानांतरण.
  7. 37 पर सेते डिग्री सेल्सियस और 5% अतिरिक्त 24 घंटे के लिए सीओ 2.
  8. एक खुर्दबीन के नीचे बैक्टीरियल या फंगल संक्रमण के लिए सेल संस्कृतियों का निरीक्षण किया.
  9. तैरनेवाला लीजिए, 5 मिनट के लिए नीचे 1000 और तरल नाइट्रोजन में तस्वीर फ्रीज आरसीएफ में स्पिन. इस बीच musc सूखी दाग30 सेकंड और वजन के लिए एक साफ ऊतक पर ले ऊतक.
  10. Supernatants एलिसा या तैरनेवाला में अन्य चयापचयों (यानी नाइट्राट) द्वारा जारी साइटोकिन्स (IL-6) के बाद के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है का पालन करके निर्देश बनाती है.
  11. मेरे ऊतक के वजन के अनुसार मापा सांद्रता सामान्यकरें.

7. प्रतिनिधि परिणाम

  1. कार्यात्मक अध्ययन
    POI की गंभीरता का मूल्यांकन करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण पैरामीटर vivo में GIT की परीक्षा चित्रा 1A अनुपचारित नियंत्रण में जठरांत्र पथ साथ FITC dextran का एक विशिष्ट वितरण को दर्शाता है और सर्जरी के बाद intestinally चूहों 24 घंटा चालाकी. "शाम संचालित" जानवरों cecum में एक गणना ज्यामितीय केंद्र (जीसी) के साथ एक सामान्य GIT से पता चला है जबकि आईएम समीपस्थ सूखेपन में एक git का महत्वपूर्ण देरी (चित्रा 1B) नेतृत्व
    Colonic गतिशीलता गेंद उत्सर्जन समय ओ के माप से अलग किया गया था पर ध्यान केंद्रितपिता 2 मिमी कांच गेंद. शाम संचालित चूहों 48 के एक उत्सर्जन समय दिखाने के लिए - 200 सेकंड जबकि आईएम 470 के बीच एक लंबे समय तक उत्सर्जन समय नेतृत्व - 775 सेकंड (चित्रा 1C).
  2. Morphological अध्ययन
    भड़काऊ वर्णन leukocytes के मुझे कई phenotypes भीतर का विस्तार ऊतकरसायनविज्ञान या immunohistochemistry का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है. चित्र में 2A + बी में एक PMNs की कम उपस्थिति संचालित "नकली" जानवरों (39 ± 7 कोशिकाओं / 2 मिमी) मनाया गया. छोटी आंत के आईएम दिखावा संचालित चूहों के साथ तुलना में एक मजबूत PMN घुसपैठ (660 ± 86 कोशिकाओं / 2 मिमी) नेतृत्व
  3. ME अंग संस्कृति
    कई भड़काऊ कोशिकाओं से मुक्त मध्यस्थों ऊतक lysates में पता लगाने के लिए मुश्किल हैं. अंग संस्कृतियों संस्कृति तैरनेवाला में मुक्त मध्यस्थों का पता लगाने की अनुमति. POI में एक प्रतिनिधि मध्यस्थ नहीं है, जो जठरांत्र में 5 प्रमुख निरोधात्मक neurotransmitter के रूप में है.
    सं ME अंग संस्कृति में नहीं पाया जा सकता हैture unoperated नियंत्रण जानवरों की supernatants (5 ± 6 सुक्ष्ममापी / 24 / घंटा मिलीग्राम ऊतक). दिखावा संचालित चूहों (laparotomy) में बेसल 53 का कोई स्तर ± 36 सुक्ष्ममापी / 24 / घंटा मिलीग्राम ऊतक मनाया गया. मुझे intestinally (सर्जरी के बाद 24 घंटे काटा) चालाकी से चूहों की संस्कृतियों काफी अधिक उत्पादन (2254 ± 853 सुक्ष्ममापी / 24 / घंटा मिलीग्राम ऊतक) 24 घंटा ME अंग संस्कृति के दौरान (3 चित्रा).

चित्रा 1
चित्रा 1 आईएम के GIT (ए, बी +) और colonic पारगमन पर प्रभाव (सी) git गैर absorbable fluorescein लेबल dextran के प्रतिशत के रूप में 15 जठरांत्र खंडों (Sto) पेट, छोटी आंत (एसआई 1-9 में मापा गया था. ), cecum (सीईसी), और पेट के (कंपनी) मौखिक घूस के बाद -90 मिनट. Colonic पारगमन एक 2 मिमी ग्लास मनका के उत्सर्जन तक नालव्रण जांच बाहर खींच से समय के रूप में मापा गया था (ए) fluorescein-आइसोथियोसाइनेट डेक्स गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल वितरण.IM के बाद नकली आपरेशन या ट्रॅन. मार्कर के नकली पशुओं में संचालित अधिकांश cecum या चालाकी से पशुओं में समीपस्थ मध्यांत्रीय स्थान के साथ तुलना में प्रॉक्सिमल बृहदान्त्र में स्थित है. बिंदीदार लाइनों से संकेत मिलता है जीसी की गणना. (बी) जीसी की गणना एक लंबे समय तक आईएम के बाद जठरांत्र पारगमन समय का प्रदर्शन किया. (सी) Colonic पारगमन समय दिखावा संचालित जानवरों के साथ तुलना में IM चूहों में एक महत्वपूर्ण देरी दिखाया. 15 आंतों क्षेत्रों के लिए जीसी मतलब (n = 5) के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं. Colonic पारगमन समय सभी व्यक्तिगत मूल्यों (n 6 =) के साथ मतलब प्रदर्शित किए गए. *** = पी <0.001, छात्र टी परीक्षण.

चित्रा 2
चित्रा 2 छोटी आंत के भीतर इ MPO पॉजिटिव कोशिकाओं की जांच. (ए) मुझे पूरी mounts MPO सकारात्मक PMN 24 laparotomy के बाद एचआर (नकली) या आईएम प्रक्रिया का पता लगाने के लिए लालायित होना Yates अभिकर्मक साथ दाग थे. माउस प्रति 5 बेतरतीब ढंग से चुने हुए क्षेत्रों के भीतर (बी) MPO सकारात्मक सेल की मात्रा. n = 6 एकसमूह के प्रति nimals. *** = पी <0.001, छात्र टी परीक्षण.

चित्रा 3
चित्रा 3 मेरे संस्कृति supernatants में कोई उत्पादन. स्नायु unoperated नियंत्रणों से नमूने, दिखावा संचालित और आईएम चूहों postoperatively 24 घंटे ले लिया गया है और 24 घंटे के लिए सभ्य. अनुपचारित चूहों केवल एक बहुत ही कम नहीं बेसल उत्पादन दिखाया. Laparotomy बाद कोई मुक्ति नियंत्रण समूह और दिखावा संचालित चूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर को मापने के बिना बढ़ जाती है. अनुपचारित या दिखावा संचालित चूहों के साथ तुलना में आईएम कोई उत्पादन के बाद 24 घंटे में नाटकीय रूप से बढ़ जाती है. n = समूह प्रति 5 जानवरों. *** = 0.001 <पी, 1 रास्ता एनोवा.

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Discussion

IM (10 मिनट बनाम धीरे छोटे में cecum छोटी आंत की सामग्री की निकासी के साथ आईएम बनाम दो कपास applicators का उपयोग आंत के निरीक्षण के लिए छोटी आंत eventration) के विभिन्न स्तरों का विश्लेषण एक तुलनात्मक अध्ययन शल्य हेरफेर और POI की सीमा के बीच एक संबंध का पता चला. आईएम ME (PNMs, मैक्रोफेज और मस्तूल कोशिकाओं) लंबे समय तक और गंभीर POI में जिसके परिणामस्वरूप में leukocytes के उच्चतम राशि दिखाया 8. अन्य समूहों के साथ तुलना.

आईएम के मॉडल की स्थापना, मानकीकृत और आंत्र हेरफेर के आपरेशन ताकत महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं. इस प्रक्रिया के दौरान अन्त्रपेशी छू सख्ती हेमोरेज रोकने के से परहेज करना चाहिए. आईएम के दौरान अपर्याप्त ताकत छोटी आंत बढ़ाव के अभाव में परिणाम देगा. आईएम तकनीक और ताकत विभिन्न सर्जनों के बीच बदलता POI घटना के महत्वपूर्ण बदलाव में परिणाम कर सकते हैं. एक ही ऑपरेटर एक प्रयोग में सभी जानवरों में हेरफेर करना चाहिए.

विश्लेषण और vivo में colonic पारगमन GIT महत्वपूर्ण है और सावधानी से किया जाना चाहिए. प्रत्येक जानवर अंधेरे पिंजरों में प्रक्रिया के दौरान और एक मूक कमरे में रखा जाना चाहिए. पशु पर्यावरण (भोजन, पानी, कमरे, प्रकाश अंधेरे चक्र, प्रतिरक्षाविज्ञानी शर्तों) माहिर जानवरों की सुविधा में आने के बाद कम से कम 7 दिनों में रखा जाना चाहिए. दोनों Git, और colonic पारगमन के मापन एक भी आंतों और इलाज और गैर इलाज क्षेत्रों में सूजन पक्षाघात के बीच भेद करने के लिए अनुमति देता है. 9 जाग कृन्तकों में vivo गतिशीलता रिकॉर्डिंग में एक और परिष्कृत विधि था Konigsrainer एट अल द्वारा वर्णित. 10 तनाव गेज का उपयोग transducers पेट सूखेपन, और बृहदान्त्र पर रखा गया है. इस विधि का बड़ा लाभ यह है कि गतिशीलता गड़बड़ी लगातार दिन पर ही जानवर में जठरांत्र संबंधी मार्ग के विभिन्न भागों में स्वतंत्र रूप से और लगातार जांच कर सकते हैं. हालांकि strai के उत्पादनn गेज transducers और प्रत्यारोपण के लिए आवश्यक आपरेशन उन्हें GIT की तुलना में कर रहे हैं विस्तृत.

POI में, आंत्र पक्षाघात का प्रसार जठरांत्र क्षेत्र प्रभाव के रूप में जाना जाता है 11. हमारे समूह की पिछले एक काम वर्तमान तरीकों में से एक प्रयोग से पता चलता है कि intestinally चालाकी से छोटी आंत से immunocytes unmanipulated बृहदान्त्र का प्रसार. 12

शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया किसी भी मौत या प्रमुख जटिलता (रक्तस्राव या पेरिटोनिटिस की तरह) में परिणाम नहीं चाहिए. मुझे पूरी mounts में Git और PMN पैठ के मापन यह दर्शाता है कि आईएम एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और संभव मॉडल कृन्तकों में POI प्रेरित है.

फिक्सेशन और myeloperoxidase धुंधला हो जाना अंग कटाई के तुरंत बाद किया जाना चाहिए. ऊतक से myeloperoxidase की क्षालन में जलीय बफर परिणामों में नमूने के लंबे समय तक भंडारण.

नाइट्रिक ऑक्साइड के मापन मुझे का एक उदाहरण हैअंग संस्कृतियों से diator रिलीज:. रूप में आंतों हेरफेर से पहले दिखाया मैक्रोफेज में मुझे नहीं और आंतों dysmotility का एक अत्यधिक मुक्ति के लिए अग्रणी 5 के INOS के एक upregulation में इ सुसंस्कृत बारे में एक बयान के तैरनेवाला में नहीं की एकाग्रता को मापने परिणामस्वरूप भड़काऊ या चिकित्सा विज्ञान की प्रभावकारिता हद तक संभव है. कई अन्य अणुओं (IL-6, TNF-अल्फा आदि) आसानी से शास्त्रीय एलिसा या Luminex मल्टीप्लेक्स 13 Immunoassay तरह मल्टीप्लेक्स दृष्टिकोण (Invitrogen, Carlsbad, सीए, यूएसए) द्वारा किया जा सकता है सुसंस्कृत ऊतक के supernatants में जांच की.

सारांश में, आईएम एक विश्वसनीय और मूल्यवान मॉडल उत्प्रेरण आंत्र शोथ और बाद में गतिशीलता गड़बड़ी है. मेरे और ट्युनिका mucosa सरल यांत्रिक जुदाई शोधकर्ताओं प्रभाव के बीच दोनों आंत्र दीवार डिब्बों, आंतों के बाद से मेरे लिए एक अत्यधिक प्रतिरक्षाविज्ञानी सक्रिय ऊतक होना दिखाया गया है कि प्रमुख ब्याज की है में भेद करने के लिए अनुमति देता हैGIT और colonic पारगमन के vivo विश्लेषण में पता लगाने और आंतों की गतिशीलता गड़बड़ी की मात्रा सोने के मानक के रूप में विकसित किया गया है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस काम ड्यूश (KA1270/3-1/2) Forschungsgemeinschaft और BONFOR (का. 112.0040) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethilon 5/0 Ethicon 1666H
Cotton applicators MaiMed 71010
arterial catheter Vygon 115-798
96 well plate (black) Greiner Bio One 655096
glass ball (2 mm diameter) Worf available on request
Insect pins Fine Science Tools 26000-25
Hanker Yates Reagent Polyscience 560694
Aquatek Merck HC109850
DMEM Lonza BE12-604 F
FITC-dextran (MW 70000) Sigma Aldrich 46945-500MG-F

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References

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