PDZ निर्भर CFTR macromolecular संकेतन परिसर की इन विट्रो विश्लेषण में

Biology

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Summary

सिस्टिक फाइब्रोसिस transmembrane प्रवाहकत्त्व नियामक (CFTR), एक उपकला क्लोराइड चैनल, विभिन्न प्रोटीन के साथ बातचीत और महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रियाओं को विनियमित करने के लिए सूचित किया गया है, उन के बीच में CFTR PDZ आकृति की मध्यस्थता बातचीत अच्छी तरह से प्रलेखित किया गया है. इस प्रोटोकॉल हम CFTR PDZ पर निर्भर जटिल संकेत macromolecular इकट्ठा विकसित तरीकों का वर्णन

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Wu, Y., Wang, S., Li, C. In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes. J. Vis. Exp. (66), e4091, doi:10.3791/4091 (2012).

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Abstract

Protocol

1. और पुनः संयोजक टैग की गईं जीवाणु में फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति और शोधन

  1. में CFTR, दीर्घावधि औसत, 2 MRP2, MRP4, β 2 ए.आर., और NHERFs (पूर्ण लंबाई या PDZ1 या PDZ2 डोमेन के लिए परिभाषित सी पूंछ (पिछले 50-100 अमीनो एसिड युक्त सी टर्मिनस PDZ रूपांकनों) के क्षेत्रों बढ़ाना ) पीसीआर दृष्टिकोण के द्वारा.
  2. PGEX4T-1 जीएसटी संलयन प्रोटीन के लिए वेक्टर (जैसे जीएसटी - NHERFs का, जीएसटी - MRP4 सीटी के रूप में), pMAL-C2 MBP-संलयन प्रोटीन के लिए वेक्टर (जैसे MBP β 2 ए.आर. सीटी, सीटी MBP-CFTR के रूप में पीसीआर उत्पादों में क्लोन ), और pET30 उनकी एस संलयन प्रोटीन (जैसे कि उनकी एस CFTR सीटी, उनकी एस PDZK1) के लिए.
  3. एक protease की कमी ई. में रूपांतरण कोली (BL21 - DE3) के तनाव संभव पुनः संयोजक प्रोटीन गिरावट को कम करने.
  4. संस्कृति रातोंरात Luria - Bertani (7.0 पीएच) मध्यम जिसमें उचित एंटीबायोटिक दवाओं (जैसे एम्पीसिलीन या kanamycin के रूप में) में 37 डिग्री सेल्सियस से बढ़ने की. 1:10 पर रातोंरात संस्कृति पतला और 37 में एक और 2 घंटे के लिए बढ़ने की डिग्री सेल्सियस में0.5-1 मीटर एम 30 डिग्री सेल्सियस पर अगले 4 घंटे के लिए IPTG साथ घटाने गोली ८,००० पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं × जी 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस
  5. Sucrose बफर में के कोशिकाओं Lyse (50 मीटर Tris - एचसीएल, पीएच 8.0, 1 मीटर एम EDTA, 1 मीटर एम PMSF, और 10% sucrose के एम) (1 मिलीग्राम / एमएल) lysozyme, 0.2% एक्स 100 ट्राइटन, और protease युक्त inhibitors के. सेल गोली संस्कृति का 1 एल से उद्भव के लिए 20 एमएल का प्रयोग करें.
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक रोटरी प्रकार के बरतन पर मिश्रण
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 20,000 × पर स्पिन स्पष्ट सतह पर तैरनेवाला लीजिए.
  8. स्पष्ट सतह पर तैरनेवाला में, निम्नलिखित राल / agarose मनकों (Sucrose बफर में 50% घोल) के 1 एमएल जोड़ने के लिए:
    • जीएसटी संलयन प्रोटीन के लिए glutathione agarose मनकों.
    • उनका संलयन प्रोटीन के लिए कूपन मोती.
    • Amylose MBP संलयन प्रोटीन के लिए राल.
  9. मिक्स 4 घंटे के लिए 4 ° सी एक रोटरी प्रकार के बरतन पर.
  10. 1x पीबीएस (15 एमएल) resuspending मोती धो, 2 मील के लिए मिश्रणn, 800 पर कताई × 2 मिनट, और सतह पर तैरनेवाला discarding के लिए जी. छह बार के लिए इस चरण को दोहराएँ.
  11. मनकों से संबंधित क्षालन बफर (2 मोती के 1 एमएल प्रति एमएल क्षालन बफर) का उपयोग करके के प्रोटीन Elute.
    • जीएसटी संलयन प्रोटीन के लिए क्षालन बफर: 25 मीटर Tris - एचसीएल एम (8.0 पीएच), 140 मीटर एम NaCl, और 20 मीटर एम glutathione के कम.
    • उनका संलयन प्रोटीन के लिए क्षालन बफर: 20 मीटर एम Tris - एचसीएल (8.0 पीएच), 500 मीटर एम NaCl, और 200 मीटर एम imidazole.
    • MBP संलयन प्रोटीन के लिए क्षालन बफर: 20 मीटर एम Tris - एचसीएल (8.0 पीएच), 200 मीटर एम NaCl, 1 मीटर एम EDTA, 1 मीटर एम डीटीटी, और 10 मीटर एम maltose.
  12. 4 1x पीबीएस के 2 एल के खिलाफ eluted प्रोटीन Dialyze डिग्री सेल्सियस (संभव प्रोटीन गिरावट से बचने के लिए). पीबीएस चार बार के लिए हर 4 घंटे बदलें. -80 में छोटे aliquots के रूप में एक Centricon (10,000 मेगावाट cutoff, Millipore) के फिल्टर और दुकान का उपयोग प्रोटीन ध्यान लगाओ डिग्री सेल्सियस
  13. डेटएमिन ब्रैडफोर्ड विधि से प्रोटीन एकाग्रता. एसडीएस पृष्ठ मानकों के रूप में बीएसए का उपयोग करके प्रोटीन की गुणवत्ता का आकलन करें. यदि प्रोटीन की अखंडता को संतोषजनक नहीं है, जैसे जेल निस्पंदन या आयन एक्सचेंज माध्यमिक शुद्धीकरण प्रक्रियाओं इस्तेमाल किया जा सकता है. (उदाहरण के लिए, हम आगे जीएसटी संलयन प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए जी 75 Sepharose स्तंभ का इस्तेमाल किया है).

2. सेल संस्कृति और सेल lysate तैयार

  1. संस्कृति बच्चा हम्सटर गुर्दे की कोशिकाओं (मकान) कि स्थिरतापूर्वक से अधिक व्यक्त CFTR wt और CFTR के his10 या मकान कोशिकाओं है कि transiently चिह्नित करें - दीर्घावधि औसत 2 - wt या चिह्नित करें - दीर्घावधि औसत 2 - ΔSTL, और Madin - डार्बी कुत्ते गुर्दे (MDCK पर एक्सप्रेस ) कोशिकाओं कि स्थिरतापूर्वक से अधिक व्यक्त ईगल के न्यूनतम आवश्यक मध्यम में MRP2 (सदस्य) 5% सीओ 2 के साथ 10% भ्रूण बछड़ा सीरम और पेनिसिलिन / polystyrene बोतल में स्ट्रेप्टोमाइसिन 37 डिग्री सेल्सियस से युक्त.
  2. संस्कृति मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं 293 (HEK293) कि स्थिरतापूर्वक से अधिक व्यक्त CFTR wt और CFTR के his10 के Dulbecco में'एस संशोधित ईगल (DMEM) मध्यम 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और पेनिसिलिन / polystyrene बोतल में स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक.
  3. Lysis बफर में कोशिकाओं Lyse (पीबीएस 0.2% ट्राइटन-X-100 protease inhibitors के 1 मीटर एम phenylmethylsulphonyl फ्लोराइड, 1 μg / एमएल aprotinin, 1 μg / एमएल leupeptin है, 1 μg / एमएल pepstatin युक्त एक मिश्रण के साथ पूरक), का उपयोग करें प्रत्येक 60 मिमी पेट्री डिश, और प्रत्येक 100 मिमी पेट्री डिश के लिए 1000 μL lysis बफर के लिए 500 μL lysis बफर.
  4. रॉक सेल 4 डिग्री सेल्सियस, और 15 मिनट के लिए 4 पर 16,000 पर centrifugation द्वारा अघुलनशील सामग्री × हटाने डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए lysates ब्रैडफोर्ड परख प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करते हैं.

3. (CFTR के PDZK1 के - MRP4 macromolecular CFTR युक्त परिसर के इन विट्रो विधानसभा में)

  1. Lysis बफर के 200 μL (पीबीएस - 0.2% Triton एक्स 100 + protease inhibitors के) में, 20 μg शुद्ध के जीएसटी - MRP4 के सी टर्मिनल50 (CT50) संलयन प्रोटीन आ.
  2. शुद्ध उसकी एस PDZK1 संलयन प्रोटीन के विभिन्न मात्रा (0-40 μg) जोड़ें.
  3. 22 घंटे ° सी 1-2 के लिए एक रोटरी मिक्सर पर दो प्रोटीन मिश्रण.
  4. प्रोटीन मिश्रण में 20 μL glutathione के मोती (50% घोल) जोड़ें, और एक और 1 घंटे के लिए मिश्रण करने के लिए जारी है. यह कदम भी जोड़ी वार बंधन के रूप में संदर्भित किया जाता है.
  5. इस समय के दौरान, HEK293 सेल lysates तैयार है कि overexpress करें चिह्नित करें (wt) CFTR चरण 2 में ऊपर वर्णित के रूप में).
  6. Lysis बफर के साथ जटिल दो बार धो. प्रत्येक धोने के लिए 1 मिनट के लिए 800 × स्पिन और ध्यान से प्रत्येक धोने के बाद सतह पर तैरनेवाला महाप्राण (व्यंजन). सावधानी का प्रयोग करने के लिए नहीं चूसना बंद नीचे में मोती.
  7. मोतियों के लिए ऊपर तैयार HEK293 के सेल lysates जोड़ें, और धीरे डिग्री सेल्सियस 4 में 3 घंटे (या रातोंरात) के लिए मिश्रण.
  8. मोती lysis बफर के साथ बड़े पैमाने पर 3.6 चरण) में वर्णित के रूप में तीन बार धो लें.
  9. 30 μL नमूना बफर (5 ×) का उपयोग प्रोटीन Elute: 0.6 एम Tris - एचसीएल (6.8 पीएच), 50% ग्लिसरॉल, एसडीएस 2%, और 0.1% bromophenol नीले, जिसमें 5% β-mercaptoethanol.
  10. में 37 डिग्री सेल्सियस 5000 में 10-15 मिनट, और स्पिन के लिए पानी स्नान × 30 है के लिए मोती वेग को सेते हैं.
  11. 4-15% जेल पर सभी प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक लोड.
  12. एसडीएस पृष्ठ के बारे में 30-40 मिनट के लिए चलाएँ.
  13. PVDF झिल्ली प्रोटीन बैंड 1.5 घंटे के लिए स्थानांतरण.
  14. टीबीएस - बीच में 5% गैर वसा दूध युक्त झिल्ली ब्लॉक.
  15. 4 में प्राथमिक एंटीबॉडी (जैसे विरोधी CFTR आईजीजी, R1104 के रूप में) के साथ झिल्ली ° सी, रात भर सेते हैं.
  16. टीबीएस के बीच के साथ 5 मिनट के लिए, छह बार झिल्ली धो लें.
  17. माध्यमिक एंटीबॉडी (जैसे बकरी विरोधी माउस एचआरपी है संयुग्मित 2 एन डी एंटीबॉडी के रूप में) के साथ 22 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए झिल्ली सेते हैं
  18. टीबीएस के बीच के साथ 5 मिनट के लिए, छह बार झिल्ली धो लें.
  19. ईसीएल के माध्यम से प्रोटीन बैंड कल्पना.
  20. प्रतिनिधि डेटा चित्र 1 में दिखाया जाता है.
jove_title "> 4 प्रतिनिधि.

CFTR युक्त macromolecular संकेत जटिल है कि इन विट्रो में इकट्ठा किया गया था का एक उदाहरण चित्र 1 में दिखाया गया है. एक macromolecular परिसर MRP4 सी टर्मिनल 50 अमीनो एसिड (MRP4 CT50), PDZK1, और पूर्ण लंबाई CFTR (चित्रा 1, नीचे) के बीच में बनाई गई थी. मध्यस्थ प्रोटीन, PDZK1 (चित्रा 1, नीचे) 18 की बढ़ती मात्रा के साथ एक जटिल गठन खुराक dependently वृद्धि हुई है.

चित्रा 1
चित्रा 1. Macromolecular जटिल परख का एक सचित्र प्रतिनिधित्व (ऊपर). एक macromolecular परिसर में इन विट्रो में एक खुराक पर निर्भर (नीचे) तरीके से 18 में तीन प्रोटीनों (जीएसटी-MRP4 - CT50, उनकी एस PDZK1, और फ्लैग - CFTRwt) के साथ पाया गया.

2 ए.आर. (14 Ref.) 2 CFTR के NHERF2 के दीर्घावधि औसत (Ref. 15) CFTR - PDZ 2 प्रोटीन एमआरपी (Ref. 17) CFTR के PDZK1 के MRP4 (16 Ref.)
आत्मीयता मोती Amylose राल एस - प्रोटीन agarose Amylose राल Glutathione agarose
प्रोटीन -1 शुद्ध MBP-β 2 ए.आर. सीटी उसकी एस CFTR सीटी MBP-CFTR सीटी जीएसटी के MRP4 सीटी
प्रोटीन 2 शुद्ध जीएसटी के NHERF1 जीएसटी के NHERF2 जीएसटी के PDZ प्रोटीन उनकी एस PDZK1
प्रोटीन-3 शुद्ध (या सेल lysates) CFTR wt या CFTR his10 (BHK या HEK सेल lysates) झंडादीर्घावधि औसत दो wt या चिह्नित करें - दीर्घावधि औसत 2 ΔSTL (BHK सेल lysates) MRP2 (MDCK सेल lysates) चिह्नित करें - CFTR wt या CFTR - his10 (या सेल lysates) शुद्ध
प्रतिरक्षी विरोधी CFTR आईजीजी विरोधी चिह्नित करें एचआरपी विरोधी MRP2 आईजीजी विरोधी चिह्नित करें एचआरपी

टेबल विभिन्न CFTR युक्त macromolecular परिसर इन विट्रो में इकट्ठे हो 1. का सारांश.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में हम में इन विट्रो कोडांतरण और एक macromolecular संकेत जटिल शुद्ध प्रोटीन (या प्रोटीन टुकड़े) और / या सेल lysates का उपयोग युक्त CFTR का पता लगाने के लिए एक विधि का प्रदर्शन के रूप में 16-19,29,30 पहले की रिपोर्ट है. सबसे अच्छा परिणाम तैयार करने की प्रक्रिया के दौरान निम्न महत्वपूर्ण बिंदुओं को प्राप्त करने के विशेष ध्यान की आवश्यकता होती है:

  • यह महत्वपूर्ण है कि प्रोद्धावन बफर के पीएच कम glutathione जब जीएसटी - संलयन प्रोटीन शुद्ध चरण 1) में वर्णित के रूप में जोड़ने के बाद 8.0 करने के लिए समायोजित किया जा. के रूप में 3.0 के रूप में कम पीएच कम glutathione के अलावा के बाद हो सकता है. यदि पीएच क्षालन पहले नहीं निकाला जाता है, क्षालन की क्षमता काफी कम है.
  • जब प्रोटीन मोतियों से eluted है, वे सही दूर dialyzed करने की आवश्यकता है, अन्यथा, शुद्ध प्रोटीन समाधान के बाहर आ सकता है. यदि प्रोटीन डायलिसिस सही क्षालन प्रक्रिया के बाद संभव नहीं है, प्रोटीन नहीं elute और वें के साथ उन्हें छोड़ देंई agarose / मोती.
  • यह मजबूती के लिए CFTR युक्त macromolecular जटिल नमूने पश्चिमी सोख्ता CFTR एकत्रीकरण के रूप में एक आम समस्या के लिए तैयार नहीं फोड़ा करने के लिए सिफारिश की है. इसके बजाय, नमूने के लिए 10-15 मिनट के लिए 37 ° C पर गर्म किया जाना चाहिए से पहले जेल में भरा हुआ है.
  • कम आत्मीयता के साथ बातचीत के प्रोटीन परिसर के लिए, immunoblot देखे जा SuperSignal पश्चिम (या पिको) अधिकतम संवेदनशीलता सब्सट्रेट Femto (पियर्स) का उपयोग करने के लिए संकेत वृद्धि कर सकते हैं.

यहां का प्रदर्शन तकनीक एक सुविधाजनक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य को biochemically CFTR युक्त तृतीयक प्रोटीन जटिल परिभाषित परख प्रदान करता है. इन विट्रो CFTR macromolecular परिसरों में इकट्ठा टेबल-1 में उल्लिखित के रूप में वहाँ कई तरीके हैं.

  • आदेश में सम्मोहक परिणाम प्राप्त करने के लिए, दोनों तरीकों से, यानी, मैं) में जटिल इकट्ठा करने की कोशिश करनी चाहिए CFTR PDZ पाड़ प्रोटीन (ओं) को तीसरे प्रोटीन, ii) तीसरे प्रोटीन PDZ पाड़ प्रोटीन (- CFTR).
  • CFTR के his10, क्रम में प्रदर्शित करने के लिए macromolecular जटिल गठन की आकृति निर्भरता PDZ (CFTR his10 10 सी टर्मिनल पूंछ में उनके अवशेष शामिल हैं, इस प्रोटीन के एक आंतरिक PDZ आकृति है और 29 NHERFs के बाइंड नहीं कर सकते हैं), उनके साथ प्रोटीन PDZ रूपांकनों उत्परिवर्तित या नष्ट कर दिया (2 AR-L413A β, 2 ΔSTL दीर्घावधि औसत, आदि) macromolecular जटिल के रूप में अच्छी तरह से परख में समानांतर में इस्तेमाल किया जा सकता है.
  • कोशिकाओं के पूरे lysates भी है कि कई अन्य घटक होते हैं का उपयोग करने के बजाय, एक कदम दर 3.7 शुद्ध प्रोटीन के (तीसरी प्रोटीन के रूप में) का उपयोग करें) (जैसे MRP4 - PDZK1-CFTR की विधानसभा में कर सकते हैं, हम भी शुद्ध इस्तेमाल किया झंडा CFTR, रेफरी 18). यह केवल प्रोटीन त्रिकोणीय जटिल सम्मोहक परिणाम प्रदान करता है, के रूप में वहाँ केवल 3 शुद्ध पूरे विधानसभा प्रणाली में निहित प्रोटीन हैं.

हालांकि, CFTR macromolecular परिसर की पहचान इन विट्रो में purifi का उपयोगएड (या प्रोटीन टुकड़े) या प्रोटीन कोशिकाओं से lysates कि overexpress CFTR या बातचीत प्रोटीन से संकेत मिलता है कि macromolecular संकेत जटिल कि endogenously व्यक्त इन बातचीत प्रोटीन कोशिकाओं में मौजूद है. इस मुद्दे के समाधान के लिए, सह immunoprecipitation airway के उपकला कोशिकाओं के रूप में कोशिकाओं 16 में अंतर्जात CFTR परिसरों का आकलन और उपकला कोशिकाओं 17,18 आंत करने के लिए किया जा सकता है. इसके अलावा, मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण और 2 - आयामी जेल वैद्युतकणसंचलन 29 CFTR के लिए अज्ञात बाध्यकारी भागीदारों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है. हालांकि, इन तकनीकों का प्रदर्शन यह इस प्रोटोकॉल के दायरे से परे है.

इसके अलावा, vivo में प्रोटीन बातचीत के subcellular स्थानीयकरण भी आणविक मुलाकातों को प्रभावित कर सकता है. उदाहरण के लिए, MRP4 शिखर और basolateral दोनों झिल्ली में व्यक्त हो सकता है, जबकि CFTR मुख्य रूप से शिखर झिल्ली के लिए स्थानीय है दिखाया गया है, हालांकि वे डे कर दिया गया हैएक दूसरे के साथ शारीरिक और कार्यात्मक PDZ पाड़ प्रोटीन PDZK1 18 के माध्यम से बातचीत monstrated. इसके अलावा, पुनः संयोजक प्रोटीन की overexpression, के रूप में वर्तमान प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है, उनके subcellular स्थानीयकरण प्रभावित है और इस तरह बातचीत है कि अन्यथा घटित नहीं होगा सक्षम हो सकता है. ये संभावना भी ध्यान में रखा जाना चाहिए जब डेटा की व्याख्या और extrapolating के निष्कर्ष.

हालांकि वर्तमान प्रोटोकॉल प्रक्रिया पर ध्यान केंद्रित PDZ पर निर्भर CFTR युक्त macromolecular परिसरों को इकट्ठा करने के लिए, इस प्रोटोकॉल भी गैर CFTR शामिल बहु प्रोटीन जटिल (या तो PDZ - निर्भर या स्वतंत्र) कोडांतरण में संभावित आवेदन किया है. हाल ही में इस macromolecular विधानसभा परख का उपयोग करते हुए, हम दिखा दिया है कि एक chemokine रिसेप्टर CXCR2 के शारीरिक रूप से neutrophils में अपने बहाव effector PLCβ 2 NHERF1 के माध्यम से मध्यस्थता के साथ एक प्रोटीन जटिल रूपों, और कार्यात्मक इस CXCR2 macromolecular जटिल हैजटिल (बहिर्जात CXCR2 पेप्टाइड का उपयोग कर के माध्यम से) काफी तनु न्युट्रोफिल कार्य 31 में बाधा पहुँचा के रूप में प्रासंगिकता.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हमारा काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (ग्रेटर दक्षिण पूर्व संबद्ध) शुरुआत अनुदान सहायता 0765185B, Elsa Pardee अमेरिकी फाउंडेशन के अनुसंधान अनुदान, और वेन राज्य विश्वविद्यालय अंदर स्टार्टअप निधि और हृदय अनुसंधान संस्थान Isis पहल पुरस्कार से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया है. इन विट्रो CFTR macromolecular जटिल विधानसभा में यह विधि मूल रूप से डा. एपी नरेन (टेनेसी स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र के विश्वविद्यालय) द्वारा बीड़ा उठाया है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pGEX4T-1 vector GE Healthcare 28-9545-49 formerly Amersham Biosciences
pMAL-C2 vector New England BioLabs
pET30 vector EMD Chemicals 69077-3 formerly Novagen
Glutathione agarose beads BD Biosciences 554780
Amylose resin New England BioLabs E8021S
Talon beads Clontech 635501
reduced glutathione BD Biosciences 554782
imidazole Fisher BP305-50
maltose Fisher BP684-500
S-protein agarose EMD Chemicals 69704-3 formerly Novagen
Anti-Flag HRP Sigma A8592
Anti-CFTR IgG Custom-made R1104 mAb recognizing CFTR epitope at a.a. 722-734
Anti-MRP2 IgG Chemicon International MAB4148 Now a part of Millipore

Table 2. Specific reagents and equipment.

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References

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